抑郁症的调节因子及其应用的制作方法【专利摘要】本发明提供了抑郁症的调节因子及其应用。具体地，本发明提供了βCaMKII抑制剂在制备预防和/或治疗抑郁症的药物中应用。本发明的研究表明，在外侧缰核过表达βCaMKII(而非αCaMKII)可诱导出快感缺乏和行为绝望的核心抑郁症状。在外侧缰核下调βCaMKII的表达水平，降低它的激酶活性或者阻断它的下游分子GluR1则可以逆转动物的抑郁表型。【专利说明】抑郁症的调节因子及其应用【
技术领域：
】[0001]本领域涉及生物技术及医药领域，特别地，涉及抑郁症的调节因子及其应用。【
背景技术：
】[0002]重度抑郁症（MDD)，是最常见和最致残的精神疾病之一，其具有以下特点，心情低落，动力缺失，绝望，无法感受开心，也被称为快感缺乏（1)。对于导致MDD的原因，现今观点认为，在响应外界刺激比如压力时，特定大脑环路的神经活动发生了改变。而这种改变是由于特定分子及细胞水平的变化所引起的。最近，外侧缰核（LHb)，作为从边缘前脑向众多单胺中心传递信息的核心脑区，已经成为抑郁症病理生理学和治疗研究的关键大脑区域。LHb神经元被厌恶情绪激活，包括压力，沮丧，恐惧或预期的负回报。与之一致的是，神经影像学研究已经确定了在抑郁状态下缰核活跃度的提高。此外，最近的一项研究发现，在动物抑郁模型中，突触活性和LHb神经元峰值输出都得到增强。然而LHb中这些异常细胞过程的分子机制以及诱导抑郁症的刺激如压力如何导致这些变化的产生仍然需要研究确定。[0003]为了对抑郁症进行预防和治疗，本领域迫切需要抑郁症调节的相关因子及其作用机制，并开发可用于预防和/或治疗抑郁症的药物。【
发明内容】[0004]本发明的目的就是提供可用于预防和/或治疗抑郁症的活性成分和药物[0005]在本发明的第一方面，提供了一种βCaMKII抑制剂的用途，用于制备预防和/或治疗抑郁症的药物。[0006]在另一优选例中，所述的抑制剂选自下组：[0007]⑴干扰βCaMKII表达的干扰RNA或其前体；[0008](ii)激酶活性下降或丧失的突变型βCaMKII蛋白或其编码序列；[0009](iii)抑制βCaMKII活性的抑制剂；[0010](iv)βCaMKII的竞争性抑制剂；[0011](V)抗βCaMKII的抗体；[0012](vi)阻遏βCaMKII调控AMPARGluRl通路的拮抗剂。[0013]在另一优选例中，所述的干扰RNA是βRNAi(SEQIDNO.:1，5'-GAGTATGCAGCTAAGATCA-3'）。[0014]在另一优选例中，所述的突变型βCaMKII蛋白是βCaMKII蛋白显性失活因子，较佳地为PK43R(WaymanGAetal.2011)。[0015]在另一优选例中，所述的PCaMKII的抑制剂包括KN-93、KN-62、AC3-I(Autocamtide-3DerivedInhibitoryPeptide)、Ant_AIP-II(Autocamtide-2RelatedInhibitoryPeptideII，CelI-permeable)〇[0016]在另一优选例中，所述组分（vi)是AMPARGluRl的显性失活因子，较佳地为GluRICt。[0017]在另一优选例中，所述的抑制剂或拮抗剂包括以下形式：多核苷酸、多肽、表达载体、小分子化合物、或其组合。[0018]在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：病毒载体。[0019]在另一优选例中，所述的βCaMKII抑制剂还用于制备降低外侧缰核的神经元峰电位输出的药物和/或降低外侧缰核的突触效能的药物。[0020]在另一优选例中，所述药物是靶向作用于外侧缰核的药物，或所述药物是施用于外侧缰核区域或附近区域的药物。[0021]在本发明的第二方面，提供了一种可用于预防和/或治疗抑郁症的药物组合物，所述的药物组合物包括：[0022]药学上可接受的载体；和[0023]有效量活性成分，其中所述的活性成分为βCaMKII抑制剂或拮抗剂。[0024]在另一优选例中，所述的活性成分对aCaMKII基本上无抑制/拮抗作用。[0025]在另一优选例中，所述的活性成分对δCaMKII基本上无抑制/拮抗作用。[0026]在另一优选例中，所述的活性成分对YCaMKII基本上无抑制/拮抗作用。在另一优选例中，所述的活性成分对YCaMKII有抑制/拮抗作用。[0027]在另一优选例中，所述的活性成分选择性抑制βCaMKII，而对其他CaMKII(包括aCaMKII、YCaMKII、和δCaMKII)无或基本上无抑制/拮抗作用。