用于调节因子IX功能的组合物和方法与流程

本发明涉及医学和血液学领域。更具体地，本发明提供了新的因子ix变体和使用其来调节有需要的患者的凝血级联的方法。

背景技术：

在整个说明书中引用了若干出版物和专利文献，以描述本发明所属领域的现有技术。这些引用中的每一个都通过引用并入本文，如同完整阐述一样。

响应于血管损伤(例如切割)，凝结酶以逐步的方式被激活，最终导致在损伤部位形成血凝块。在该级联的最后步骤中由其无活性前体凝血酶原产生凝血酶，随后产生纤维凝块。活化的因子ix(fixa)是此系统的关键组分，因为它是内在xase复合物(intrinsicxasecomplex)的丝氨酸蛋白酶，该复合物还包括辅助因子活化的因子viii(fviiia)。该酶在具有暴露的阴离子膜的细胞上组装，迅速将因子x转化为活化的因子x(fxa)。fxa及其辅助因子，活化的因子v(fva)，形成凝血酶原酶(prothrombinase)，即活化凝血酶的酶复合物。

因子ix的重要性通过在携带因子ix基因突变的个体中出血性病症血友病b的出现来反映。在诸如血友病b的出血性病症中，因子ix的缺陷或缺乏导致fxa产生不足，并且因此导致凝血酶形成不足。替代缺失的蛋白质是血友病治疗的主要方法。尽管有效，但目前的蛋白质替代疗法存在一些局限性。例如，目前的疗法受到所施用蛋白质的短半衰期的影响，因此需要高剂量的多次静脉内注射。因此，显然需要具有改善的生物学特性的凝血因子。

技术实现要素：

根据本发明，提供了用于在有此需要的患者中调节止血的组合物和方法。更具体地，提供了调节(例如，增加)止血的因子ix/因子ixa变体。在一个具体实施方案中，所述变体包含下列的至少一个取代：在位置410处的glu；在位置223处的val；在位置342处的phe；在位置343处的thr；和/或在位置406处的asn。在一个具体实施方案中，所述变体包含下列的至少一个取代：在位置410处的glu；在位置223处的val；和/或在位置406处的asn。在一个具体实施方案中，所述因子ix/因子ixa变体还包含在位置338处的arg的取代，具体地，是用leu取代位置338处的arg。还公开了编码本发明的变体的核酸及其使用方法。此类核酸分子可任选地编码细胞内切割位点(例如，pace/弗林蛋白酶(pace/furin))。本发明的另一方面包括表达本发明变体的宿主细胞。还公开了分离和纯化变体的方法。

还提供了在载体中包含本发明变体的药物组合物。本发明还包括用于治疗有此需要的患者的止血相关病症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的所述变体或编码该变体的核酸分子。这些方法有效治疗需要促凝血剂(例如，以减少或抑制出血)的病症，并且所述病症包括但不限于血友病，具体地，血友病b。

附图说明

图1a提供了人前原因子ix(pre-pro-factorix)的氨基酸序列(seqidno：1)。基于因子ix编号，下划线和粗体残基是位置223、338、342、343、406和410处(参见图1b)。图1b提供了因子ix的轻链(seqidno：2)和重链(seqidno：3)的氨基酸序列。图1c提供了活化因子ix(fixa)的轻链(seqidno：2)和重链(seqidno：4)的氨基酸序列。图1d提供了编码人因子ix前原蛋白(preproprotein)的核酸序列(seqidno：5)。

图2提供了在施用编码fixr338l+e410k(n＝7)或野生型fix(n＝2)的载体aav8后血友病小鼠中fix的比活性的图。值显示为平均值±sem。

具体实施方式

本文提供了新的因子ix变体(酶原(zymogen))。具体地，提供了因子ix变体，其包含下列突变：位置410处的glu、位置223处的val、位置342处的phe、位置343处的thr和/或位置406处的asn。在一个具体实施方案中，所述因子ix变体包含下列至少一个取代：位置410处的glu；位置223处的val；和/或位置406处的asn。所述因子ix变体可以进一步包含位置338处的arg的突变(例如，r338l)。与野生型因子ix相比，本发明的因子ix变体具有更高的比活性。

血液凝固反应是一种防御机制，其进化以保护生物免于受伤后的显著血液损失。如上文简要解释的，凝血通过一系列蛋白水解反应进行，每个蛋白水解反应将血液中的惰性酶原(无活性)转化为丝氨酸蛋白酶(活性)产物。凝血酶，是凝血级联的最终丝氨酸蛋白酶产物，它活化血小板并切割结构蛋白(纤维蛋白原)以产生纤维蛋白，从而提供物理上防止血液离开血管的网状物。偏离该过程导致出血的病理状态。在因子ix的缺陷或缺乏的情况下尤其如此。这种因子ix活性的缺乏导致遗传性出血性病症血友病b。以静脉输送血浆衍生的或重组因子ix的蛋白质替代疗法是血友病b患者的标准治疗。虽然这种疗法是有效的，但这种疗法需要经常(例如，每周2-3次)静脉内施用大量因子ix。本发明提供了因子ix变体，其与野生型fix相比具有增加的活性，从而允许更快的反应(例如，用于施用以治疗出血事件)和/或减少需要施用的蛋白质的量(例如，减少蛋白质替代疗法的剂量要求)。

