因子9表达的调节的制作方法

专利名称：因子9表达的调节的制作方法
技术领域：
本发明提供了降低动物中因子9(F9)的水平的方法和组合物。所述方法和组合物 可用作抗凝剂。
背景技术：
循环系统需要防止血液丢失的机制和消除不适当的血管内梗阻的机制。通常，凝 血包括反应级联，其最终是可溶性纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白凝胶。级联步骤包括 无活性的酶原转化为活化酶。然后，有活性的酶催化级联中的下一个步骤。凝血级联凝血级联可通过两条支路来启动，作为主要途径的组织因子途径(也称为“外源 性途径”)和接触活化途径(也称为“内源性途径”)。组织因子途径由细胞表面受体组织因子(TF，也称为因子III)启动，其由血管外 细胞(周细胞、心肌细胞、平滑肌细胞以及角质形成细胞)组成性表达，且当炎症细胞因子 或内毒素诱导时由血管单核细胞和内皮细胞表达(Drake等人，Am J Pathol 1989,134 1087-1097)。TF是凝血因子VIIa(—种丝氨酸蛋白酶)的高亲和力细胞受体。在不存在TF 的情况下，VIIa具有非常低的催化活性，与TF结合是通过变构机制致使VIIa行使功能所 必需的(Drake 等人，Am J Patholl989，134 :1087_1097)。TF-VIIa 复合物将因子 X 活化为 Xa0 Xa又与其辅因子Va结合成凝血酶原酶复合物，凝血酶原酶复合物又将凝血酶原(也称 为因子II或因子2)活化为凝血酶(也称为因子IIa或因子2a)。凝血酶活化血小板，将纤 维蛋白原转化为纤维蛋白，并通过活化因子XIII而促进纤维蛋白交联，由此在TF暴露于血 管外细胞上的部位形成牢固的血栓。另外，凝血酶通过因子V和VIII加强凝血级联反应。接触活化途径由因子XII活化为XIIa而触发。因子XIIa将XI转化为XIa，XIa 将IX转化为IXa。IXa与其辅因子VIIa结合，将X转化为Xa。这两条途径在这点会聚，因 为因子Xa结合因子Va而将凝血酶原(因子II)活化为凝血酶(因子IIa)。凝血的抑制至少三种机制校正凝血级联，即活化的蛋白C、抗凝血酶以及组织因子途径抑制剂 的作用。活化的蛋白C是一种降解辅因子Va和VIIIa的丝氨酸蛋白酶。蛋白C由凝血酶和 血栓调控素活化，并且需要辅酶蛋白S发挥作用。抗凝血酶是抑制丝氨酸蛋白酶(凝血酶、 Xa、XIIa、XIa以及IXa)的丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)。组织因子途径抑制剂抑制Xa和 TF-VIIa 复合物的作用(Schwartz AL 等人，Trends Cardiovasc Med. 1997 ；7 :234_239)。疾病
血栓形成是血凝块的病理发展，在血凝块迁移至机体其它部分时发生栓塞并干扰 器官功能。血栓栓塞可导致诸如深静脉血栓形成、肺栓塞、心肌梗塞以及中风的状况。重 要的是，血栓栓塞是每年导致二百万多美国人死亡的主要原因(Adcock等人，American Journal of Clinical Pathology. 1997 ; 108 :434_49)。大多数血栓形成病例是由于获得性 外源性问题，例如，手术、癌症、不活动，有些病例是由于遗传易感，例如抗磷脂综合征和常 染色体显性遗传病、因子V莱顿突变(Bertina RM等人，Nature 1994 ；369 =64-67.)。治疗最常用的抗凝剂、华法林、肝素、以及低分子量肝素(LMWH)均具有显著的缺陷。华法林通常用于治疗患有心房纤维颤动的患者。该药物与依赖维生素K的凝血因 子包括因子II、VII、IX以及X相互作用。抗凝剂蛋白C和S也受华法林的抑制。使用华法 林的药物治疗因下述事实而变得更加复杂即，华法林与其他药剂、包括诸如胺碘酮的用于 治疗心房纤维颤动的药物相互作用。因为使用华法林治疗难以预测，必须仔细监测患者以 检测异常出血的任何征象。肝素通过活化抑制凝血酶和因子X的抗凝血酶而发挥作用(Bjork I, Lindahl U. Mol Cell Biochem. 1982 48:161-182)。使用肝素治疗可导致免疫反应，使得血小板在 血管内聚集，可导致血栓形成。该副作用被称为肝素诱导的血小板减少症(HIT)，需要对 患者监测。使用肝素长期治疗还可导致骨质疏松症。LMWH也可抑制因子2，但比普通肝素 (unfractioned heparin, UFH)的程度要低。HIT 的发展涉及 LMWH。因此，目前的抗凝剂缺乏可预测性和特异性，由此需要对患者仔细监测以防止有 害副作用，例如出血并发症。目前没有仅靶向内源性途径或外源性途径的抗凝剂。

发明内容
本发明提供了用于治疗和预防血液凝固紊乱的反义化合物、组合物以及方法。本发明描述的反义化合物可包括靶向因子9核酸的12至30个核苷构成的寡核苷 酸。在一些实施方案中，因子9核酸可为GENBANK登录号NT_011786. 15 (SEQ ID NO 1)的 核苷酸 22823000 至 22858000、GENBANK 登录号 AB186358. 1 (SEQ ID NO 2)、或 GENBANK 登 录号NM_000133. 2(SEQ ID NO 3)所列的任何序列。反义化合物可为单链或双链寡核苷酸。反义化合物可与因子9核酸100%、95%、 90%,85%,80%,75%^； 70%互补。所述反义寡核苷酸可被修饰，其中至少一种核苷间键是修饰的核苷间键。该核苷 间键可为硫代磷酸酯核苷间键。所述反义寡核苷酸可被修饰，其中至少一种核苷包含修饰的糖。该修饰的糖可为 二环糖。该修饰的糖可包含2' -0-甲氧乙基。所述反义寡核苷酸可被修饰，其中至少一种核苷包含修饰的核碱基。该修饰的核 碱基可为5-甲基胞嘧啶。所述反义寡核苷酸可为5-10-5M0E gapmer.所述反义寡核苷酸可由20个连接的 核苷构成。本发明所述的组合物可包含靶向因子9核酸的由12至30个连接的核苷构成的寡 核苷酸，或其盐，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
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所述组合物可为单链或双链寡核苷酸。
本发明描述的方法可包括施于动物靶向因子9核酸的包含由12至30个连接的核 苷构成的寡核苷酸的化合物。所述化合物的给药可减慢或停止凝血。所述化合物可与阿斯匹林、氯吡格雷、双嘧 达莫、肝素、来匹卢定(1印irudin)、噻氯匹定(ticlopidine)以及华法林随同给药。所述化 合物和另一种药物的给药可以是伴随进行。所述化合物和/或另一种药物的给药可为胃肠外给药。胃肠外给药可为皮下或静 脉给药。在一些实施方案中，本发明描述的方法还可包括鉴定患有血凝紊乱的人并将治疗 有效量的靶向因子9核酸的包含由12至30个连接的核苷构成的寡核苷酸的化合物给药于 该人。本发明还描述了一种包含由12至30个连接的核苷构成的反义寡核苷酸的化合 物，所述反义寡核苷酸结合SEQ ID N0:1(编码因子9的核酸)的下列范围内的核碱基 1246 至 1359,7515 至 7608,7872 至 7904,11599 至 11671,18861 至 18896,18905 至 18973、 21690 至 21774,31255 至 31284,31292 至 31373,32065 至 32098,32107 至 32158,32184 至 32273,32303 至 32399,32434 至 32557,32566 至 32625,32643 至 32694,32716 至 32778、 32807 至 32839,32847 至 32871,32912 至 32969,32985 至 33029,33230 至 33263,33272 至 33313,33442 至 33488,33558 至 33582,33801 至 33830,33934 至 33966、或 33230 至 33830。所述反义寡核苷酸可与SEQ ID NO :1 (编码因子9的核酸)90%、95%或100%互 补。所述反义寡核苷酸可与SEQ ID NO :1完全互补。所述反义寡核苷酸可专有地在SEQ ID N0:1(编码因子9的核酸)的核碱基的下 列范围内杂交1246 至 1359,7515 至 7608,7872 至 7904,11599 至 11671,18861 至 18896、 18905 至 18973,21690 至 21774,31255 至 31284,31292 至 31373,32065 至 32098,32107 至 32158,32184 至 32273,32303 至 32399,32434 至 32557,32566 至 32625,32643 至 32694、 32716 至 32778,32807 至 32839,32847 至 32871,32912 至 32969,32985 至 33029,33230 至 33263,33272 至 33313,33442 至 33488,33558 至 33582,33801至 33830,33934 至 33966、或 33230 至 33830。本发明的一些实施方案提供了包含由12至30个连接的核苷构成的和具有核碱 基序列的修饰的寡核苷酸的化合物，其中所述核碱基序列包括与SEQ ID NO :1的核苷酸 33230至33313的相同数目的碱基互补的至少12个连续的核碱基部分，其中所述修饰的寡 核苷酸与SEQID NO 1至少80%互补。在一些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸包括由SEQ ID NO 52、SEQ ID NO :53、 SEQ ID NO 54以及SEQ ID NO :118构成的组中的任何核碱基序列。本发明的一些实施方案提供了一种包含由12至30个连接的核苷构成的修饰的寡 核苷酸的化合物或其盐和药学上可接受的载体和稀释剂，所述寡核苷酸包括与SEQ ID NO 1的核苷酸33230至33313的相同数目的碱基互补的至少12个连续的核碱基部分，其中所 述修饰的寡核苷酸与SEQ ID NO 1至少80%互补。本发明的一些实施方案提供了一种方法，所述方法包括对动物进行化合物的给 药，所述化合物包含由12至30个连接的核苷构成的修饰的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括与