[0028]在另一优选例中，所述PCaMKII抑制剂或拮抗剂选自下组：PCaMKII-RNAi、βK43R、KN-93、KN-62、AC3-I(Autocamtide-3DerivedInhibitoryPeptide)、Ant-AIP-II(Autocamtide-2RelatedInhibitoryPeptideII，Cell-permeable)〇[0029]在另一优选例中，所述的药物组合物为口服制剂、注射剂、靶向制剂等。[0030]在本发明的第三方面，提供了一种βCaMKII蛋白或其编码序列和/或βCaMKII促进剂的用途，它被用于制备一试剂或组合物，所述试剂或组合物用于构建抑郁症动物模型。[0031]在另一优选例中，所述的抑郁症动物模型中，PCaMKII是高表达的。[0032]在另一优选例中，所述的抑郁症动物模型中，βCaMKII在外侧缰核中是高表达的。[0033]在另一优选例中，所述的高表达（按mRNA水平或蛋白水平）指彡150%，较佳地彡200%，更佳地彡200%。[0034]在另一优选例中，所述高表达（按mRNA水平或蛋白水平）的上限为<2000%、较佳地彡1000%、更佳地彡500%。[0035]在本发明的第四方面，提供了一种筛选用于预防和/或治疗抑郁症潜在物质的方法，包括步骤：[0036](1)给抑郁症动物模型施用待筛选的测试物，其中在所述抑郁症动物模型的外侧缰核中βCaMKII是高表达的；和[0037](2)观察所述抑郁症动物模型中的抑郁症的相关症状和/或指标，并与对照组进行比较；[0038]其中，所述抑郁症动物模型中抑郁症的相关症状有显著改善，则表示该测试物是可用于预防和/或治疗抑郁症潜在物质。[0039]在另一优选例中，所述的动物模型为非人哺乳动物，如啮齿动物、兔、灵长动物。[0040]在另一优选例中，在步骤（2)，通过动物行为学实验观察抑郁症状。[0041]在另一优选例中，所述的动物行为学实验选自下组：习得无助实验、强制游泳实验、蔗糖偏好实验、悬尾实验、新奇抑制摄食实验。[0042]在另一优选例中，所述的症状选自下组：习得无助（按杠杆次数减少）、放弃游泳提早且静止时间增加、糖水消耗减少、挣扎减少、摄食抑制增加。[0043]在另一优选例中，所述的指标包括：βCaMKII的表达水平、βCaMKII的活性水平。[0044]在另一优选例中，所述的施用（或给药）包括口服施用。[0045]在另一优选例中，所述的对照组包括：阴性对照组和/或阳性对照组。[0046]在另一优选例中，所述的阴性对照组包括：未施用测试物的对照组；或施用测试物之前的同一试验组。[0047]在本发明的第五方面，提供了一种筛选用于预防和/或治疗抑郁症潜在物质的方法，包括步骤：[0048](1)在测试组中，向体外检测体系中加入待检测的测试物；和[0049](2)检测所述测试组的体外检测体系中βCaMKII的表达水平和/或活性，并与阴性对照组进行比较；[0050]其中，如果与加入了阴性对照组相比，测试组中PCaMKII的表达水平显著下降，和/或βCaMKII的活性显著下降，则表示所述测试物是预防和/或治疗抑郁症的潜在物质。[0051]在另一优选例中，所述的体外检测体系包括细胞体系；较佳地为神经元细胞体系；较佳地为外侧缰核神经元体系。[0052]在另一优选例中，所述的显著下降指，与阴性对照相比，测试组中PCaMKII的表达水平或活性是阴性对照组的5-90%，较佳地10-60%，更佳地20-50%。[0053]在另一优选例中，所述的步骤（2)还包括与阳性对照组进行比较。[0054]在另一优选例中，所述方法还包括以下一个或多个步骤：[0055]对上一步骤筛选出的潜在物质，进一步测试其对GluRl的膜部分的影响；[0056]对上一步骤筛选出的潜在物质，施用于动物模型，观察其对抑郁症症状的影响。[0057]在另一优选例中，在测试其对GluRl的膜部分的影响时，如果与阴性对照组（或空白对照组）相比，加入或施用所述测试物的测试组中GluRl含量降低，则表示该测试物是预防和/或治疗抑郁症的潜在物质。[0058]在另一优选例中，所述的GluRl含量是在神经元细胞膜上的GluRl含量。[0059]在本发明的第六方面，提供了一种GluRl抑制剂的用途，用于制备预防和/或治疗抑郁症的药物。[0060]在另一优选例中，所述药物还用于降低外侧缰核的神经元峰电位输出和突触效能。[0061]在另一优选例中，所述的GluRl抑制剂是βCaMKII抑制剂。[0062]在另一优选例中，所述的GluRl抑制剂是GluRl的竞争性抑制剂，包括显性失活因子，较佳地为GluRlCt。[0063]在另一优选例中，所述的GluRl抑制剂选自下组：多核苷酸、多肽、表达载体、小分子化合物、或其组合。[0064]在本发明的第七方面，提供了一种预防和/或治疗抑郁症的方法，包括步骤：给需要的对象施用安全有效量的βCaMKII抑制剂。