因子ix在血浆中作为无活性的酶原(57kda)以约90nm的浓度循环。因子ix最初在肝脏中合成，含有约40个氨基酸的前原前导序列，该序列在分泌蛋白质时被除去。在血管损伤后，因子ix在通过因子viia/组织因子(tf)复合物或因子xia切割两个键并释放35个残基的活化肽后被活化为fixa。因子ix的活化遵循已经很好地描述了的机制。在高度保守的位点(r¹⁵-vⁱ⁶vgg，在胰凝乳蛋白酶编号系统中)的键的切割揭示了重链的新n-末端(v¹⁶v¹⁷gg)。切割后，中间体处于“类似酶原的状态”，其在新产生的n-末端插入活化口袋并与asp¹⁹⁴形成盐桥后迅速平衡至蛋白酶状态。这种相互作用是酶原转化为活性酶的决定性特征。酶原状态和蛋白酶状态处于一个平衡中，该平衡可以依赖多种配体或辅助因子而变换。通过与循环的丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpins)的反应迅速消除游离fixa，最显著的是抗凝血酶iii(atiii)。

本发明包括变体因子ix分子，其包括fixa变体、因子ix变体、因子ix前原肽变体和因子ix前肽变体。为了简单，所述变体通常在整个申请中在fix的背景下进行描述。然而，本发明考虑并包括具有相同氨基酸取代的因子ixa、因子ix前原肽和因子ix前肽分子。

本发明的fix变体可以来自任意哺乳动物物种。在一个具体实施方案中，所述fix变体来自人。基因id：2158和基因库(genbank)登录号nm_000133.3和np_000124.1提供了野生型人因子ix前原蛋白的氨基酸和核苷酸序列的实例。图1a提供了seqidno：1，其是人因子ix前原蛋白的氨基酸序列的实例。所述因子ix前原肽包含来自氨基酸1-28的信号肽和来自氨基酸29-46的前肽序列。切割前肽产生具有tyr-asn-ser的新末端序列的蛋白质。因子ix也被fviia/tf复合物或fxia在精氨酰-丙氨酸肽键处切割成成熟的双链形式(轻和重)以产生因子ix酶原。这两条链通过二硫键连接。图1b提供了seqidno：2和3，它们分别是人因子ix轻链和重链的氨基酸序列的实例。因子ix通过fviia/tf复合物或fxia在精氨酰-缬氨酸肽键处切割35个氨基酸活化肽来活化，以产生野生型fixa重链(seqidno：4)的新氨基末端序列vvgg(seqidno：6)。图1c提供了seqidno：2和4，它们是人fixa轻链和重链的氨基酸序列的实例。值得注意的是，上述蛋白水解切割事件可能是不精确的，从而导致在切割位点添加或缺失氨基酸(例如，1、2、3或更多个氨基酸)。图1d提供了编码人因子ix前原蛋白的核酸序列(seqidno：5)。编码因子ix和fixa的核酸分子可以从提供的氨基酸和核苷酸序列容易地确定。

在一个具体实施方案中，本发明的变体与seqidno：1具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性，具体地，至少90％、95％、97％或99％的同一性。在一个具体实施方案中，本发明的变体与seqidno：1的氨基酸29-461具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性，具体地，至少90％、95％、97％或99％的同一性。在一个具体实施方案中，本发明的变体与seqidno：1的氨基酸47-461具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性，具体地，至少90％、95％、97％或99％的同一性。在一个具体实施方案中，所述变体包含轻链和重链，其中轻链与seqidno：2具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性，具体地，至少90％、95％、97％或99％的同一性，并且其中重链与seqidno：3具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性，具体地，至少90％、95％、97％或99％的同一性。在一个具体实施方案中，所述变体包含轻链和重链，其中轻链与seqidno：2具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性，具体地，至少90％、95％、97％或99％的同一性，并且其中重链与seqidno：4具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性，具体地，至少90％，95％，97％或99％的同一性。上述同一性百分比不包括本发明的取代(例如，位置223、338、342、343、406和/或410处的取代)。