6SEQ ID NO 1的核苷酸33230至33313的相同数目的碱基互补的至少12个连续的核碱基 部分，其中所述修饰的寡核苷酸与SEQ ID NO :1至少80%互补。本发明的一些实施方案提供了 一种方法，所述方法包括鉴定处于血栓栓塞并发症 危险的动物，并对该处于危险的动物进行治疗有效量的化合物的给药，所述化合物包含由 12至30个连接的核苷构成的修饰的寡核苷酸，其中所述修饰的寡核苷酸与因子9核酸互 补。本发明的实施方案提供了化合物，所述化合物包含由12至30个连接的核苷构成 的修饰的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括包含SEQ IDNO 4至135和141至153的核碱基序列 的至少12个连续的核碱基。
具体实施例方式应当理解，前述一般性说明和下文的详细说明仅为例证和解释性的，并非限制本 发明所主张的权利。除非另外特别指明，本发明中单数的使用包括复数。如本发明中使用 的，除非另有指明，“或”的使用是指“和/或”。另外，术语“包括”以及诸如“包含”和“含 有”的使用不受限制。另外，除非另外特别指明，诸如“要素”或“组分”涵盖包括一个单元 的要素和组分和包括超过一个亚单元的要素和组分。本发明使用的节段标题仅为了组织性目的，不应解释为限制所描述的主题。本申 请中引用的包括但不限于专利、专利申请、论文、书籍以及专题论文的所有文献或文献的部 分由此通过引用将本发明所讨论的文献的一部分和其整体清楚地并入本申请。定义除非提供具体定义，本发明所使用的术语和分析化学、合成化学以及医用化学和 药物化学的程序和技术为本领域公知和公用。标准的技术可用于化学合成和化学分析。在 允许的情况下，整个本发明公开内容引用的所有专利、申请、公开的申请以及其他出版物、 GENBANK登录号以及可通过诸如美国国立生物技术信息中心(NCBI)的数据库获得的相关 的序列信息和其他数据通过引用将本发明所讨论的文献的一部分和其整体并入本申请。除非另有指明，下列术语具有以下含义"2' -0-甲氧乙基”(也称为2 ‘ -MOE和2 ‘ _0(CH2)2_0CH3)是指呋喃糖基环的 2'部分的0-甲基-乙基修饰。2’ -0-甲氧乙基修饰的糖是修饰的糖。"2' -0-甲氧乙基核苷酸”是指包含2' -0-甲氧乙基修饰的糖部分(moiety)的 核苷酸。“5-甲基胞嘧啶”是指使用与5'位连接的甲基修饰的胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶是 一种修饰的核碱基。“活性反义化合物”是指降低核酸水平或蛋白质水平的反义化合物。“伴随给药”是指在相同时间以任何方式对两种制剂随同给药，其中，两种制剂的 药理作用均在患者中显现。伴随给药不需要在单一药物组合物中、以相同剂型或通过相同 给药途径对两种制剂进行给药。两种制剂的作用不需要在相同时间显现。所述作用仅需要 重叠一段时间但不需要同延。“给药”是指将药剂提供给个体，包括但不限于通过医学专业人员给药和自我给药。
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“改善”是指相关疾病、病症或紊乱的至少一种指标、体征或症状减轻。指标的严重 性可通过本领域技术人员已知的主观或客观测量值来确定。“动物”是指人类或非人类动物，包括但不限于小鼠、大鼠、家兔、狗、猫、猪，以及非
人类灵长类，包括但不限于猴子和猩猩。“解毒剂化合物”是指能够减轻任何反义活性的强度或持续时间的化合物。“解毒剂寡核苷酸”是指包含与反义化合物互补并能够与之杂交的寡核苷酸的解 毒剂化合物。“解毒剂蛋白质”是指包含肽的解毒剂化合物。“抗体”是指其特征为以某种方式与抗原特异性反应的分子，其中抗体和抗原各自 根据对方来定义。抗体可指完整的抗体分子或其任何片段或区域，例如重链、轻链、Fab区 以及Fc区。“反义活性”是指可归因于反义化合物与其靶核酸杂交的任何可检测或可测量的 活性。在一些实施方案中，反义活性是靶核酸或由该靶核酸编码的蛋白的量或表达减少。“反义化合物”是指能够通过氢键键合与靶核酸杂交的寡聚化合物。“反义抑制”是指，与不存在与靶核酸互补的反义化合物的情况下的靶核酸水平或 靶蛋白水平相比，在存在该反义化合物的情况下靶核酸水平或靶蛋白水平降低。“反义寡核苷酸”是指具有允许与靶核苷酸的相应区域或片段杂交的核碱基序列 的单链寡核苷酸。“双环糖”是指通过两个非成对环原子桥接而修饰的呋喃基环。双环糖是修饰的糖。“双环核酸”或“BNA”或“双环核苷”或“双环核苷酸”是指其中核苷或核苷酸的呋 喃糖部分包括连接呋喃糖环上的两个碳原子从而形成双环系统的桥键的核苷或核苷酸。如 本发明所使用的，除非另有指明，术语“亚甲氧BNA”单独是指β -D-亚甲氧ΒΝΑ。“帽结构”或“末端帽部分”是指在反义化合物的任一末端合并的化学修饰。“化学不同区域”是指以某种方式与反义化合物另一区域不同的所述反义化合物 的一个区域。例如，具有2' -0-甲氧乙基核苷酸的区域与具有无2' -0-甲氧乙基修饰的 核苷酸的区域化学上不同。“嵌合体反义化合物”是指具有至少两个化学不同区域的反义化合物，其中各位置 具有多个亚单位。“随同给药”是指对个体进行两种或多种药剂给药。所述两种或多种药剂可为单一 药物组合物，或可为分开的药物组合物。所述两种或多种药剂各自可通过相同或不同给药 途径给药。随同给药包括并行或顺序给药。“凝血因子”是指血凝级联中的因子I、II、III、IV、V、VII、VIII、IX、X、XI、XII或 XIII的任何因子。“凝血因子核酸”是指任何编码凝血因子的核酸。例如，在一些实施方案 中，凝血因子核酸包括但不限于编码凝血因子的DNA序列(包括包含内含子和外显子的基 因组DNA)、由编码凝血因子的DNA转录而来的RNA序列以及编码凝血因子的mRNA序列。“凝 血因子mRNA”是指编码凝血因子蛋白的mRNA。“互补性”是指一种核酸的核碱基和另一种核酸的核碱基之间配对的能力。“连续核碱基”是指相互之间紧邻的核碱基。
“稀释剂”是指组合物中缺乏药理活性但在药学上是必需或合乎需要的成分。例 如，在注射的药物中，稀释剂可为液体，例如盐水溶液。“剂量”是指在单次给药或在特定时间段提供的药剂的特定量。在一些实施方案 中，剂量可以一次、两次或多次丸剂、片剂或注射来给药。例如，在其中需要皮下注射的一些 实施方案中，所需剂量需要的体积量不容易通过单次注射调控，因此，两次或多次注射可用 于实现所需剂量。在一些实施方案中，通过经延长的时间或连续输注来进行所述药剂的给 药。剂量可解释为每小时、每天、每周或每月的药剂量。“功效”是指产生所需作用的能力。“有效量”是指在需要活性药剂的个体中足以 实现所需生理结果的该药剂的量。有效量可根据待治疗的个体的健康和生理条件、待治疗 的个体的分类群、组合物的配方、个体医学状况的评估以及其他相关因素而在个体中有所 不同。“因子9核酸”或“因子IX核酸”是指编码因子9的任何核酸。例如，在一些实施 方案中，因子9核酸包括但不限于编码因子9的DNA序列、由编码因子9的核酸(包括包含 内含子和外显子的基因组DNA)转录而来的RNA序列以及编码因子9的mRNA序列。“因子 9mRNA”是指编码因子9蛋白的mRNA。“因子9特异性抑制剂”是指能够在分子水平特异性抑制因子9mRNA和/或因子9 蛋白表达的任何制剂。例如，因子9特异性抑制剂包括能够抑制因子9mRNA和/或因子9 蛋白表达的核酸(包括反义化合物)、肽、抗体、小分子以及其他制剂。在一些实施方案中， 通过特异性调节因子9mRNA和/或因子9蛋白表达，因子9特异性抑制剂可影响凝血级联 的其他组分，包括下游组分。相似地，在一些实施方案中，因子9特异性抑制剂可影响动物 中的其他分子进程。“因子9特异性抑制剂解毒剂”是指能够减轻因子9特异性抑制剂作用的化合物。 在一些实施方案中，因子9特异性抑制剂解毒剂选自因子9肽、因子9解毒剂寡核苷酸，包 括与因子9反义化合物互补的因子9解毒剂化合物，以及影响内源性或外源性凝血途径的 任何化合物或蛋白质。“完全互补”或“100%互补”是指第一核酸的各核碱基具有与第二核酸互补的核碱 基。在一些实施方案中，第一核酸为反义化合物，靶核酸为第二核酸。在某些这样的实施方 案中，反义寡核苷酸为第一核酸，靶核酸为第二核酸。"Gapmer"是指这样一种反义化合物，即其中支持RNA酶H裂解的具有多个核苷酸 的内部区域位于在化学上与内部区域的核苷不同的具有一个或多个核苷酸的外部区域之 间。“间隙片段”是指构成gapmer的内部区域的多个核苷酸。“侧翼片段”是指gapmer的 外部区域。“间隙加宽的”是指具有12个或更多连续的2' ~脱氧核糖核苷的间隙片段的嵌 合反义化合物，所述2' _脱氧核糖核苷位于具有一个至六个核苷的5'和3'侧翼片段之 间并与之紧邻。“杂交，，是指互补的核酸分子退火。在一些实施方案中，互补的核酸分子包括但不 限于反义化合物和靶核酸。在某些这样的实施方案中，互补的核酸分子包括但不限于反义 寡核苷酸和核酸靶。“鉴定处于血栓栓塞并发症危险中的动物”是指鉴定被诊断患有血栓栓塞并发症的动物，或鉴定倾向于发展血栓栓塞并发症的动物。倾向于发展血栓栓塞并发症的个体包 括具有血栓栓塞并发症的一种或多种危险因素的那些，包括不活动、手术(特别是矫形手 术)、恶性肿瘤、怀孕、老龄、使用口服避孕药以及遗传性或获得性血栓前凝血疾病。所述鉴 定可通过任何方法来实现，包括评价个体的医学史和标准临床检测或评估。