[0065]在另一优选例中，所述的施用是施用于外侧缰核区域。[0066]在本发明的第八方面，提供了一种降低神经元峰电位输出和突触效能的方法，包括步骤：给需要的对象施用安全有效量的βCaMKII抑制剂。[0067]在另一优选例中，所述的对象是哺乳动物，包括啮齿动物（如大鼠、小鼠）、灵长动物（如人）。[0068]在另一优选例中，所述的施用是施用于外侧缰核区域。[0069]在本发明的第九方面，提供了一种预防和/或治疗抑郁症的方法，包括步骤：给需要的对象施用安全有效量的GluRl抑制剂。[0070]在另一优选例中，所述的施用是施用于外侧缰核区域。[0071]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。【专利附图】【附图说明】[0072]图1显示了抑郁大鼠LHb中βCaMKII的上调。（A)cLH大鼠的抑郁症表型。数字代表所用动物数量。LH测试中，最大压力数设置为15。（B)基于稳定同位素标记的高通量定量蛋白质组学实验略图。简要地，未标记的缰核（14N)WT或cLH大鼠进行解剖，匀化，并以1:1的比例与15N标记的大鼠总脑组织匀浆混合。浓缩膜部分，500g蛋白质样品被用于标准质谱分析。计算每个已鉴定肽段的14N/15N比例。比较cLH和对照组每个蛋白质肽段比率详情请看方法部分。（C)在3个独立的蛋白质组学运行中确定βCaMKII的蛋白质组学分析，基于总的肽段，或独特的肽段（不为家系里其他成员所共有的肽段）。（D，E)Westernblot分析显示在cLH大鼠缰⑶或的海马（E)膜部分PCaMKII的变化。组织的大量微管蛋白被用作加载控制。蛋白表达进行定量标准化。（F)缰中PCaMKIImRNA的qPCR分析。（G)外侧缰核部分（LHb)中CaMKII水平增加，如左边IHC图像和右边定量图所示。比例尺，200μm。(H)在急性习得无助和慢性应激（CMS)抑郁模型中βCaMKII水平增加。ALH和ANLH为受到LH压力的大鼠组，但ALH)表现LH症状，ANLH没有表现LH症状。（I)Westernblot分析显示cLH大鼠用生理盐水或抗抑郁药丙咪嗪处理后缰膜部分中PCaMKII水平。数据是平均值土SEM。*P〈0.05，#P〈0.01，*#P〈0.001与对照组相比。N.S.表示差异不显著。其他的图标相同。[0073]图2显示了小鼠和大鼠中βCaMKI(而非aCaMKII)的过表达引起抑郁行为。（A)AAV载体工程改造用来过表达控制结构，PCaMKII，aCaMKII，或激酶死亡突变体PCaMKII的示意图。ITR，反向末端重复序列；巨细胞病毒（CMV)，巨细胞病毒启动子；Ubi:泛素启动子；2A:允许多种非融合蛋白翻译的病毒2A连接肽。（B)WT小鼠或大鼠用于行为测试的实验范式。（C)小鼠LHb双边AAV-βCaMKII病毒注射图示（使用抗GFP和核标记Hoechst复染色）。比例尺，50μΜ.(D-I)动物抑郁模型，小鼠（D-G)和大鼠（Η，Ι)，动物LHb中表达不同病毒构建物对行为的影响。（F，G)对比LHb感染细胞分数绘制的在强迫游泳中标准化不动时间（F)或蔗糖偏好测试（G)。数据采用注射AAV对照小鼠平均值进行标准化。*P<0.05，**P〈0.01，***P〈0.OOl相比于未注射WT#P<0.05与AAV对照。[0074]图3显示了βCaMKII的过表达增强LHb神经元突触活性和的峰电位输出。（A)外侧缰核配对记录示意图（左图）。右图：在透射（顶部）和荧光（底部）光学显微镜下βCaMKII感染LHb神经元配对修补（绿色箭头）和相邻的未受感染神经元（红色箭头指出）。比例尺，10μΜ.⑶全细胞模式下检测到的对照组LHb神经元或AAV-βCaMKII、AAV-aCaMKII感染神经元的mEPSC痕迹示例。（C，D)mEPSC间期和平均频率的累积分布(左），被AAV-βCaMKII(C)或AAV-aCaMKII⑶感染神经元的mEPSC振幅（右）。每一行代表一对对照神经元和相邻的病毒感染神经元的值。（E)全细胞模式下检测到的对照组LHb神经元或AAV-βCaMKII、AAV-aCaMKII感染神经元的自发发放峰电位痕迹示例。（F，G)被AAVICaMKII(F)或AAV-aCaMKII(G)感染神经元的平均自发放电频率。[0075]图4显示了LHb中βCaMKII敲除能救治cLH大鼠的抑郁症表型和降低LHb神经元突触活度。（A)工程修饰用来过表达βCaMKII的RNAi的AAV载体示意图。Hl:人Hl启动子。（B)用βCaMKIIRNAi构建物特异性敲除βCaMKII而不是aCaMKII。在293tn细胞中pSUPER-βCaMKII-RNAi构建物是和AAV-βCaMKII或AAV-aCaMKII质粒共转染，并在western分析前先表达48小时。