本发明的变体也可以是翻译后修饰的(γ-羧化)。所述变体可以在细胞中或体外进行翻译后修饰。本发明的变体也可以是peg化的(pegylated)或糖peg化的(glycopegylated)(参见，例如，nonacogbetapegol；collins等人(2014)blood124:3880-3886)。例如，可以将聚乙二醇(peg)(例如，40kdapeg)与所述变体连接(例如，在活化肽内)。在一个具体实施方案中，本发明的变体可以与白蛋白融合(参见，例如，santagostino等人(2016)blood127:1761-1769；metzner等人(2009)thromb,haemost.,102:634-44；nolte等人(2012)j.thromb.haemost.,10:1591-9；herzog等人(2014)thromb.res.,133:900-7；schulte(2009)thromb.res.,124:s6-s8)。例如，可以将所述变体通过可切割的接头(例如，基于活化肽的接头)与白蛋白连接。在一个具体实施方案中，将本发明的变体与fc区(例如igg1的fc结构域；二聚体或单体)连接(参见例如，eftrenonacogalfapowell等人(2013)n.engl.j.med.,369:2313-2323；peters等人(2010)blood115:2057-64；shapiro等人(2012)blood119:666-72)。例如，可以将变体通过接头(可切割的或不可切割的)与fc结构域(例如，铰链和ch2和ch3结构域(例如，来自igg1))连接。

本发明的fix变体可包含位置223、342、343、406和/或410处的至少一个取代。在一个具体实施方案中，本发明的fix变体可包含位置223、406和/或410处的至少一个取代。

在一个具体实施方案中，位置410处的谷氨酸被非酸性氨基酸(例如非asp)取代。在一个具体实施方案中，位置410处的谷氨酸被碱性氨基酸(例如arg、his或lys)或极性氨基酸(例如ser、thr或tyr)取代。在一个具体实施方案中，位置410处的谷氨酸被赖氨酸、酪氨酸、精氨酸或组氨酸取代。在一个具体实施方案中，位置410处的谷氨酸被赖氨酸或酪氨酸取代。在一个具体实施方案中，位置410处的谷氨酸被赖氨酸取代。

在一个具体实施方案中，位置406处的天冬酰胺被碱性氨基酸(例如arg、his或lys)取代。在一个具体实施方案中，位置406处的天冬酰胺被精氨酸、赖氨酸或谷氨酰胺取代。在一个具体实施方案中，位置406处的天冬酰胺被精氨酸或赖氨酸取代。在一个具体实施方案中，位置406处的天冬酰胺被精氨酸取代。

在一个具体实施方案中，位置223处的缬氨酸被碱性氨基酸(例如arg、his或lys)、酸性氨基酸(例如asp或glu)或极性氨基酸(例如ser、thr、tyr、asn或gln)取代。在一个具体实施方案中，位置223处的缬氨酸被极性氨基酸取代。在一个具体实施方案中，位置223处的缬氨酸被酪氨酸取代。

在一个具体实施方案中，位置342处的苯丙氨酸被碱性氨基酸(例如arg、his或lys)、酸性氨基酸(例如asp或glu)或极性氨基酸(例如ser、thr、tyr、asn或gln)取代。在一个具体实施方案中，位置342处的苯丙氨酸被碱性氨基酸取代。在一个具体实施方案中，位置342处的苯丙氨酸被组氨酸取代。

在一个具体实施方案中，位置343处的苏氨酸被碱性氨基酸(例如arg、his或lys)、酸性氨基酸(例如asp或glu)疏水性氨基酸(例如ala、ile、leu、met、phe、val、pro或gly)或极性氨基酸(例如ser、thr、tyr、asn、或gln)取代。在一个具体实施方案中，位置343处的苏氨酸被碱性氨基酸取代。在一个具体实施方案中，位置343处的苏氨酸被甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺或甘氨酸取代。在一个具体实施方案中，位置343处的苏氨酸被甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸或谷氨酰胺取代。在一个具体实施方案中，位置343处的苏氨酸被甲硫氨酸、赖氨酸或精氨酸取代。在一个具体实施方案中，位置343处的苏氨酸被甲硫氨酸或赖氨酸取代。在一个具体实施方案中，位置343处的苏氨酸被甲硫氨酸取代。

本发明的变体可以包括位置223、342、343、406和/或410处的上述取代中的至少一个。本发明的变体可以进一步包含至少一种其他取代。在一个具体实施方案中，该变体还包含在位置338处的精氨酸的取代。在一个具体实施方案中，位置338处的精氨酸被非碱性氨基酸(例如，非his或非lys)取代。在一个具体实施方案中，位置338处的精氨酸被非极性氨基酸(例如gly、ala、leu、val、ile或met)取代。在一个具体实施方案中，位置338处的精氨酸被亮氨酸取代。

编码上述变体的核酸分子也包括在本发明中。编码所述变体的核酸分子可通过本领域已知的任意方法制备。所述核酸分子可以保持在任意方便的载体，具体地，表达载体中。

包含至少一种变体多肽和至少一种载体的组合物也包括在本发明中。包含至少一种变体核酸分子和至少一种载体的组合物也包括在本发明中。除非任何常规载体与待施用的变体均不相容，否则考虑其在药物组合物中的用途。在一个具体实施方案中，所述载体是用于静脉内施用的药学上可接受的载体。