“紧邻”是指在紧邻的元素之间没有介入的元素。“个体”是指所选择进行治疗或疗法的人类或非人类动物。“具有其需要的个体”是指所选择进行治疗或疗法的具有所述治疗或疗法需要的 人类或非人类动物。“核苷间键”是指核苷之间的化学键。“连接的核苷”是指键合在一起的相邻核苷。“错配”或“非互补的核碱基”是指不能与第二核酸或靶核酸的相应核碱基配对的 第一核酸的核碱基。“修饰的核苷间键”是指来自天然存在的核苷间键(即，磷酸二酯核苷间键)的取 代和/或任何变化。“修饰的核碱基”是指除了腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶以外的任何 核碱基。“未修饰的核碱基”是指嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、 胞嘧啶(C)以及尿嘧啶(U)。“修饰的核苷酸”是指独立地具有修饰的糖部分、修饰的核苷间键或修饰的核碱基 的核苷酸。“修饰的核苷”是指独立地具有修饰的糖部分或修饰的核碱基的核苷。“修饰的寡核苷酸”是指包含修饰的核苷间键、修饰的糖和/或修饰的核碱基的寡 核苷酸。“修饰的糖”是指天然糖的取代和/或任何改变。“修饰的糖部分”是指具有天然 糖的取代和/或任何改变的糖部分。“基序”是指反义化合物中未修饰和修饰的核苷的形式，即反义化合物中化学不同 区域的形式。“天然存在的核苷间键”是指3'至5'磷酸二酯键。“天然糖部分”是指存在于DNA (2 ‘ -H)或RNA (2 ‘ -0H)中的糖。“核酸”是指由单体核苷酸构成的分子。核酸包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸 (DNA)、单链核酸、双链核酸、小干扰核糖核酸(siRNA)以及微RNA(miRNA)。“核碱基”是指能够与另一核酸的碱基配对的杂环部分。“核碱基序列”是指独立于任何糖、键和/或核碱基修饰的连续的核碱基。“核苷”是指与糖键合的核碱基。“核苷酸”是指具有与核苷的糖部分共价键合的磷酸基团的核苷。“寡聚化合物”或“寡聚物”是指包含能够与核酸分子的至少一个区域杂交的连接 的单体亚单位的聚合物。“寡核苷酸”是指连接的核苷的聚合物，各核苷可以是修饰的或未修饰的，相互独立。“胃肠外给药”是指通过注射或输注给药。胃肠外给药包括但不限于皮下给药、静 脉给药、肌肉给药、动脉给药、腹膜内给药或颅内给药，例如鞘内给药或脑室内给药。“皮下
10给药”是指刚好在皮肤下面给药。“静脉给药”是指向静脉给药。“肽”表示通过酰胺键连接至少两个氨基酸而形成的分子。肽是指多肽和蛋白质。“药剂”是指当对个体给药时提供治疗益处的物质。例如，在一些实施方案中，靶向 因子9的反义寡核苷酸是药剂。“活性药剂”是指药物组合物中提供所需作用的一种或多种 物质。“药物组合物”是指适于对个体给药的物质的混合物。例如，药物组合物可包含一 种或多种反义寡核苷酸和无菌水溶液。“药学上可接受的盐”是指生理上和药学上可接受的反义化合物的盐，即保留母体 寡核苷酸的所需生物学活性且不赋予不需要的毒理学作用的盐。“硫代磷酸酯键”是指核苷之间的键，其中磷酸二酯键通过使用硫原子取代非桥接 氧原子而修饰。硫代磷酸酯键是修饰的核苷间键。“部分(portion) ”是指核酸的确定数量的连续的(即，连接的)核碱基。在一些 实施方案中，“部分”是靶核酸的确定数量的连续的核碱基。在一些实施方案中，“部分”是 反义化合物的确定数量的连续的核碱基。“预防”是指延迟或阻止疾病、病症或紊乱的发病或发展的自几分钟至不确定的时 间段。“预防”还指减轻疾病、病症或紊乱发展的危险。“前药”是指以无活性形式制备的治疗剂，在机体或其细胞内所述无活性形式通过 外源性酶或其它化学物或条件而转化为活性形式(即，药物)。“副作用”是指归因于治疗的非所需作用的生理反应。在一些实施方案中，副作用 包括但不限于注射部位反应、肝功能检测异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统 异常、肌病以及不适。例如，血清中转氨酶水平升高可表明肝毒性或肝功能异常。例如，胆 红素升高可提升肝毒性或肝功能异常。“单链寡核苷酸”是指没有与互补链杂交的寡核苷酸。“修饰的单链寡核苷酸”是 指没有与互补链杂交的修饰的寡核苷酸。“可特异性杂交的”是指反义化合物与靶核酸杂交以诱发所需作用，而对非靶核酸 表现最小的作用或无作用。例如，可特异性杂交的意思是，在特异性结合所需的条件下(即 在体内测定和治疗性治疗的情况的生理条件下)，反义化合物在反义寡核苷酸和靶核苷酸 之间具有足够程度的互补性以诱发所需作用，而对非靶核酸表现最小的作用或无作用。“严谨杂交条件”是指诸如反义化合物的核酸分子与靶核酸序列杂交但与最小数 量的其他序列杂交的条件。严谨条件具有序列依赖性，且在不同情况有所不同。在本发明 的上下文中，寡聚化合物与靶序列杂交的严谨条件通过寡聚化合物的性质和组成以及对它 们进行研究的分析来确定。“被靶”或“被靶向”是指具有允许反义化合物与靶核酸特异性杂交以诱发所需作 用的核碱基序列。在一些实施方案中，所述作用是减少靶核酸。在一些实施方案中，所述作 用是减少因子9mRNA。“靶向”是指对与靶核酸特异性杂交并诱发所需作用的反义化合物进行设计和选 择的过程。“靶核酸”、“靶RNA”、“靶RNA转录”以及“核酸靶”均指能够被反义化合物靶向的核酸。
“靶片段”是指靶向反义化合物的靶核酸的核苷酸序列。“5'靶位点”是指靶片段 的5'最末端的核苷酸。“3'靶位点”是指靶片段的3'最末端的核苷酸。“靶区域”或“活性靶区域”是指靶向一种或多种反义化合物的靶核酸的一部分。“治疗有效量”是指提供给个体治疗益处的药剂的量。“血栓栓塞并发症”是指涉及由血栓导致的栓塞的任何疾病、病症或紊乱。所述疾 病、病症以及紊乱的实例包括血栓形成、栓塞以及血栓栓塞的范畴。在一些实施方案中，所 述疾病、病症以及紊乱包括深静脉血栓形成、肺栓塞、心肌梗塞以及中风。“治疗”是指进行药物组合物的给药以产生疾病、病症或紊乱的改变或改善。“未修饰的核苷酸”是指由天然存在的核碱基、糖部分以及核苷间键组成的核苷 酸。在一些实施方案中，未修饰的核苷酸是RNA核苷酸(即，β -D-核糖核苷)或DNA核苷 酸(β-D-脱氧核糖核苷)。一些实施方案本发明的实施方案提供了用于调节因子9mRNA和蛋白质表达的方法、化合物以及 组合物。在一些实施方案中，因子9mRNA和蛋白质的表达被降低。在一些实施方案中，因子 9特异性抑制剂调节因子9mRNA和蛋白质的表达。在一些实施方案中，因子9特异性抑制剂 为核酸、蛋白质或小分子。在一些实施方案中，在细胞或组织中发生调节。在一些实施方案中，所述细胞或组 织是动物中的。在一些实施方案中，所述动物是人类。在一些实施方案中，因子9mRNA水平 被降低。在一些实施方案中，因子9蛋白质水平被降低。这样的降低可以以时间依赖性方 式或以剂量依赖性方式发生。本发明的实施方案提供了用于治疗、预防或改善具有其需要的个体中与因子9相 关的疾病、病症以及紊乱的方法、化合物以及组合物。在一些实施方案中，所述疾病、病症以 及紊乱为血栓栓塞并发症。所述血栓栓塞并发症包括血栓形成、栓塞以及血栓栓塞的范畴。 在一些实施方案中，所述疾血栓栓塞并发症包括深静脉血栓形成、肺栓塞、心肌梗塞以及中 风。这样的疾病、病症以及紊乱通常具有一种或多种危险因素、原因或结果。发展血栓 栓塞并发症的某些危险因素和原因包括不活动、手术(特别是矫形手术)、恶性肿瘤、怀孕、 老龄、使用口服避孕药、心房纤维颤动、先前的血栓栓塞并发症、慢性炎症疾病以及遗传性 或获得性血栓前凝血疾病。与血栓栓塞并发症发展相关的某些结果包括通过受累血管的血 流增加、组织坏死以及死亡。在一些实施方案中，治疗方法包括对有其需要的个体进行因子9特异性抑制剂的 给药。在一些实施方案中，本发明提供了用于制备用于治疗、预防或改善与因子9相关 的疾病、病症或紊乱的药剂的方法和化合物。因子9相关的疾病、病症以及紊乱包括血栓栓 塞并发症，例如血栓形成、栓塞、深静脉血栓形成、肺栓塞、心肌梗塞以及中风。本发明的实施方案提供了用于治疗、预防或改善与因子9相关的疾病的因子9特 异性抑制剂。在一些实施方案中，因子9特异性抑制剂为核酸(包括反义化合物)、肽、抗 体、小分子以及能够抑制因子9mRNA和/或因子9蛋白质表达的其他制剂。本发明的实施方案提供了本发明所描述的用于治疗、预防或改善血栓栓塞并发症的因子9特异性抑制剂，所述血栓栓塞并发症例如血栓形成、栓塞和血栓栓塞、深静脉血栓 形成、肺栓塞、心肌梗塞以及中风。本发明的实施方案提供了与本发明所描述的另外的制剂或治疗剂联合治疗的本 发明所描述的用于治疗、预防或改善血栓栓塞并发症的因子9特异性抑制剂。制剂或治疗 剂可随同给药或伴随给药。本发明的实施方案提供了与本发明所描述的另外的制剂或治疗剂联合治疗的本 发明所描述的因子9特异性抑制剂在制备用于治疗、预防或改善血栓栓塞并发症的药剂中 的用途。制剂或治疗剂可随同给药或伴随给药。本发明的实施方案提供了本发明所描述的因子9特异性抑制剂在制备用于治疗、 预防或改善患者中本发明所描述的血栓栓塞并发症的药剂中的用途，所述患者接下来被施 用本发明所述描述的另外的制剂或治疗剂。本发明的实施方案提供了用于治疗、预防或改善本发明所描述的血栓栓塞并发症 的试剂盒，其中所述试剂盒包含(i)本发明所描述的因子9特异性抑制剂；和可选地(ii) 本发明所描述的另外的制剂或治疗剂。本发明的试剂盒可进一步包含通过本发明所描述的联合治疗使用该试剂盒来治 疗、预防或改善本发明所描述的血栓栓塞并发症的说明书。本发明的实施方案提供了靶向因子9核酸的反义化合物。在一些实施方案中，人 类因子9核酸是GENBANK登录号NT_011786. 15 (截取22823000至22858000，本发明中作为 SEQ ID NO :1并入)、GENBANK登录号AB186358. 1(本发明中作为SEQ ID N0:2并入)以及 GENBANK登录号ΝΜ_000133. 