左：代表westernblot。右：敲除效果定量。（C)病毒侵染cLH大鼠行为测试的实验范式。（D-E)cLH大鼠LHb表达AAV-βRNAi和AAV-βK43R后强迫游泳试验（D)和习得无助测试（E，F)中的行为影响。（F)每类动物百分比。LH:彡5杆压迫习得无助大鼠。NLH:彡10杆压迫非习得无助大鼠。（G)亚病毒感染次区域表征。上图：AAVIRNAi病毒感染cLH大鼠脑片中外侧缰核（LHb-L)和内侧缰核（LHb-m)分区图例。比例尺，10010μM。下图：对比cLH大鼠LHb-I和LHb-m感染率绘制的在习得无助实验中行为响应。（H)cLH大鼠AAV-βRNAi感染LHb神经元mEPSCs发生改变。上图：mEPSC痕迹示例。被AAV-βRNAi感染LHb神经元的mEPSC间期和平均频率累积分布（左下），mEPSC振幅（右下）。*Ρ〈〇·05,**Ρ〈0·01，*#Ρ〈0·001跟cLH/AAV-对照比较[0076]图5显示了阻断GluRl-typeAMPA受体的突触结合（一个βCaMKII的下游分子）可减轻抑郁。（A，B)Westernblot分析显示cLH大鼠缰核蛋白提取物膜部分的GluRl的表达水平增加（A)，抗抑郁药丙咪嗪处理后明显下降（B)。（C)用AAV-0CaMKII-2A-GluRlCt病毒共同表达βCaMKII和GluRlCt增强了LHb中CaMKII和GluRl的免疫组织化学信号。右：IHC信号量化。比例尺，100μΜ.(D，Ε)双侧LHb内βCaMKII和GluRlCt共表达阻断了^CaMKII过表达引起的强迫游泳实验（D)和快感缺乏（E)表型。（F)模型图解：在正常状态下，LHb对VTA和DRN具有相对较弱抑制。在抑郁状态，压力引起的PCaMKII的表达水平上调，这导致GluRl膜运输增加，增加LHb神经元突触效能和峰电位输出。因此，LHb对于VTA和DRN的抑制被增强，进而导致快感缺乏及行为绝望。[0077]图6显示了蛋白质组学数据分析。（A)数据统计流程图.（B)标准化数据分布.（C)为了验证这一实验技术，一个样品被分成两个相同部分并在质谱仪上运行两次。两次实验重复数据相互比较，表现出高度相关。[0078]图7显示了经过蛋白质组学筛选鉴定的的候选蛋白表达水平八个上调（A)，四个下调（B)。值得注意的是，绝大部分表达上调蛋白为神经元中丰富的分子，绝大部分表达下调蛋白为参与基础代谢功能的催化分子。[0079]图8显示了表达水平上调候选蛋白的qRT-PCR验证结果。*ρ〈(λ05,#ρ〈(λ01与对照组相比[0080]图9显示了CamKII家族另外三个成员的测定结果。（A,B)western印迹分析显示cLH大鼠缰核（A)或海马⑶膜部分中的α-，δ-和Y-CaMKII的变化。[0081]图10显示了单侧注射病毒构建物的过表达水平估算的结果。（A)经由这三种病毒单侧注射的小鼠冠状闹切片示意图。顶部面板：用抗GFP(绿色）染色或直接可视化tdTomato(红色）的脑切片，Hoechst(蓝色）复染色的脑切片。左：非注射侧。右：注射侧。D3V:背第三室。底部面板：相同小鼠的相邻脑切片，用抗CamKII抗体染色，以用于B图中的定量化。（B)注射侧和非注射侧的CaMKII的信号强度比所代表过表达水平。11=5€(^4八￥-βCaMKII-2A-GFP，n=4forAAV-aCaMKII-2A-tdTomato和AAV-βCaMKII-K43R-2A-GFP.[0082]图11显示了小鼠LHb病毒靶向区域示意图.⑷大部分病毒表达所在的前后区域。左图为来自于注射AAV-PCaMKII病毒小鼠的脑切片示意图。右图为改编自Paxinos&Franklin2004图册的对应原理图。[0083]图12显示了注射不同病毒小鼠的开放场实验结果。㈧总位移距离。⑶开放场实验中中心停留时间。[0084]图13显示了LHb中异质性mEPSC响应图。（A)LHb不同子区域内mEPSC记录。每个点代表一个神经元的记录。mEPSC响应频率被颜色标注。（B)每个点代表该区域记录的一对神经元。各对神经元mEPSC频率的值都已标注。（C)图B所记录的成对神经元中一个神经元对比另一个神经元的mEPSC频率。值得注意的是，尽管位置不同，来自同一对的神经元表现出高度相同的mEPSC频率。[0085]图14显示了缰核蛋白裂解物全部或者膜部分GluRl的表达水平。（A)显示cLH大鼠和对照大鼠的缰核总组分或者膜部分GluRl水平变化的western印迹分析示意图。（B)GluRl水平变化的定量化。