定义

上文和整个说明书以及权利要求书中使用了与本发明的生物分子有关的多种术语。

短语“止血相关病症”是指出血性病症，例如但不限于血友病a、血友病b、具有抑制性抗体、缺乏至少一种凝血因子(例如，因子vii、ix、x、xi、v、xii、ii和/或vonwillebrand因子；具体地，因子ix)、联合fv/fviii缺乏、维生素k环氧化物还原酶c1缺乏、γ-羧化酶缺乏的血友病a和b患者；与创伤、损伤、血栓形成、血小板减少、中风、凝血病(低凝固性)、弥散性血管内凝血(dic)相关的出血；与肝素、低分子量肝素、五糖、华法林(warfarin)、小分子抗血栓药物(即fxa抑制剂)相关的过度抗凝；以及血小板病症，如bernardsoulier综合征、glanzman血栓形成(glanzmanthromblastemia)和储存池缺乏(storagepooldeficiency)。在一个具体实施方案中，所述止血相关病症是血友病b。

关于本发明的核酸，有时使用术语“分离的核酸”。该术语，当应用于dna时，是指从与其起源的生物体的天然存在的基因组中紧接连续(在5'和3'方向上)的序列中分离的dna分子。例如，“分离的核酸”可包含插入载体(例如质粒或病毒载体)中的，或整合到原核生物或真核生物的dna中的dna或cdna分子。关于本发明的rna分子，术语“分离的核酸”主要是指由如上定义的分离的dna分子编码的rna分子。或者，该术语可以指从与其天然状态(即，在细胞或组织中)相关联的rna分子中充分分离的rna分子，使得其以“基本上纯的”形式存在。

关于蛋白质，本文有时使用术语“分离的蛋白质”。该术语可以指通过表达本发明的分离的核酸分子产生的蛋白质。或者，该术语可以指与其天然相关联的其他蛋白质充分分离的蛋白质(例如，从而以“基本上纯的”形式存在)。

术语“载体”是指核酸序列可以插入其中的载体核酸分子(例如rna或dna)，例如，用于引入可以表达和/或复制该核酸序列的宿主细胞。“表达载体”是含有基因或核酸序列的特化载体，所述基因或核酸序列具有在宿主细胞中表达所需的必需调节区。

术语“可操作地连接”是指将编码序列表达所必需的调节序列置于dna分子中相对于编码序列的适当位置，以实现编码序列的表达。这种相同的定义有时适用于表达载体中编码序列和转录控制元件(例如启动子、增强子和终止元件)的排列。该定义有时也适用于第一和第二核酸分子的核酸序列的排列，其中产生杂合核酸分子。

本文有时使用术语“分离的蛋白质”或“分离和纯化的蛋白质”。该术语主要指通过本发明的分离的核酸分子的表达产生的蛋白质。或者，该术语可以指与其天然相关的其他蛋白质充分分离，使得以“基本上纯的”形式存在的蛋白质。“分离的”并不意味着排除与其他化合物或材料的人工或合成混合物，或排除不干扰基本活性的杂质的存在(并且杂质是可能存在的，例如，由于不完全的纯化)，或排除添加稳定剂。

术语“基本上纯的”是指制剂包含至少50-60重量％的目标化合物(例如，核酸、寡核苷酸、蛋白质等)，具体地，至少75重量％，或至少90-99重量％或更多的目标化合物。纯度可以通过适合于目标化合物的方法(例如色谱法、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、hplc分析等)测量。

“药学上可接受的”表示由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出用于动物的，并且更具体地，用于人类的。

“载体”是指，例如，稀释剂、佐剂、防腐剂(例如，硫柳汞、苯甲醇)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、增溶剂(例如聚山梨醇酯80)、乳化剂、缓冲剂(例如，trishcl、乙酸盐、磷酸盐)、抗菌剂、填充物质(例如，乳糖、甘露糖醇)、赋形剂、辅助剂或用于施用本发明活性剂的媒介物。药学上可接受的载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些。优选使用水或盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液作为载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物载体描述于e.w.martin的“remington'spharmaceuticalsciences”(mackpublishingco.，easton，pa)；gennaro，a.r.，remington：thescienceandpracticeofpharmacy，(lippincott，williamsandwilkins)；liberman等人，编辑，pharmaceuticaldosageforms，marceldecker，newyork，n.y.；和kibbe等人，编辑，handbookofpharmaceuticalexcipients，americanpharmaceuticalassociation，washington。

编码变体的核酸分子和多肽的制备

编码本发明变体的核酸分子可以通过使用重组dna技术方法制备。核苷酸序列信息的可用性使得能够通过多种手段制备本发明的分离的核酸分子。例如，可以使用本领域熟知的标准方案从合适的生物来源分离编码变体的核酸序列。