2 (本发明中作为SEQ ID NO :3并入)中所列的任何序列。反义化合物寡核苷酸化合物包括但不限于寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸类似物、寡核苷酸模拟 物、反义化合物、反义寡核苷酸以及siRNA。寡聚化合物可与靶核酸“反义”，意思是它能够 通过氢键键合与靶核酸杂交。在一些实施方案中，反义化合物具有核碱基序列，该核碱基序列当以5'至3'方 向书写时，包括靶向靶核酸的靶片段的逆向互补。在一些这样的实施方案中，反义寡核苷酸 具有核碱基序列，该核碱基序列当以5'至3'方向书写时，包括靶向靶核酸的靶片段的逆 向互补。在一些实施方案中，靶向因子9核酸的反义化合物为12至30个亚单位长度。换句 话说，反义化合物为12至30个连接的亚单位。在其他实施方案中，反义化合物为8至80、 12至50、15至30、18至24、19至22、或20个连接的亚单位。在一些这样的实施方案中，反 义化合物的长度为 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、 54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、 79、或80个连接的亚单位，或由上述数值中的任何两个限定的范围。在一些实施方案中，反 义化合物是反义寡核苷酸，连接的亚单位是核苷酸。在一些实施方案中，变短或截短的靶向因子9核酸的反义化合物有单个亚单位从 5'端缺失(5'截短)或可选地从3'端缺失(3'截短)。变短或截短的靶向因子9核酸 的反义化合物可有两个亚单位从该反义化合物5'端缺失或可选地有两个亚单位从3'端缺失。可选地，所缺失的核苷可分散于整个反义化合物中，例如，在有一个核苷从5 ‘端缺失 和有一个核苷从3'端缺失的反义化合物中。当在延长的反义化合物中存在单个另外的亚单位时，所述另外的亚单位可位于该 反义化合物的5'端或3'端。当存在两个或多个另外的亚单位时，所添加的亚单位可相互 相邻，例如，在有两个亚单位添加至5'端(5'添加)或可选地添加至3'端(3'添加)的 反义化合物中。可选地，所添加的亚单位分散于该反义化合物中，例如，在有一个亚单位添 加至5'端(5'添加)和一个亚单位添加至3'端(3'添加)的反义化合物中。增加或减少诸如寡核苷酸的反义化合物的长度和/或引入错配碱基而不消除活 性是可能的。例如，在Woolf 等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :7305_7309，1992)中，检验 了一系列长度为13-25核碱基的反义寡核苷酸诱导卵母细胞细胞注射模型中靶RNA裂解的 能力。具有8个或11个错配碱基接近反义寡核苷酸末端的长度为25个核碱基的反义寡核 苷酸能够指导靶mRNA的特异性裂解，尽管比不含错配的反义寡核苷酸程度要小。相似地， 使用13个核碱基的反义寡核苷酸实现靶特异性裂解，包括具有1个或3个错配的那些。Gautschi 等人(J. Natl. Cancer Inst. 93 :463_471，March 2001)证明了与 bcl-2mRNA具有互补性且与bcl-xL mRNA具有3个错配的寡核苷酸在体外和体内降低bcl_2 和bcl-xL的表达。另外，该寡核苷酸证明了有效的体内抗肿瘤活性。Maher 和 Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16 :3341_3358，1988)在家兔网织红细胞测定中 分别检验了 14个核碱基反义寡核苷酸以及包含两个或三个串联反义寡核苷酸的28和42 个核碱基的反义寡核苷酸阻止人类DHFR的翻译的能力。三种14个核碱基的反义寡核苷酸 各自能够单独抑制翻译，尽管比28或42个核碱基的寡核苷酸的水平较低。反义化合物基序在一些实施方案中，靶向因子9核酸的反义化合物具有以赋予反义化合物特性的 模式或基序配置的化学修饰的亚单位，例如，增强的抑制活性、增加的对于靶核酸的结合亲 和力，对体内被核酸酶降解的抵抗力。嵌合的反义化合物通常含有至少一个区域被修饰以赋予对于核酸酶降解的抵抗 力增强、细胞摄取增加、对于靶核酸的结合亲和力增加和/或抑制活性增加。嵌合反义化合 物的第二区域可任选作为细胞内切核酸酶RNA酶H的底物，RNA酶H裂解RNA:DNA双链体 的RNA链。具有gapmer基序的反义化合物被认为是嵌合反义化合物。在gapmer中，具有支 持RNA酶H裂解的多个核苷酸的内部区域位于具有与内部区域的核苷化学上不同的多个核 苷酸的外部区域之间。在具有gapmer基序的反义寡核苷酸的情况中，间隙片段支持靶核酸 的裂解，而侧翼片段包含修饰的核苷以增强稳定性、亲和力以及外切核酸酶抵抗力。在一 些实施方案中，gapmer区域由包含各不同区域的糖部分的类型而区别开来。在一些实施方 案中，用于区别gapmer区域的糖部分的类型可包括β -D-核糖核苷、β -D-脱氧核糖核苷、 2'-修饰的核苷(除了其他的，这样的2'-修饰的核苷还可包括2' -MOE和2' -O-CH3), 双环糖修饰的核苷(这样的双环糖修饰的核苷可包括具有4' -(CH2)η-0-2'桥键(其中， η=1或η = 2)的那些。优选地，各不同区域包括一致的糖部分。侧翼-间隙-侧翼基序 通常被描述为“Χ-Υ-Ζ”，其中“X”代表5 ‘侧翼区域的长度，“Y”代表间隙区域的长度，“Ζ” 代表3'侧翼区域的长度。如本发明使用的，被描述为“Χ-Υ-Ζ”的gapmer具有使得间隙片
14段紧邻各5'侧翼片段和3'侧翼片段的构型。因此，在5'侧翼片段和间隙片段之间或在 间隙片段和3'侧翼片段之间不存在介入的核苷酸。本发明描述的任何反义化合物可具有 gapmer基序。在一些实施方案中，Y为8至15个核苷酸。X、Y或Z可为1个、2个、3个、4 个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19 个、20个、25个、30个或更多数量的任何数量的核苷酸。因此，本发明的gapmer包括但不限 于例如，5-10-5、4-8-4、4-12-3、4-12-4、3-14-3、2-13-5、2-16-2、1-18-1、3-10-3、2-10-2、 1-10-1、或 2-8-2。在一些实施方案中，反义化合物具有“wingmer”基序，该基序具有侧翼-间隙或间 隙_侧翼构型，即如上所述的gapmer构型的X-Y或Y-Z构型。因此，本发明的wingmer构 型包括但不限于例如 5-10、8-4、4-12、12-4、3-14、16-2、18-1、10-3、2-10、1-10、8-2、2-13、 或 5-13。在一些实施方案中，靶向因子9核酸的反义化合物具有5-10-5gapmer基序。在一些实施方案中，靶向因子9核酸的反义化合物具有3-14-3gapmer基序。在一些实施方案中，靶向因子9核酸的反义化合物具有2-13-5gapmer基序。在一些实施方案中，靶向因子9核酸的反义化合物具有2-12-2gapmer基序。在一些实施方案中，靶向因子9核酸的反义化合物具有加宽间隙的基序。在一些实施方案中，靶向因子9核酸的加宽间隙的反义寡核苷酸具有紧邻具有3 个化学修饰的核苷的5'侧翼片段和在所述5'侧翼片段之间的具有14个2'-脱氧核糖 核苷酸的间隙片段。在一些实施方案中，所述化学修饰包括2'-糖修饰。在另一实施方案 中，所述化学修饰包括2 ‘ -MOE糖修饰。在一些实施方案中，加宽间隙的靶向因子9核酸的反义寡核苷酸具有紧邻具有2 个化学修饰的核苷的5'侧翼片段和具有5个化学修饰的核苷的3'侧翼片段且在它们之 间的具有13个2'-脱氧核糖核苷酸的间隙片段。在一些实施方案中，所述化学修饰包括 2'-糖修饰。在另一实施方案中，所述化学修饰包括2' -MOE糖修饰。靶核酸、靶区域和核苷酸序列编码因子9基因序列的核苷酸序列包括但不限于下列序列GENBANK 登录号ΝΤ_011786. 15(截取22823000至22858000)，于2000年11月29日首次在 GENBΑΝΚ 存放，作为 SEQ ID NO :1 并入本申请；(^NBANK 登录号 AB186358. 1，于 2005 年2月7日首次存放于GENBANK JtSSEQ ID NO :2并入本申请；GENBANK 登录号NM_000133. 2，于1999年3月24日首次在GENBANK 存放，作为SEQ ID NO 3 并入本申请；以及GENBANK登录号NT_039706. 6，截取5038000至5071000，于2003年2月 24日首次以GENB ANK 存放，作为SEQ ID NO 136并入本申请。应当理解，本发明包含的实施例中各SEQ ID NO中所列的序列不依赖于对糖部分、 核苷间键或核碱基的任何修饰。这样，由SEQ IDNO定义的反义化合物可独立地包括对糖部 分、核苷间键或核碱基的一种或多种修饰。Isis号(ISIS No.)描述的反义化合物显示了核 碱基序列和基序的组合。在一些实施方案中，靶区域为靶核酸的结构上定义的区域。例如，靶区域可包含 3' UTR,5' UTR、外显子、内含子、外显子/内含子接头、编码区、翻译起始区、翻译终止区或 其他定义的核酸区域。结构上定义的因子9基因序列的区域可通过来自诸如NCBI的序列数据库的登录号来获得，这样的信息通过引用并入本申请。在一些实施方案中，靶区域可包 含靶区域内的一个靶片段的5'靶位点至靶区域的另一靶片段的3'靶位点的序列。靶向包括确定反义化合物与之杂交的至少一个靶片段，使得发生所需作用。在一 些实施方案中，所需作用在mRNA靶核酸水平减小。在一些实施方案中，所需作用是由靶核 酸编码的蛋白水平减小或与靶核酸有关的表型改变。靶区域可含有一个或多个靶片段。靶区域内的多个靶片段可为重叠的。可选地，它 们可为不重叠的。在一些实施方案中，靶区域内的靶片段由不超过约300个核苷酸分离。