【具体实施方式】[0086]本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现βCaMKII是抑郁症的一个至关重要的调节因子，结合了分子、行为和电生理等手段，确定了PCaMKII是导致缰核过度活跃和行为抑郁的关键分子，在此基础上完成了本发明。[0087]具体地，在外侧缰核过表达βCaMKII(而非aCaMKII)不仅可以明显增强突出传递效率和外侧缰核神经元的动作电位输出，而且可以诱导出快感缺乏和行为绝望的核心抑郁症状。在外侧缰核下调PCaMKII的表达水平，降低它的激酶活性或者阻断它的下游分子GluRl则可以逆转动物的抑郁表型。以上结果表明PCaMKII是调节LHb神经元在抑郁症的病理发生中发挥功能的关键分子。[0088]定义[0089]如本文所用，术语CaMKII,是指钙调蛋白激酶II(CaMkinaseII)。[0090]如本文所用，术语"βCaMKII抑制剂"和"βCaMKII拮抗剂"可互换使用，都指能够抑制和/或拮抗βCaMKII的表达水平或蛋白活性、以及阻止或阻遏βCaMKII功能的物质。[0091]如本文所用，术语mEPSCs，是指微型兴奋性突出后电流。[0092]如本文所用，AMPAR,α-氛基-3-轻基_5_甲基_4_异恶唑丙酸（a-amin〇-3_hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionicacid(AMPA))受体[0093]方法[0094]本发明提供了一种筛选用于预防和/或治疗抑郁症潜在物质的方法，包括步骤：[0095](1)给抑郁症动物模型施用待筛选的测试物，其中在所述抑郁症动物模型中βCaMKII是高表达的；和[0096](2)观察所述抑郁症动物模型中的抑郁症的相关症状和/或指标，并与对照组进行比较；[0097]其中，所述抑郁症动物模型中抑郁症的相关症状有显著改善，则表示该测试物是可用于预防和/或治疗抑郁症潜在物质。[0098]另外，所述的动物模型为非人哺乳动物，如啮齿动物、兔、灵长动物。[0099]此外，在步骤（2)，通过动物行为学实验观察抑郁症状。所述的动物行为学实验包括：强迫游泳实验，蔗糖偏好实验，开放场实验。所述的指标包括：βCaMKII的表达水平、βCaMKII的活性水平。[0100]本发明还提供了另一种筛选用于预防和/或治疗抑郁症潜在物质的方法，包括步骤：[0101](1)在测试组中，向体外检测体系中加入待检测的测试物；和[0102](2)检测所述测试组的体外检测体系中βCaMKII的表达水平和/或活性，并与阴性对照组进行比较；[0103]其中，如果与加入了阴性对照组相比，测试组中PCaMKII的表达水平显著下降，和/或βCaMKII的活性显著下降，则表示所述测试物是预防和/或治疗抑郁症的潜在物质。所述的体外检测体系包括细胞体系；较佳地为神经元细胞体系。[0104]另外，所述的显著下降指，与阴性对照相比，测试组中PCaMKII的表达水平或活性是阴性对照组的5-90%，较佳地10-60%，更佳地20-50%。所述的步骤（2)还包括与阳性对照组进行比较。[0105]此外，所述方法还包括以下一个或多个步骤：[0106]对上一步骤筛选出的潜在物质，进一步测试其对GluRl的膜部分的影响；[0107]对上一步骤筛选出的潜在物质施用于动物模型，观察其对抑郁症症状的影响。[0108]在测试其对GluRl的膜部分的影响时，如果与阴性对照组（或空白对照组）相比，加入或施用所述测试物的测试组中GluRl含量降低，则表示该测试物是预防和/或治疗抑郁症的潜在物质。所述的GluRl含量是在神经元细胞膜上的GluRl含量。[0109]应用[0110]本发明可以应用于抑郁症预防和/或治疗，也可以应用于药物的筛选和制备。[0111]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。[0112]通用材料和方法[0113]动物材料[0114]雄性CHL症大鼠（4-7周龄）和同龄的SpragueDawley大鼠。CHL大鼠饲养如前所述（1)。大鼠两只/笼，12小时的明暗周期（7am-7pm有光）。成年（10-14周龄）C57BL/6小鼠被用于行为测试：4只/笼，12小时明暗周期（5am-5pm有光）。大鼠和小鼠都能够自由摄取稳定的水和食物，所有的动物实验经过中科院神经科学研究所动物保护和使用委员会的批准。[0115]蛋白组学[0116]对三组大脑样品进行蛋白质组学分析，每组包括野生型SD大鼠对照和先天习得无助（cHL)大鼠，其中先天习得无助大鼠在习得无助实验和强迫游泳实验中都表现出抑郁行为。异氟醚麻醉后取下大脑，迅速解剖取下僵带组织，液氮冷冻。