可以将本发明的核酸在任意方便的克隆载体中保持为rna或dna。在一个具体实施方案中，将克隆保持在质粒克隆/表达载体中，该载体在合适的大肠杆菌宿主细胞中繁殖。或者，可以将核酸保持在适于在哺乳动物细胞(例如，t细胞、造血细胞等)中表达的载体中。在翻译后修饰影响变体功能的情况下，优选在哺乳动物细胞中表达该分子。

在一个实施方案中，编码本发明变体的核酸可以通过插入细胞内蛋白水解切割位点进一步修饰(本发明还包括切割前后的所得多肽)。为了在哺乳动物细胞中表达fixa变体，可以在变体因子ix中的位置arg¹⁵和val¹⁶之间插入细胞内蛋白水解切割位点(例如，pace/弗林蛋白酶切割位点)。此类切割位点包括但不限于：arg-xaa-(arg/lys)-arg(seqidno：7)、arg-lys-arg、或arg-lys-arg-arg-lys-arg(seqidno：8)。这些切割位点被细胞内的蛋白酶(pace/弗林蛋白酶样酶)有效识别并被除去。这导致加工后的变体fixa，其中分子上的重链从位置16处开始。在该位置引入该切割位点将允许因子ix细胞内转化为fixa。在另一个实施方案中，可以去除部分或全部35个氨基酸活化肽，并且可以在其位置引入细胞内蛋白酶切割位点，这将在表达时产生fixa变体。

最终，这些类型的修饰允许从表达修饰过的变体因子ix的细胞中分泌变体因子ix的“活化”加工形式。裂解因子的分泌消除了在血液凝固期间或蛋白质分离后对蛋白水解切割的需要。

本发明的编码变体的核酸分子包括cdna、基因组dna、rna及其片段，其可以是单链或双链的。因此，本发明提供了具有能够与本发明的核酸分子的至少一个序列杂交的序列的寡核苷酸(dna或rna的正义链或反义链)。此类寡核苷酸可用作检测变体表达的探针。

根据已知方法，可以以多种方式制备本发明的变体。可以从合适的来源(例如，表达变体的转化的细菌或动物培养的细胞或组织)中纯化蛋白质，例如，通过免疫亲和纯化。编码变体的核酸分子的可用性使得能够使用本领域已知的体外表达方法产生变体。例如，可以将cdna或基因克隆到合适的体外转录载体中，例如用于体外转录的psp64或psp65，然后在合适的无细胞翻译系统(例如小麦胚芽或兔网织红细胞裂解液)中进行无细胞翻译。体外转录和翻译系统是可商购的。

或者，可以通过在合适的原核或真核表达系统中表达来产生更大量的变体。例如，可以将编码变体的dna分子的部分或全部插入适于在细菌细胞(例如大肠杆菌)或哺乳动物细胞(例如cho或hela细胞)中表达的质粒载体中。或者，可以产生包含变体的带标记的融合蛋白。这种变体标记的融合蛋白由部分或全部dna分子编码，所述dna分子在正确的密码子阅读框中与编码部分或全部所需多肽标签的核苷酸序列连接，所述多肽标签插入适于在细菌细胞中表达的质粒载体中，所述细菌细胞例如大肠杆菌或真核细胞，例如但不限于酵母和哺乳动物细胞(例如，t细胞、造血细胞等)。如上所述的载体包含在宿主细胞中表达dna所必需的调节元件，所述调节元件以允许dna在宿主细胞中表达的方式定位。此类表达所需的调节元件包括但不限于启动子序列、转录起始序列和增强子序列。

通过重组原核或真核系统中的基因表达产生的变体蛋白可以根据本领域已知的方法纯化。在一个具体实施方案中，可以使用市售的表达/分泌系统，由此表达重组蛋白，然后从宿主细胞分泌，以便从周围培养基中容易地纯化。如果不使用表达/分泌载体，另一种方法包括通过亲和分离纯化重组蛋白，例如通过使用与重组蛋白特异性结合的抗体来进行免疫相互作用，或通过镍柱来分离在它们的n-末端或c-末端带有6-8个组氨酸残基标签的重组蛋白。其他的标签可包含flag表位、gst或血凝素表位。这些方法通常由熟练的从业者使用。

通过上述方法制备的变体蛋白质可以根据标准程序分析。例如，根据已知方法，可以对这些蛋白质进行氨基酸序列分析。

如上所述，产生本发明的多肽的便利方式是通过在表达系统中使用核酸来表达编码它的核酸。用于本发明方法的各种表达系统是本领域技术人员熟知的。

因此，本发明还包括制备(如所公开的)多肽的方法，该方法包括从编码多肽的核酸(通常是核酸)表达。这可以在引起或允许产生多肽的适当条件下通过培养含有这种载体的宿主细胞来方便地实现。多肽也可以在体外系统中产生，例如在网织红细胞裂解液中。