在 一些实施方案中，靶区域内的靶片段由靶核酸上的为、约为、不超过、不超过约250个、200 个、150个、100个、90个、80个、70个、60个、50个、40个、30个、20个、或10个核苷酸的多 个核苷酸分离，或为任何两个前述数值限定的范围。在一些实施方案中，靶区域内的靶片段 由靶核酸上的不超过、不超过约5个核苷酸分离。在一些实施方案中，靶片段是连续的。本 发明考虑了由具有本发明所列的任何5'靶位点或3'靶位点的起始核酸的范围所限定的 靶区域。合适的靶片段可见于5' UTR、编码区、3' UTR、内含子、外显子或外显子/内含子 接头内。含有起始密码子或终止密码子的靶片段也是合适的靶片段。合适的靶片段可特别 排除某些结构上定义的区域，例如起始密码子或终止密码子。合适的靶片段的确定可包括将靶核酸与基因组中的其他序列进行比较。例如， BLAST算法可用于鉴定不同核酸中的具有相似性的区域。该比较可防止选择下述反义化 合物序列即，以非特异性方式与除了所选择的靶核酸以外的序列(即，非靶序列或脱靶序 列)杂交的反义化合物序列。在活性靶区域内反义化合物的活性(例如，由靶核酸水平降低的百分数所定义 的)可不同。在一些实施方案中，因子9mRNA水平降低指示因子9表达抑制。因子9蛋白 水平降低也指示靶mRNA表达抑制。另外，表型改变指示因子9表达抑制。例如，延长的PT 时间可指示因子9表达抑制。在另一实例中，延长的aPTT时间和延长的PT时间可指示因 子9表达抑制。在另一实例中，血小板因子4(PF-4)表达水平降低可指示因子9表达抑制。 在另一实例中，血栓形成减少或血栓形成的时间增加可指示因子9表达抑制。杂交在一些实施方案中，在本发明公开的反义化合物和因子9核酸之间发生杂交。 最常用的杂交机制涉及核酸分子的互补核碱基之间氢键键合(例如，Watson-Crick, Hoogsteen或逆向Hoogsteen氧键键合)。杂交可在不同条件下发生。严谨条件具有序列依赖性，并且由待杂交的核酸分子 的性质和组成来确定。确定序列是否可与靶核酸特异性杂交的方法为本领域公知。在一些实施方案中， 本发明提供的反义化合物可与因子9核酸特异性杂交。互补性当反义化合物的足够数量的核碱基可与靶核酸的相应核碱基氢键键合使得发生 所需作用(例如，诸如因子9核酸的靶核酸的反义抑制)时，反义化合物和靶核酸相互之间互补。可容忍反义化合物和因子9核酸之间非互补的核碱基，只要反义化合物仍能够与靶核酸特异性杂交。另外，反义化合物可与因子9核酸的一个或多个片段杂交，使得杂交事 件中不涉及介入或邻近片段(例如，环结构、错配或发夹结构)。在一些实施方案中，本发明提供的反义化合物或其特定部分与因子9核酸、其靶 区域、靶片段或其特定部分有(或至少有)70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 互补。反义化合物与靶核酸的
互补百分数可使用常规方法来确定。例如，其中反义化合物的20个核碱基中有18个与靶区域互补且因此特异性杂交 的反义化合物代表90%的互补性。在该实例中，余下的非互补核碱基可与互补的核碱基聚 集或分散，不需要相互之间连续或与互补的核碱基连续。这样，由与靶核酸完全互补的两 个区域侧邻的具有4个非互补核碱基的18个核碱基长度的反义化合物与靶核酸总共具有 77. 8%的互补性，因此落入本发明的范围内。反义化合物与靶核酸的互补百分数可使用本 领域已知的BLAST程序(基础局部比对检索工具)和PowerBLAST程序常规确定(Altschul 等人，J. Mol. Biol.，1990，215,403 410 ；Zhang 和 Madden, Genome Res.，1997，7，649656)。 同源性、序列同一性、或互补性百分数可通过例如使用Smith和Waterman算法(Adv. Appl. Math. ,1981,2,482489)白勺 Gap 禾呈;^ (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,Madison Wis.)使用缺 省设置来确定。在一些实施方案中，本发明提供的反义化合物或其特定部分与靶核酸或其特定部 分完全互补(即100%互补)。例如，反义化合物可与因子9核酸、其靶区域、或靶片段或靶 序列完全互补。如本发明使用的，“完全互补”是指反义化合物的各核碱基能够与靶核酸的 相应核碱基准确碱基配对。例如，20个核碱基的反义化合物与400个核碱基长度的靶序列 完全互补，只要具有与反义化合物完全互补的靶核酸的相应的20个核碱基部分。完全互补 还可用于指第一和/或第二核酸的特定部分。例如，30个核碱基的反义化合物的20个核碱 基部分可与400个核碱基长度的靶序列“完全互补”。如果靶序列具有相应的20个核碱基 部分，其中各碱基与反义化合物的20个核碱基部分的各核碱基互补，则30个核碱基寡核苷 酸的20个核碱基部分与靶序列完全互补。同时，根据反义化合物的余下的10个核碱基是 否也与靶序列互补，完整的30个核碱基的反义化合物可与靶序列完全互补或者不与其完 全互补。非互补的核碱基的位置可位于反义化合物的5'端或3'端。可选地，非互补的一 个核碱基或多个核碱基可位于反义化合物的内部位置。当存在两个或多个非互补核碱基 时，它们可以是连续的(即，连接的)或非连续的。在一个实施方案中，非互补的核碱基位 于gapmer反义寡核苷酸的侧翼片段中。在一些实施方案中，长度达12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、或 20个核碱基的反义化合物包含与诸如因子9核酸的靶核酸或其特定部分相关的不超过4 个、不超过3个、不超过2个或不超过1个非互补的核碱基。在一些实施方案中，长度达12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20 个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、或30个核碱基的反义化合物
包含与诸如因子9核酸的靶核酸或其特定部分相关的不超过6个、不超过5个、不超过4个、 不超过3个、不超过2个或不超过1个非互补的核碱基。
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本发明提供的反义化合物还包括与靶核酸的一部分互补的那些。如本发明所使用 的，“部分”是指靶核酸的区域或片段内确定数量的连续的(即，连接的)核碱基。“部分” 还可指反义化合物的确定数量的连续的核碱基。在一些实施方案中，反义化合物与靶片段 的至少15个核碱基互补。还考虑了与靶序列的至少9个、10个、11个、12个、13个、14个、 15个、16个、17个、18个、19个、20个、或更多核碱基的部分或由这些数值中的任何两个限 定的范围互补的反义化合物。同一性本发明提供的反义化合物还可具有与特定核苷酸序列、SEQ IDNO或由特定Isis 号表示的化合物确定的同一性百分数。如本发明所使用的，如果反义化合物具有相同的核 碱基配对能力，则它与本发明公开的序列具有同一性。例如，含有取代公开的DNA序列中的 胸腺嘧啶的尿嘧啶的RNA被认为与DNA序列具有同一性，因为尿嘧啶核胸腺嘧啶均与腺嘌 呤配对。本发明还考虑了本发明描述的反义化合物的变短和延长形式以及具有与本发明提 供的反义化合物有关的非全同碱基的化合物。在整个反义化合物中，非全同碱基可相互邻 近或分散。根据相对于比较的序列具有相同碱基配对的碱基的数量来计算反义化合物的同 一性百分数。在一些实施方案中，反义化合物或其部分与本发明公开的一种或多种反义化合物 或 SEQ ID NO 或其部分具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或100%的同一性。修饰核苷为碱基_糖组合。核苷的核碱基(也称为碱基)部分通常是杂环碱基部分。 核苷酸为进一步包括与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。对于包括戊呋喃糖基糖 的那些核苷，磷酸基团可与糖的2'、3'或5'羟基部分连接。寡核苷酸的形成是通过相邻 的核苷相互之间共价键合而形成线性聚合的寡核苷酸。在寡核苷酸结构内，磷酸基团通常 是指形成寡核苷酸的核苷间键。对反义化合物的修饰包括对核苷间键、糖部分或核碱基的取代或改变。因为合乎 需要的特性，例如，细胞摄取增强、对核酸靶的亲和力增强、在核酸酶的存在下稳定性增加 或抑制活性增加，修饰的反义化合物通常比天然形式优选。化学修饰的核苷也可用于增加变短或截短的寡核苷酸与其靶核酸的结合亲和力。 因此，使用具有这样的化学修饰的核苷的较短的反义化合物常常获得具有可比性的结果。修饰的核苷间键RNA和DNA的天然存在的核苷间键是3'至5'磷酸二酯键。因为合乎其需要的特 性，例如，细胞摄取增强、对于靶核酸的亲和力增强以及在核酸酶的存在下稳定性增加，具 有一个或多个修饰的(即，非天然存在的)核苷间键的反义化合物常常比具有天然存在的 核苷间键的反义化合物优选。具有修饰的核苷间键的寡核苷酸包含保留磷原子的核苷间键和不具有磷原子的 核苷间键。典型的含磷的核苷间键包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、甲基磷酸酯、氨基磷 酸酯以及硫代磷酸酯。含磷和不含磷的键的制备方法为公知的。在一些实施方案中，靶向因子9核酸的反义化合物包括一种或多种修饰的核苷间 键。在一些实施方案中，修饰的核苷间键为硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，反义化合物的各核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。修饰的糖部分本发明的反义化合物可任选含有其中糖基被修饰的一种或多种核苷。这样的糖修 饰的核苷可赋予反义化合物增强的核酸酶稳定性、结合亲和力增加或一些其他有益的生物 特性。在一些实施方案中，核苷包括化学修饰的呋喃核糖环部分。