不同样本的缰组织和经15N标记（大鼠15N喂食两代使得原子富集15N达95%)的大鼠全脑组织分别加入预冷匀浆缓冲液（320mMsucrose,4mMHEPESρΗ7·4,ImMMgCl2和0·5mMCaCl2,5mMNaF,ImMNa3VO4，EDTA_free，ProteaseInhibitorcocktailtablets(Roche))，用玻璃勻楽器制成匀浆。用Bradford测定蛋白含量（Bio-Rad)，将各样本匀浆分别和15N全脑匀浆按蛋白比例(w/w)1:1混合。混合物800g，4°C离心15min取上清，上清液1000g，15min离心取沉淀。沉淀即为细胞膜部分，将IOOug沉淀溶于匀浆缓冲液中，用多维蛋白质鉴定技术分析（MudPIT)⑶。对于每个蛋白，在肽水平估算14N/15N的比值，然后求蛋白水平的平均值。成千上万的蛋白的该比值求log转化为正态分布，归一化使得中值为0。正态化之后，CHL的该值除以对照的该值就是这个蛋白在抑郁症下的变化情况。正态化后的平均比值减去2倍标准差就是每个蛋白的显著值。变化>50%并且显著值>0的蛋白作为候选，进行下一步验证。对每个蛋白取log之后的变化倍数进行Student'st-test，p值见表1。[0117]病毒构建[0118]通过标准方法设计和构建AAV-βCaMKII-2A-EGFP,AAV-aCaMKII-2A_tdTomat〇,AAV-βCaMKII-K43R-2A-EGFP,AAV-βCaMKII-2A-Glu-RlCt,AAV-GFP-CRE和AAV-GFP质粒。βCaMKII和aCaMKII全长cDNA从SD大鼠cDNA文库中得到。2A信号肽序列从plenti-2A_EGFP质粒中推断获得，AAV骨架序列由AAV-GFP-CRE质粒（LisaMonteggia惠赠）克隆得到。对于AAV-βCaMKII-2A-EGFP质粒，[0119]1)将βCaMKII序列先力P到plenti-Ubiquitin-2A_EGFP质粒上，得至IjUbiquitin-βCaMKII-2A-EGFP质粒，再通过BglII和XhoI酶切位点引入AAV骨架。[0120]2)aCaMKII通过BamHl和Xbal酶切位点克隆到pLenti-2A_tdTomato载体上，PCR扩增Ienti载体上的aCaMKII-2A-tdTomato段，然后通过Xball和BsrGl内切酶克隆到AAV载体上。[0121]3)ΑΑν-βCaMKII-K43R-2A-EGFP质粒，βCaMKII-K43R片段通过XbaLl和EcoRl酶切位点克隆到AAV-2A-EGFP上。[0122]4)ΑΑν-βCaMKII-2A-EGFP-GluRlCt质粒，从pSindbis-EGFP-GluRICt质粒中扩增得到EGFP-GluRlCt片段，与AAV-βCaMKII-2A连接。[0123]5)βCaMKII的短发夹寡聚核苷酸序列（shRNAi)是5'-GAGTATGCAGCTAAGATCA-3'，AAV-βCaMKII-RNAi由NeuronBiotech公司合成（shanghai，china)。[0124]这些构建物都是用前面所述AAV2方法生成的。[0125]简言之，将一个AAV载体与两个辅助载体（pXX680和pXX2)，一起转染到HEK293TN细胞。转染后两天，用肝素琼脂糖柱从细胞裂解液中纯化病毒，并超浓缩得到终体积。AAV2的辅助质粒pM680和pXX2从UniversityofNorthCarolina购得。用10倍梯度稀释的病毒感染HEK293TN细胞测定病毒效价。[0126]抗抑郁治疗[0127]cLH大鼠的通过连续14天注射丙米嗪（10mg/kg，sigma)进行抗抑郁治疗。注射后分析行为测试。[0128]立体定向注射和组织学[0129]向小鼠注射病毒时，腹腔注射氯胺酮（l〇〇mg/kg体重）和赛拉嗪（8mg/kg)麻醉后，置于立体定位架上（Stoeltinginstruments)。手术前所有的小鼠群居2周以上。将0.8-lul纯化浓缩的AAV病毒（?1012感染单位/ml)双侧注入到每只小鼠的LHb位置（前囱坐标位置：-1.32mm前后侧（AP)，±I.04mm内外侧（ML)，-2.48mm背腹侧（DV)，冠状面中线14°角），使用玻璃微电极缓慢注入（?100_150nl/min)，输液完成后5min注射电极缓慢撤回。[0130]向大鼠注射病毒，腹腔注射10%水合氯醛（4ml/kg体重）麻醉，LHb位置（SD大鼠4周龄，从前囱门起AP-3.0mm，ML±0.7mm，从前囱门起DV-4.4mm;CHL大鼠4周龄，从前囱门起AP-3.0mm，ML±0.7mm，从前囱门起DV-4.45mm;CHL大鼠6周龄，从前囱门起AP-3.3mm，ML±0.7mm，从前囱门起DV-4.7mm)注射1-1.5ul的AAV病毒，微电极束上发现了微弱的标签效应。