变体蛋白质和编码变体的核酸的用途

根据本发明，可以使用编码具有改变的蛋白酶活性的多肽的变体核酸，例如，作为调节凝血级联的治疗剂和/或预防剂(蛋白质或核酸)。在本发明的一个具体实施方案中，变体多肽可以通过在生物相容的载体中注入，例如通过血管内或静脉内注射，向患者施用。本发明的变体可任选地包封在脂质体中或与其他磷脂或胶束混合以增加分子的稳定性。变体可以单独施用或与已知的调节止血的其他剂(例如因子viii、因子viiia或其衍生物)联合施用。其中递送变体多肽的合适组合物可以由医师在考虑各种生理变量时确定，包括但不限于患者的情况和血液动力学状态。适合于不同应用和施用途径的各种组合物是本领域熟知的并在本文中描述。

含有纯化变体的制剂含有生理学上可接受的基质，并且优选地配制成药物制剂。所述制剂可以使用本领域已知的方法配制。在一个具体实施方案中，所述变体可以与含有盐(例如nacl或cacl2)和/或氨基酸(例如甘氨酸和/或赖氨酸)并且ph范围为6至8的缓冲液混合。在需要之前，含有变体的纯化制剂可以以成品溶液的形式或以冻干或深度冷冻的形式储存。在一个具体实施方案中，所述制剂以冻干形式储存，并使用适当的重构溶液溶解在视觉上澄清的溶液中。或者，本发明的制剂也可以作为液体制剂或作为深度冷冻的液体获得。

含有因子ix变体的本发明制剂还可以与能够将因子ix变体活化成fixa的因子viia/tf复合物或fxia或其衍生物组合。在一个具体实施方案中，fixa变体可以以组合制剂的形式获得，该组合制剂包括容纳在基质上固定化的因子viia/tf复合物或fxia的容器(可能是以蛋白酶填充的微柱或注射器的形式)，以及包含带有因子ix变体的药物制剂的容器。为了活化因子ix变体，含有因子ix变体的溶液，例如，可以被压在固定化的蛋白酶上。在制剂的储存期间，含有因子ix变体的溶液优选地在空间上与蛋白酶分离。本发明的制剂可以与蛋白酶储存在相同的容器中，但是组分在空间上被不可渗透的隔板分开，该隔板在施用制剂之前可以容易地除去。所述溶液也可以储存在单独的容器中，并且仅在施用前不久彼此接触。

所述因子ix变体可以被施用于受试者。或者，可以在即将使用前不久，即在对受试者施用之前，将因子ix变体活化成fixa。活化可以通过使因子ix变体与固定化的蛋白酶接触或将含有蛋白酶的溶液与所述因子ix变体混合来进行。因此，可以将两种组分分别保持在溶液中并通过合适的注入装置将它们混合，其中组分在它们通过装置时彼此接触从而引起活化而成为fixa或成为fixa变体。因此，患者接受fixa的混合物，并且此外还接受负责活化的丝氨酸蛋白酶。在这种情况下，重要的是密切注意剂量，因为丝氨酸蛋白酶的额外施用也会激活内源因子ix，这可能缩短凝血时间。

本发明的制剂可以作为具有fix活性的药物制剂以单组分制剂的形式或与其它因子组合以多组分制剂的形式获得。

在将纯化的蛋白质加工成药物制剂之前，可以将纯化的蛋白质进行常规质量控制并制成治疗形式。具体地，在重组制备期间，可以测试纯化过的制剂中是否存在细胞核酸以及衍生自表达载体的核酸。

本发明的另一个特征涉及制备一种制剂，所述制剂含有高稳定性和结构完整性的fixa变体，并且，具体地，不含非活性因子ix/ixa中间体和自身蛋白水解降解产物，并且可以通过活化上述类型的因子ix变体以及通过将其配制成合适的制剂来生产。

作为实例，本发明的药物制剂可含有约1-1000μg/kg、约10-500μg/kg、约10-250μg/kg或约10-100μg/kg的剂量。该量可以每天至少一次静脉内施用。患者可以在因出血在诊所就诊时立即接受治疗或在切割/伤口造成出血之前接受治疗。或者，患者可以每隔一至三小时接受推注注入，或者如果观察到足够的改善，则每天一次注入本文所述的变体。

根据本发明，编码变体的核酸可用于多种目的。在本发明的一个具体实施方案中，提供了用于调节血液凝固的核酸递送媒介物(即表达载体)，其中表达载体包含编码如本文所述的变体多肽或其功能片段的核酸序列。向患者施用编码变体的表达载体导致用于改变凝血级联的变体多肽的表达。根据本发明，编码变体的核酸序列可以编码如本文所述的变体因子ix多肽，其表达增加止血作用。在一个具体实施方案中，所述核酸序列编码人因子ix或因子ixa多肽变体。编码本发明变体的核酸分子或包含编码本发明变体的核酸分子的细胞可以施用于受试者以调节止血。核酸分子可以例如在血小板、t细胞和/或其他造血细胞中表达或递送。