化学修饰的呋喃核糖环的 实例包括但不限于添加取代基团(包括5'和2'取代基团，非成对的环原子桥接形成双环 核酸(BNA)，以S、N(R)或C (Rl) (R) 2 (R = H、C1-C12烷基或保护基团)取代核糖基环氧原 子)以及它们的组合。化学修饰的糖的实例包括2' -F-5'-甲基取代的核苷(对于其他 公开的5' ,2'-双取代核苷，见2008年8月21日公布的PCT国际申请WO 2008/101157) 或以“S”取代核基环氧原子，以及在2'位的进一步取代(见2005年6月16日公布的美 国专利申请US2005-0130923)或可选地BNA的5'取代(见2007年11月22日公布的PCT 国际申请WO 2007/134181，其中使用例如5'-甲基或5'-乙基基团取代LNA)。具有修饰的糖部分的核苷的实例包括但不限于包含5'-乙基、5'-甲基(R或 S)、4' -S、2' -F、2' -OCH3以及2' -0(CH2) 20CH3取代基。2'位的取代基还可选自烯丙 基、氨基、叠氮基、硫代基、0-烯丙基、0-C1-C10 烷基、OCF3> 0 (CH2) 2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm) (Rn)以及O-CH2-C( = 0)-N(Rm) (Rn)，其中，各Rm和Rn独立地为H或取代或未取代的Cl-ClO 焼基。双环核酸(BNA)的实例包括但不限于包含4'和2'核基环原子之间的桥键的核 苷。在一些实施方案中，本发明提供的反义化合物包括一种或多种BNA核苷，其中，桥键 包括下式中的一种4' -(CH2)-0-2' (LNA) ；4' -(CH2)-S-2' ；4' -(CH2)-0-2' (LNA)； 4 ‘ -(CH2) 2-0-2 ‘ (ENA) ；4 ‘ -C (CH3) 2_0_2 ‘(见 PCT/US2008/068922)； 4 ‘ -CH (CH3) -0-2 '和 4 ‘ -C-H (CH2OCH3) —0-2 ‘(见 2008 年 7 月 15 日授权的美国专利 7, 399, 845) ；4' -CH2-N(OCH3)-2 ‘(见 PCT/US2008/064591) ;4' -CH2-O-N(CH3)-2 ‘(见 2004年9 月 2 日公布的美国申请 US2004-0171570) ;4' -CH2-N(R) -0-2'(见 2008 年 9 月 23 日授权的美国专利 7，427，672) ；4 ‘ -CH2-C (CH3) -2'和 4 ‘ -CH2-C- ( = CH2) -2'(见 PCT/US2008/066154)；其中，R独立地为H、C1-C12烷基或保护基团。各前述BNA包括各种 立体化学糖构型，包括，例如，α -L-呋喃核糖和β -D-呋喃核糖(见，1999年3月25日作 为 W 99/14226 公布的 PCT 国际申请 PCT/DK98/00393)。在一些实施方案中，通过使用糖替代物取代核基环来修饰核苷。这样的修饰包括 但不限于使用诸如吗啉环、环己烯基环、环己基环的替代物环系统(有时也称为DNA类似 物)或诸如具有下列式中的一种的四氢吡喃基环取代核基环许多其他可用于掺入反义化合物而修饰核苷的双环和三环糖替代物环系统也是 本领域已知的(见，例如，综述论文Leumarm，ChristianJ.)。这样的环系统可进行不同另 外的取代以增强活性。用于制备修饰的糖的方法为本领域的技术人员公知。在具有修饰的糖部分的核苷酸中，保持核碱基部分(天然、修饰的或其组合)与合 适的核酸靶杂交。在一些实施方案中，靶向因子9核酸的反义化合物包括具有修饰的糖部分的一种 或多种核苷酸。在一些实施方案中，修饰的糖部分是2' -Μ0Ε。在一些实施方案中，2' -MOE修饰的核苷酸以gapmer基序配置。修饰的核碱基核碱基(或碱基)修饰或取代可在结构上区别于天然存在的或合成的未修饰的核 碱基但功能上可与之互换。天然和修饰的核碱基能够参与氢键键合。这样的核碱基修饰可 赋予反义化合物核酸酶稳定性、结合亲和力或一些其他有益的生物特性。修饰的核碱基包 括合成的核天然的核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)。一些核碱基取代，包括5-甲基胞 嘧啶取代，特别可用于增加反义化合物对于靶核酸的结合亲和力。例如，5-甲基胞嘧啶显示 增加核酸双链体的稳定性0. 6-1. 20C (Sanghvi，Y. S.，Crooke, S. T.以及Lebleu，B.编辑， Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993,第 276-278 页)。其他未修饰的核碱基包括5_羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、 腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其他烷基 衍生物，2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶以及2-硫胞嘧啶，5-卤素尿嘧啶以及5-卤素胞嘧啶， 5_丙炔基(-C ε C-CH3)尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物，6-偶 氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶以及6-偶氮胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4_硫尿嘧啶，8-卤 素、8-氨基、8-巯基、8-巯基烷基、8-羟基以及其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤素特别 是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶核胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤， 2-F-腺嘌呤，2-氨基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-去氮鸟嘌呤和7-去氮腺 嘌呤，以及3-去氮鸟嘌呤和3-去氮腺嘌呤。杂环碱基部分还可包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环取代的那些，例如，7-去 氮杂_腺嘌呤、7-去氮杂鸟嘌呤、2-氨基吡啶以及2-吡啶酮。特别可用于增强反义化合物 的结合亲和力的核碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6以及0-6取代的嘌 呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶、以及5-丙炔基胞嘧啶。在一些实施方案中，靶向因子9核酸的反义化合物包括一种或多种修饰的核碱 基。在一些实施方案中，间隙加宽的靶向因子9核酸的反义寡核苷酸包括一种或多种修饰 的核碱基。在一些实施方案中，修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。在一些实施方案中，各胞 嘧啶是5-甲基胞嘧啶。用于制备药物组合物的组分和方法可将反义寡核苷酸与药学上可接受的活性或惰性物质混合用于制备药物组合物 或制剂。用于制备药物组合物的组分和方法取决于多个标准，包括但不限于，给药途径、病 变范围或待给药的剂量。可将靶向因子9核酸的反义化合物与合适的药学上可接受的稀释剂或载体组合 而将所述反义化合物用于药物组合物。药学上可接受的稀释剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)。 PBS是一种适用于胃肠外给药的组合物的稀释剂。因此，在一个实施方案中，包含靶向因子 9核酸的反义化合物和药学上可接受的稀释剂的药物组合物用于本发明描述的方法。在一 些实施方案中，药学上可接受的稀释剂是PBS。在一些实施方案中，反义化合物是反义寡核 苷酸。包含反义化合物的药物组合物包括药学上可接受的盐、酯、或所述酯的盐，或当给 药至动物包括人类能够提供(直接或间接)生物活性代谢物或其残基的任何其他寡核苷 酸。因此，例如，本发明还涉及药学上可接受的反义化合物的盐、前药、药学上可接受的所述