术后至少7天，开展行为实验或者电生理实验。行为实验结束后检查注射位置，只使用正确注射的那些动物数据。注射了AAV-αCaMKII-tdTomato的大鼠或者小鼠的脑切片在荧光显微镜下检查，其它标记了GFP的病毒在显微检查之前用抗体检查GFP蛋白。每个大脑的缰区切成6组连续的切片（小鼠30um的切片，每组6片；大鼠40um切片，每组8-9片）。所有的切片在安装到固定片之前用Hoechst复染色。计算缰区的感染率。感染率计数是通过使用ImageJ在一组从前到后的脑切片中进行的，一个区的总神经数是用两个对照组的一组切片里的NeuN信号取平均。用感染细胞数除以总神经元数就是感染率。[0131]免疫组化和免疫印迹[0132]灌流：大鼠或小鼠用10%水合氯醛深度麻醉，用磷酸盐缓冲液（PBS)和含4%多聚甲醛（w/v)的磷酸盐进行心脏灌流。大脑在同样4%多聚甲醛溶液过夜后固定处理，然后浸泡在30%蔗糖（PBS)溶液中1天（小鼠）或3天（大鼠）。冰冻的大脑在冠状面上用滑动切片机（CM1950,Leica)切成30um(小鼠）或40um(大鼠）切片。切片浸泡在PBS中4°C冷藏以待后用。抗体是兔抗CaKMII(1:300,Epitomics)兔抗GluRl(1:300,Chemicon)，鼠抗NeuNantibody(l:1000,Chemicon),兔抗GFPantibody(l:1000,Invitrogen),鸡抗GFPantibody(1:1000,ABCAM),AlexaFluor488羊抗兔IgG,AlexaFluor488羊抗鸡IgG,AlexaFluor594羊抗鼠IgG(alll:1000,Invitrogen),生物素标记的羊抗兔IgG,生物素标记的羊抗鼠IgG(all1:250,Vectorlaboratories),Cy3-偶联链霉亲和素，Cy2-偶联链霉亲和素(alll:1000,JacksonImmunoResearch)。特别的是对于CaKMII和GluRl的着色，我们米用了三步放大操作：切片依次使用CaKMII抗体或GluRl抗体、生物素标记的二抗、Cy3或Cy2偶联链霉亲和素孵育。所有的切片最后用Hoechst孵育。突光成像采用OlympusFluoviewFVlOOO共聚焦显微镜（10X、20X物镜）和OlympusMVXIOmicroscope(MVPLAP02XC物镜）。图片分析软件为Image-ProPlus和ImageJ。CaKMII和GluRl的荧光强度定量：在20X下相同设置下捕获LHb感染侧和未感染侧共聚焦图像，并通过Image-ProPlus进一步分析。Hoechst信号的区域值除以IHC信号的综合光密度（IOD)得到荧光强度。比较LHb的病毒注入侧和未注入侧的荧光强度得到过表达水平。[0133]免疫印迹：缰或海马组织的处理与之谱分析的处理相同。10%PAGE胶SDS电泳，每泳道上样量5_8ug蛋白，转模做western印迹，抗体是anti-βCaMKII(1:4000,invitrogen)，anti-aCaMKII(1:2000,millipore)，anti-γCaMKII(1:1000,PTG)，anti-δCaMKII(1:500,SantaCruz)和anti-tubulin(1:10000,Bio-Rad)。使用高灵敏度的ECL试剂（GEHelthcare)〇[0134]切片准备[0135]用异氟烷将SD大鼠（出生后40-50天）麻醉后，灌注20ml预冷解剖缓冲液（25.OmMNaH⑶3,I.25mMNaH2PO4,2.5mMKC1，0·5mMCaCl2,7.OmMMgCl2,25.OmMglucose,110.OmMcholinechloride,11.6mMascorbicacid和3.ImMpyruvicacid,gassedwith95%02和5%C02)，断头后快速解剖大脑，冠状缰在氧化的冷冻解剖缓冲液中用振动切片机（DSKII)切成350μπι切片。缰切片在含氧的ACFS溶液NaCl，2.5mMKC1，26mMNaH⑶3,ImMNaH2PO4,IOmMglucose,I.3mMMgCl2和2.5mMCaCl2,gassedwith95%02和5%C02)中恢复两小时，转移至持续供给含氧的ACFS溶液的槽中。[0136]电生理[0137]外侧缰神经元膜片钳实验温度27±1°C，使用Multiclamp700B放大器（MolecularDevices)和配备红外微分干涉对比的奥林巴斯光学显微镜。电极电阻为3-4ΜΩ。为了mEPSC记录，在ΤΤΧ(1μM)和印防己毒素（100μM)存在的ACSF溶液中，在-60mv下将神经元夹紧。