包含变体核酸序列的表达载体可以单独施用，或与用于调节止血的其他分子组合施用。根据本发明，表达载体或治疗剂组合可以单独或在药学上可接受的或生物学相容的组合物中施用于患者。

在本发明的一个具体实施方案中，包含编码变体的核酸序列的表达载体是病毒载体。可用于本发明的具有或不具有组织特异性启动子/增强子的病毒载体包括但不限于：腺相关病毒(aav)载体(例如，aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh10或其他衍生物和/或替代血清型)和杂合aav载体(例如，2种、3种、4种、5种或更多种血清型的组合杂合体)、慢病毒载体和假型慢病毒载体(例如，埃博拉病毒、水疱性口炎病毒(vsv)和猫免疫缺陷病毒(fiv))、单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒载体和逆转录病毒载体。所述aav可以是具有来自不同aav的衣壳蛋白(例如，aav血清型1-12和其他血清型中的任意一种或多种)和基因组(例如，aav血清型2)的杂合aav载体。

在本发明的一个具体实施方案中，提供了用于施用病毒载体的方法，所述病毒载体包含编码变体或其功能片段的核酸序列。如本文所述，施用这种腺病毒载体后变体多肽的表达用于调节止血，具体地，用于增强促凝血活性。

本发明还包括调节止血的方法，包括向个体的细胞(例如，血小板、t细胞、造血细胞等)提供编码变体多肽的核酸递送媒介物并允许细胞在表达变体多肽的条件下生长。可以向受试者施用所述细胞。

从前面的讨论可以看出，变体多肽和表达变体多肽的核酸载体可用于与异常血液凝固相关的病症的治疗。

本发明的表达载体可以掺入到可以提供给受试者的药物组合物中，以便产生生物活性蛋白质(例如变体多肽或其功能片段或衍生物)。在本发明的一个具体实施方案中，包含足够的遗传物质以使受体产生治疗有效量的变体多肽的药物组合物可以影响受试者的止血。或者，如上所述，可以将有效量的变体多肽直接注入到有需要的患者体内。所述组合物可以单独施用或与至少一种其他剂(如稳定化合物)联合施用，所述其他剂可以在任意无菌的、生物相容的药物载体中施用，包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖和水。所述组合物可以单独对患者施用，或与影响止血的其他剂(例如辅因子)联合施用。

在具体实施方案中，如本文所述，药物组合物还含有药学上可接受的赋形剂/载体。这些载体包括任意药剂，所述药剂本身不诱导对接受所述组合物的个体有害的免疫应答，并且可以被施用而无不适当的毒性。药学上可接受的载体包括但不限于液体，例如水、盐水、甘油、糖和乙醇。药学上可接受的盐也可以包括在其中，例如，无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸的盐如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。另外，在这种载体中可以存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质等。关于药学上可接受的赋形剂的详尽讨论可参见remington：thescienceandpracticeofpharmacy(第22版(2012)pharmaceuticalpress)。

适用于肠胃外或血管内施用的药物制剂可以在水溶液中配制，优选地，在生理上相容的缓冲液中，例如hank溶液、ringer溶液或生理缓冲盐水。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。另外，活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油(例如芝麻油)、或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)、或脂质体。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度的试剂，以制备高浓度溶液。

所述药物组合物可以盐的形式提供，并且所述盐可以是与许多酸形成的，所述酸包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。与相应的游离碱形式相比，盐倾向于更易溶于水或其他质子溶剂中。在其他情况下，所述制剂可以是冻干粉末，其可以含有以下任意或所有：1-50mm组氨酸、0.1％-2％蔗糖和2-7％甘露醇，ph范围为4.5-5.5，在使用前与缓冲液结合使用。

药物组合物制备后，可将它们置于合适的容器中并标记用于治疗。对于含有变体的载体或多肽的施用，这种标记应包括施用量、施用频率和施用方法。

适用于本发明的药物组合物包括其中含有有效量的活性成分以达到预期治疗目的的组合物。使用本发明提供的技术和指导，确定治疗有效剂量完全在熟练医师的能力范围内。治疗剂量将取决于受试者的年龄和总体状况、异常凝血表型的严重程度、以及调节变体多肽表达水平的控制序列的强度，等等。因此，人类中的治疗有效量将落入相对宽的范围，该范围可由医师基于个体患者对基于载体的变体治疗的响应来确定。

单独或与其他药剂组合的变体多肽可以如上所述在合适的生物学载体中直接注入到患者体内。包含编码变体或其功能片段的核酸序列的本发明的表达载体可以通过多种方式(见下文)施用于患者，以实现和维持变体多肽的预防和/或治疗上的有效水平。本领域技术人员可以容易地确定使用本发明的编码变体的表达载体用于特定患者的治疗性处理的特定方案。