20前药的盐以及其他生物等同物。合适的药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾盐。前药可包括在反义化合物的一端或两端掺入另外的核苷，所述核苷在体内被内源 性核酸酶裂解而形成活性的反义化合物。结合的反义化合物反义化合物可与提高所得反义寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的一种或多 种部分或结合物共价连接。典型的结合基团包括胆固醇部分和脂质部分。另外的结合基团 包括碳水化合物、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸酯、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素、以 及染料。还可对反义化合物修饰以具有一个或多个稳定的基团，所述稳定的基团通常与反 义化合物的一端或两端连接而提高诸如核酸酶稳定性的特性。稳定基团中包括帽结构。这 些末端修饰包含具有末端核酸的反义化合物免受外切核酸酶降解，且可有助于在细胞内递 送和/或定位。帽可存在于5'-端(5'-帽)或3'-端(3'-帽)，或可存在于两端。 帽结构为本领域公知，包括，例如倒置的脱氧无碱基帽。其他可用于在反义化合物的一端 或两端形成帽而赋予核酸酶活性的3'和5'稳定基团包括2003年1月16日公布的WO 03/004602中公开的那些。细胞培养和反义化合物处理反义化合物对于因子9核酸的水平、活性或表达的作用可在多种细胞类型中在体 外检测。用于这样的分析的细胞类型可获得自商业出售者(例如，美国模式培养物保藏中 心，Manassus, VA ；Zen-Bio,Inc. ,Research Triangle Park, NC ；Clonetics Corporation, WalkerSVille，MD)，根据出售者的说明书使用可商购获得的试剂(例如，Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)培养细胞。例证的细胞类型包括H印G2细胞、！fepB3细胞以 及原代肝细胞。反义寡核苷酸的体外检测本发明描述了使用反义寡核苷酸处理细胞的方法，所述方法可被适当修改用以适 用于其他反义化合物处理。通常，当细胞在培养中达到约60-80%汇集时，使用反义寡核苷酸处理细胞。通常用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的试剂包括阳离子脂质转染 试剂LIPOFECTIN (Invitrogen, Carlsbad, CA)。将反义寡核苷酸与处于 OPTI-MEM Klnvitrogen，Carlsbad, CA)中的LIPOFECTIN 一起混合，以达 到所需的反义寡核苷酸的最终浓度和通常在每IOOnM反义寡核苷酸2-12ug/mL范围的 LIPOFECTIN 的浓度。另一种用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的试剂包括 LIPOFECTAMINE (Invitrogen, Carlsbad, CA)。将反义寡核苷酸与 处于减少OPTI- MEM ι的血清培养基(Invitrogen，Carlsbad, CA)中的 LIPOFECTAMINE —起混合，以达到所需的反义寡核苷酸的最终浓度和通常在每 IOOnM反义寡核苷酸2-i2ug/mL范围的LIPOFECTAMINE 的浓度。另一种用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的技术包括电穿孔。通过常规方法使用反义寡核苷酸处理细胞。通常在反义寡核苷酸处理之后16-24 小时收获细胞，在该时间通过本领域已知和本发明描述的方法测量靶核酸的RNA或蛋白质
21水平。通常，以多次重复进行处理，将数据表示为重复处理的平均值。所使用的反义寡核苷酸的浓度在细胞系间不同。确定特定细胞系的最佳反义寡核 苷酸浓度的方法为本领域公知。当使用LIPOFECTIN 转染时通常以InM至300nM范 围的浓度使用反义寡核苷酸。当使用电穿孔转染时通常以625nM至20，OOOnM范围的较高 浓度使用反义寡核苷酸。RNA 分离可对细胞总RNA或po 1 y (A) +mRNA进行RNA分析。RNA分离的方法为本领域公 知。使用本领域公知的方法制备RNA，例如，根据制造商的推荐方案使用TRIZOL 试剂 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 0靶水平或表达抑制的分析可使用本领域已知的多种方式来测定因子9核酸的水平或表达的抑制。例如，可 通过，例如RNA印迹分析、竞争性逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)或定量实时RT-PCR来对靶 核酸水平进行定量。可对细胞总RNA或poly (A) +mRNA进行RNA分析。RNA分离的方法为本 领域公知。RNA印迹分析也是本领域常规方法。可使用可商购获得的ABI PRISM 7600、 7700、或 7900 序列检测系统(可自 PE-Applied Biosystems, Foster City, CA 商购获得) 根据制造商的说明书方便地实施实时RT-PCR。靶RNA水平的定量实时RT-PCR分析可使用ABI PRISM 7600,7700,或 7900 序列检测系统(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)根据制造商的说明书来进行定量实时RT-PCR以实施靶RNA 水平的定量。实时RT-PCR的方法为本领域公知。在实时PCR之前，使分离的RNA进行逆转录(RT)反应，产生互补的DNA(cDNA)并 之后用作实时PCR扩增的底物。RT和实时PCR反应在相同样品孔中顺序进行。RT和实时 PCR试剂获得自Invitrogen (Carlsbad，CA)。通过本领域的技术人员公知的方法进行RT和 实时PCR反应。通过实时RT-PCR获得的基因(或RNA)靶定量使用下述方法来标准化使用其表 达恒定的基因的表达水平，例如亲环素A，或使用RIBOGREEN (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA)对总RNA进行定量。通过实时RT-PCR通过与靶同时运行、复式运行或分开 运行对亲环素A表达进行定量。使用RIBOGREEN RNA定量试剂(Invetrogen，Inc. Eugene, OR)对总RNA进行定量。通过RIBOGREEN 进行RNA定量的方法在Jones， L. J.等人(Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374)中教导。CYTOFLUOR 4000 仪器(PE Applied Biosystems)用于测量RIBOGREEN 荧光素。将探针和引物设计成与因子9核酸杂交。设计实时RT-PCR的探针和引物的方法 为本领域公知，包括使用诸如I3RIMER EXPRESS 软件(Applied Biosystems, Foster City, CA)的软件。蛋白质水平的分析可通过测量因子9蛋白质水平来评估因子9核酸的反义抑制。可以以本领域公知 的多种方式来评估或定量因子9蛋白质水平，例如免疫沉淀、蛋白质印迹分析(免疫印迹)、 酶联免疫吸附测定(ELISA)、定量蛋白质测定、蛋白质活性测定(例如，级联活性测定)、免 疫组织化学、免疫细胞化学或荧光激活细胞分选术(FACS)。针对靶的抗体可被鉴定和获自多种来源，例如MSRS目录抗体(Aerie Corporation, Birmingham, MI)，或可通过本领域公 知的传统单克隆或多克隆抗体生成方法来制备。用于检测人类和小鼠因子9的抗体可商购获得。反义化合物的体内检测可检测动物中的反义化合物，例如反义寡核苷酸，以评估其抑制因子9的表达和 产生表现改变的能力，所述表现改变例如PT延长、aPTT时间延长、血小板因子4(PF-4)的 定量减少、血栓形成减少或血栓形成时间增加以及细胞增殖减少。可在正常动物中或在实 验性疾病模型中进行检测。对于对动物的给药，将反义寡核苷酸在药学上可接受的稀释剂 中配制，例如磷酸盐缓冲盐水。给药包括胃肠外途径给药，例如腹膜内、静脉以及皮下。反 义寡核苷酸剂量和给药频率的计算在本领域的技术人员的能力范围内，取决于诸如给药途 径和动物体重的因素。在使用反义寡核苷酸治疗一段时间之后，从肝脏组织分离RNA，并测 量因子9核酸表达的改变。还用血栓形成测定来测量因子9蛋白质水平的改变。另外，使 用来自治疗的动物的血浆来测定凝血时间，例如PT和aPTT。一些适应症在一些实施方案中，本发明提供了治疗个体的方法，包括进行本发明的一种或多 种药物组合物的给药。在一些实施方案中，所述个体具有血栓栓塞并发症。在一些实施方案 中，所述个体处于凝血病症的危险中，包括但不限于梗塞、血栓形成、栓塞、血栓栓塞，例如 深静脉栓塞、肺栓塞、心肌梗塞以及中风。这包括具有导致血栓形成的危险的获得性问题、 疾病或病症的个体，例如，手术、癌症、不活动、败血症、动脉粥样硬化、心房纤维颤动以及遗 传易感，例如抗磷脂综合征和常染色体显性遗传病、因子V莱顿突变。在一些实施方案中， 所述个体被确认为是具有抗凝治疗需要。这样的个体的实例包括但不限于进行大型矫形手 术的那些(例如，髋/膝置换手术或髋骨折手术)和具有慢性治疗需要以防止中风的患者 (例如患有心房纤维颤动的那些)。在一些实施方案中，本发明提供了用于预防性降低个体 中因子9表达的方法。一些方法包括通过对有其需要的个体施用治疗有效量的靶向因子9 核酸的反义化合物来治疗所述个体。在一个实施方案中，治疗有效量的靶向因子9核酸的反义化合物的给药伴随对个 体血清中因子9水平的监测，以确定个体对所述反义化合物给药的反应。医师使用个体对 所述反义化合物给药的反应来确定治疗干扰的量和持续时间。在一些实施方案中，靶向因子9核酸的反义化合物的给药导致因子9表达降低至 少 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、95%或99%，或由这些数值中的任何两个限定的范围。在一些实施方案中，靶向因子 9核酸的反义化合物的给药导致由标准检测所测量的血液凝固测量值改变，例如但不限于 活化部分凝血激酶时间(aPTT)检测、凝血酶原时间(PT)检测、凝血酶时间(TCT)、流血时间 或D-二聚体。在一些实施方案中，因子9反义化合物的给药增加测量值至少15%、20%、 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 99%，或由这些数值中的任何两个限定的范围。在一些实施方案中，因子9反义化合物的给 药减少测量值至少 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%或99%，或由这些数值中的任何两个限定的范围。在一些实施方案中，包含靶向因子9的反义化合物的药物组合物用于制备用于治疗患有或易患血栓栓塞并发症的药剂。一些联合疗法在一些实施方案中，将本发明的一种或多种药物组合物与一种或多种其他药剂随 同给药。在一些实施方案中，将这样的一种或多种其他药剂设计成治疗与使用本发明的一 种或多种药物组合物相同的疾病、病症或紊乱。