本发明的编码变体的腺病毒载体可以通过任意已知方法施用于患者。所述药物组合物在体内的直接递送通常可以通过使用常规注射器注射来完成，但是可以设想其他递送方法，例如对流增强递送。在这方面，所述组合物可经皮下、表皮、皮内、鞘内、眶内、粘膜内、腹腔内、血管内、静脉内、动脉内、口腔内、肝内、骨内或肌肉内递送。其他施用方式包括口服和肺部施用、栓剂和经皮应用。专门治疗凝血障碍患者的临床医生可以基于许多标准确定包含变体核酸序列的腺病毒载体的施用的最佳途径，所述标准包括但不限于：患者的状况和治疗的目的(例如，增强或减少血液凝固)。

本发明还包括包含编码变体多肽的核酸序列的aav载体。还包括包含编码变体多肽的核酸序列的慢病毒或假型慢病毒载体。还包括包含编码变体多肽的核酸序列的裸质粒或表达载体。

提供以下实施例以说明本发明的各种实施方案。这些实施例是说明性的，而不意图以任何方式限制本发明。

实施例1

对一系列重组因子ix衍生物，其中位置223、406或410处的氨基酸被修改，进行了活性测试。具体地，glu⁴¹⁰被lys、tyr、arg或his取代；val²²³被tyr取代；asn⁴⁰⁶被arg、lys或gln取代。另外，产生了因子ix变体，其中glu⁴¹⁰被lys取代、arg³³⁸被leu取代。简要地，用表达因子ix变体的质粒瞬时转染100mm平板中的hek293细胞。在48小时收集来自转染细胞的培养基，并在一步因子ix特异性凝固测定(onestagefactorixspecificclottingassay)中评估因子ix活性。用因子ix特异性elisa测定抗原水平。将因子ix变体比活性标准化为抗原水平以控制实验变量。如表1所示，上述鉴定的取代产生了比野生型因子ix更大的比活性。值得注意的是，双突变体使因子ix比活性增强超过15倍。

表1：标准化为野生型fix活性水平的活性水平。

血友病b小鼠血管内施用4×10¹¹个aav8载体的载体基因组(vg)/kg，所述aav8载体在肝特异性启动子的控制下编码fixr338l+e410k(n＝7)或wtfix(n＝2)。图2显示了fix变体(r338l+e410k)和fix-wt在血友病b小鼠中的体内比活性。在载体注射后4周收集血浆样品，并通过基于aptt的测定法测量活性，并通过fixelisa测量抗原。值得注意的是，fix变体在体内显示出比野生型fix显著更高的活性。

实施例2

为了鉴定新的fix变体，选择的氨基酸位置为：(1)未报道与血友病b相关；(2)物种间高度保守；并且(3)位于与蛋白质功能相关的区域。例如，影响活化的fix结合活化的因子viii(fviiia)或与参与内源途径活化的其他酶相互作用的能力的区域。对一系列重组因子ix衍生物，其中位置342或343处的氨基酸被修改，进行了活性测试。具体地，thr³⁴³被met、lys、arg、gln或gly取代并且phe³⁴²被his取代。

简要地，根据制造商的说明，使用2000(invitrogen)，用10μg每种fix变体的质粒dna转染6孔板中的汇合的hek293细胞。转染后4至6小时，检查细胞的持续汇合并转换至包含10μg/ml维生素k的fix表达培养基。24小时后，收集条件培养基。通过市售fix特异性elisa(affinitybiologicals股份有限公司；ancaster，on，canada)测定fix抗原水平，并通过基于aptt的凝固测定法测定活性。两种测定均使用市售重组fix(benefix)作为标准品。所有实验一式三份进行，并与同时转染的fix-wt进行比较(arruda等人，blood(2001)97：130)。

如表2所示，上述鉴定的取代产生了比野生型因子ix更大的比活性。

表2：标准化为野生型fix活性水平的活性水平。

虽然上面已经描述并具体例示了本发明的某些优选实施例，但是并不意味着本发明限于这些实施例。在不脱离如权利要求所阐述的本发明的范围和精神的情况下，可以对其进行各种修改。

序列表

<110>arruda,valderr.

camire,rodneym.

samelson-jones,benjamin

<120>用于调节因子ix功能的组合物和方法

<130>3460-p06354wo00

<150>62/367,321

<151>2016-07-27

<160>8

<170>用于windows的fastseq版本4.0

<210>1

<211>461

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>1

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<210>5

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<213>智人（homosapiens）

<400>5

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<210>6

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<213>人工序列

<220>

<223>fixa的氨基末端序列

<400>6

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1

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<213>人工序列

<220>

<223>切割位点

<220>

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<222>(2)...(2)

<223>xaa是任意氨基酸

<220>

<221>variant

<222>(3)...(3)

<223>xaa是arg或lys

<400>7

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1

<210>8

<211>6

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<213>人工序列

<220>

<223>切割位点

<400>8

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15