在一些实施方案中，将这样的一种或多种其 他药剂设计成治疗与使用本发明的一种或多种药物组合物不同的疾病、病症或紊乱。在一 些实施方案中，将这样的一种或多种其他药剂设计成治疗本发明的一种或多种药物组合物 的不想要的副作用。在一些实施方案中，将本发明的一种或多种药物组合物与另一种药剂 随同给药以治疗其他药剂的副作用。在一些实施方案中，将本发明的一种或多种药物组合 物与另一种药剂随同给药以产生组合作用。在一些实施方案中，将本发明的一种或多种药 物组合物与另一种药剂随同给药以产生协同作用。在一些实施方案中，本发明的一种或多种药物组合物与一种或多种其他药剂在相 同时间给药。在一些实施方案中，本发明的一种或多种药物组合物与一种或多种其他药剂 在不同时间给药。在一些实施方案中，将本发明的一种或多种药物组合物与一种或多种其 他药剂一起制备在单一制剂中。在一些实施方案中，将本发明的一种或多种药物组合物与 一种或多种其他药剂分开制备。在一些实施方案中，可与本发明的一种或多种药物组合物随同给药的药剂包括抗 凝剂或抗血小板剂。在一些实施方案中，可与本发明的一种或多种药物组合物随同给药的 药剂包括但不限于阿司匹林、氯吡格雷、双嘧达莫、噻氯匹定、华法林(和相关的香豆素)、 肝素、直接的凝血酶抑制剂(例如来匹卢定、比伐卢定)、阿匹沙班(apixaban)、依诺肝素 (Iovenox)以及直接干扰特定凝血因子酶促作用的小分子化合物(例如，干扰因子Xa的利 伐沙班(rivaroxaban))。在一些实施方案中，在进行本发明药物组合物给药前进行抗凝剂 或抗血小板剂的给药。在一些实施方案中，抗凝剂或抗血小板剂的给药在本发明药物组合 物给药之后进行。在一些实施方案中，抗凝剂或抗血小板剂的给药在本发明药物组合物给 药的相同时间进行。在一些实施方案中，随同给药的抗凝剂或抗血小板剂的剂量与所述抗 凝剂或抗血小板剂的单独给药的情况下的给药剂量相同。在一些实施方案中，随同给药的 抗凝剂或抗血小板剂的剂量低于所述抗凝剂或抗血小板剂的单独给药的情况下的给药剂 量。在一些实施方案中，随同给药的抗凝剂或抗血小板剂的剂量大于所述抗凝剂或抗血小 板剂的单独给药的情况下的给药剂量。在一些实施方案中，第二化合物随同给药提高第一化合物的抗凝作用，使得化合 物随同给药导致大于第一化合物单独给药的作用的抗凝作用。在其他实施方案中，随同给 药导致化合物单独给药的作用累加的抗凝作用。在一些实施方案中，随同给药导致化合物 单独给药的作用超累加的抗凝作用。在一些实施方案中，所述第一化合物是反义化合物。在 一些实施方案中，所述第二化合物是反义化合物。在一些实施方案中，在因子9特异性抑制剂给药之后的任何时间进行解毒剂给 药。在一些实施方案中，在靶向因子9的反义寡核苷酸给药之后的任何时间进行解毒剂给 药。在一些实施方案中，在靶向因子9的反义化合物给药之后的几分钟、几小时、几天、几周 或几个月进行解毒剂给药。在一些实施方案中，解毒剂与靶向因子9的反义化合物互补(例 如有义链)。在一些实施方案中，解毒剂是因子9或因子9a蛋白。在一些实施方案中，因子9或因子9a蛋白是人类因子9或因子9a蛋白。实施例非限制性声明和参考引用尽管已经根据一些实施方案专门描述了本发明所述的一些化合物、组合物以及方 法，下列实施例仅用以描述本发明所述化合物且非旨在对其限制。本申请中所引用的各参 考文献通过引用整体并入。实施例1 人类因子9的反义抑制猕猴原代肝细胞检测靶向因子9核酸的反义寡核苷酸在体外对于因子9mRNA的作用。使用150nM 反义寡核苷酸处理96孔培养板中每孔35，000个细胞密度的猕猴原代肝细胞。在大约16 小时的处理时间之后，如本发明所述，从细胞分离RNA，并通过定量实时PCR测量mRNA水平。 因子9引物探针组ABI F9用于测量mRNA水平。根据RIBOGREEN 测量的总RNA含 量调整因子9mRNA水平。在表1中，将结果表示为相对于未处理的对照细胞的因子9的抑 制百分数。将反义寡核苷酸设计为5-10-5gapmer，其中间隙片段包含2'-脱氧核苷酸，各侧 翼片段包含2' -MOE核苷酸。“5'靶位点”表示反义寡核苷酸靶向的SEQ ID NO :1 (GENBANK 登录号 NT_011786. 15 的核苷酸 22823000 至 22858000)或 SEQ ID NO 2 (GENBANK 登录号 AB186358. 1)的5'最末端核苷酸。表 1具有5-10-5M0E侧翼和脱氧间隙的嵌合寡核苷酸对人类因子9mRNA水平的抑制
权利要求
一种化合物，其包含由12至30个连接的核苷构成的且具有核碱基序列的修饰的寡核苷酸，其中，所述核碱基序列包含与SEQ IDNO1的核苷酸33230至33313的相同数目的碱基互补的至少12个连续的核碱基部分；所述修饰的寡核苷酸与SEQ ID NO1至少80％互补。
2.根据权利要求1所述的化合物，其由修饰的单链寡核苷酸构成。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中，所述修饰的寡核苷酸包含由SEQID N0:52、 SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 54以及SEQ IDNO : 118构成的组中的任何核碱基序列。
4.根据权利要求2所述的化合物，其中，所述修饰的寡核苷酸与SEQID N0:1的核碱 基序列至少90%互补。
5.根据权利要求2所述的化合物，其中，所述修饰的寡核苷酸与SEQID N0:1的核碱 基序列100%互补。
6.根据权利要求2所述的化合物，其中，所述修饰的寡核苷酸中的至少一个核苷间键 为修饰的核苷间键。
7.根据权利要求6所述的化合物，其中，各核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。
8.根据权利要求2所述的化合物，其中，至少一个核苷包含修饰的糖。
9.根据权利要求8所述的化合物，其中，至少一个修饰的糖为双环糖。
10.根据权利要求8所述的化合物，其中，至少一个修饰的糖包含2’-0-甲氧乙基。
11.根据权利要求2所述的化合物，其中，至少一个核苷包含修饰的核碱基。
12.根据权利要求11所述的化合物，其中，所述修饰的核碱基为5-甲基胞嘧啶。
13.根据权利要求2所述的化合物，其中，所述修饰的寡核苷酸包括 由连接的脱氧核苷构成的间隙片段；由连接的核苷构成的5’侧翼片段； 由连接的核苷构成的3’侧翼片段；其中，所述间隙片段紧邻5'侧翼片段和3'侧翼片段且位于5'侧翼片段和3'侧翼 片段之间；各侧翼片段的各核苷包含修饰的糖。
14.根据权利要求13所述的化合物，其中，所述修饰的寡核苷酸包括 由10个连接的脱氧核苷构成的间隙片段；由5个连接的核苷构成的5’侧翼片段； 由5个连接的核苷构成的3’侧翼片段；其中，所述间隙片段紧邻5'侧翼片段和3'侧翼片段且位于5'侧翼片段和3'侧翼 片段之间；各侧翼片段的各核苷包含2’-0_甲氧乙基糖；以及各核苷间键为硫代磷酸酯键。
15.根据权利要求2所述的化合物，其中，所述修饰的寡核苷酸由20个连接的核苷构成。
16.一种组合物，其包含权利要求1所述的化合物或其盐和药学上可接受的载体或稀 释剂。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中，所述修饰的寡核苷酸由修饰的单链寡核苷 酸构成。
18.根据权利要求18所述的组合物，其中，所述修饰的寡核苷酸由20个连接的核苷构成。
19.一种方法，其包括对动物进行一种化合物的给药，所述化合物包含由12至30个 连接的核苷构成的修饰的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括与SEQ ID NO :1的核苷酸33230至 33313的相同数目的碱基互补的至少12个连续的核碱基部分，其中所述修饰的寡核苷酸与 SEQID NO 1 至少 80% 互补。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述动物是人类。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述给药预防深静脉血栓形成。
22.根据权利要求20所述的方法，其中，所述给药预防肺栓塞。
23.根据权利要求20所述的方法，其包括进行所述化合物和选自下列任何药剂的随同 给药阿司匹林、氯吡格雷、双嘧达莫、肝素、来匹卢定、噻氯匹定、华法林、阿匹沙班、利伐沙 班、以及依诺肝素。
24.根据权利要求20所述的方法，其中，进行所述化合物和选自下列任何药剂的伴随 给药阿司匹林、氯吡格雷、双嘧达莫、肝素、来匹卢定、噻氯匹定、华法林、阿匹沙班、利伐沙 班、以及依诺肝素。
25.根据权利要求20所述的方法，其中，所述给药是胃肠外给药。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述胃肠外给药为皮下给药或静脉给药的任 何种类。
27.一种方法，其包括鉴定处于血栓栓塞并发症危险中的动物，并且对该危险动物进行治疗有效量的化合物的给药，所述化合物包含由12至30个连接的 核苷构成的修饰的寡核苷酸，其中，所述修饰的寡核苷酸与因子9核酸互补。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述血栓栓塞并发症为深静脉血栓、肺栓塞、 或其组合。
全文摘要
本发明公开了用于在具有其相应需要的个体中减少因子9并增加凝血时间的反义化合物和方法。可使用靶向因子9的反义化合物给药而改善的疾病状况的实例包括血栓形成、栓塞、血栓栓塞，诸如深静脉血栓形成、肺栓塞、心肌梗塞以及中风。
文档编号C12N15/113GK101984759SQ200880124483
公开日2011年3月9日 申请日期2008年11月5日 优先权日2007年11月9日
发明者布雷特·P·莫尼亚, 张宏, 苏珊·M·弗赖尔, 赵晨光 申请人:Isis药物公司