胞内溶液包含CsMeS03115mM,CsC120mM,HEPESlOmM,MgCl22.5mM,Na2-ATP4mM,Na-GTPO.4mM,Na-phosphocreatinelOmM,EGTA0.6mM。数据通过Digidatal322A(MolecularDevices)在2kHz过滤并在IOkHz随机抽样。mEPSC分析米用MiniAnalysisProgram(Synaptosoft)，阈值幅度为5PA。为了测定自发发放率，将神经元接上细胞连接装置，在存在印防己毒素(picrotoxin)的ACSF溶液中。电极电阻6-7ΜΩ，电极内溶液为NaC1118mM，HEPES10mM。每个细胞记录50次扫描，每次扫描持续7s，数据通过pClamplO软件分析。[0138]行为实验[0139]所有行为实验都是在黑夜生理节奏期进行（小鼠18:00-23:00);大鼠19:00-24:00).[0140]习得无助实验范例依据前面所述优化的说明书进行（5)。实验是对同窝cLH或野生型SD大鼠进行。范式包含两个部分。"训练部分"包括在刺激室（coulbourn仪器）中，120次不可避免的、不受控的0.8mA足底电刺激超过40分钟，随机刺激持续时间和范围从5秒到15秒间隔刺激时间，总刺激持续时间为20分钟。"测试部分"训练24小时后进行，习得无助表型是由一个杆压迫任务进行评估，期间一个光照指示杆被放入刺激室中。这一部分包括15次可逃避的0.8mA强度电刺激和24s实验间隔。每次刺激持续了60秒，但是能被杆压迫终止。超过10次失败被定义为"习得无助"（LH);少于5次失败为"非习得无助"（NLH)。[0141]强迫游泳实验中，大鼠或小鼠被放置在水缸中6min(水温23-25°C;对于小鼠，水缸直径12cm，高度25cm;对于大鼠，水缸直径为20cm，高度40cm。水的深度是为了防止动物用它们的后肢触底）。大鼠在前一天有一个额外的15min游泳引导。动物行为被从侧面录像记录。每个动物在测试最后4min的不动时间由不知动物处理方式的观察员计算。不动的定义是浮动或静止不动，这意味着除了保持头部露出水面的动作不存在任何其他运动。[0142]蔗糖偏好测试中，先将小鼠单独安置1周，然后习惯于两瓶1%蔗糖喂食3天，接着两瓶水喂食一天。然后小鼠停止进水24小时,然后暴露在两瓶装满1%鹿糖或水前2h。Ih后两瓶位置互换。测定各流体的总消耗量，蔗糖偏好被定义2h测试中的蔗糖溶液消耗量占蔗糖溶液和水总消耗量的比例。[0143]开放场试验是在所有其他的行为测试之后进行的。在一个明亮房间内，大鼠或小鼠被放置在一个塑料盒的中心（对于小鼠：40cmX40cmX40.5cm;对于大鼠80cmX80cmX40cm)6min，测试期间，动物行为被录像，随后使用EthoVisionPro视频跟踪系统和软件（Noldus)分析。使用软件计算小鼠移动的总距离和在盒子中心所花的时间。[0144]统计分析[0145]所有的数据都以平均值土SEM。对于所有的行为数据，采用two-tailedStudent'st-testsQAAV-βCaMKII-2A_EGFP和AAV-αCaMKII-2A_tdTomato过表达的westernblot数据和电生理数据，采用双尾配对t检验。AAV-βCaMKIIRNAi的电生理检测数据，采用pairedWilcoxon-tests。[0146]实施例I[0147]选择性的培育表型习得性无助cLH大鼠，结果如图IA所示，表现为在从可逃脱足底电击下逃脱次数明显减少，这种表现能被慢性抗抑郁药治疗逆转（丙咪嗪，ip，IOmg/kg，14天）（图1A)。cLH大鼠在强迫游泳测试中也表现为不动性增加（图1A)。[0148]实施例2[0149]分离cLH和野生型对照组大鼠的双侧缰核组织，进行定量蛋白质组学分析。[0150]提取蛋白质用于15N稳定同位素标记的定量蛋白质组学分析（图1B)。为了减少样品的复杂性，我们提取了膜蛋白组分并进行了三次独立样本分析（图6、图7、图8,表1)。研究表明cLH大鼠缰核内βCaMKII表达显著上调（是野生型对照的1.9倍，P=O.01，图1C)。对CaMKII家族的其他亚型也进行了检测：aCaMKII在不同样品中的表达水平相差很大，但仍然观察到了上调趋势；SCaMKII保持不变；YCaMKII显示了1.3倍的增加（P=O.0013)(图9)。由于大脑中PCaMKII比YCaMKII更丰富，我们针对这个CaMKII的亚型进行研究。通过Western印迹分析二次验证，确定了cLH缰核样品膜蛋白提取物中PCaMKII较对照组有0.86倍的增加（P=O.003)(图1D)，但cLH海马样品中则没有增加（P=O.33,图1E)。实时定量PCR检测显示βCaMKII的mRNA水平表现出0.37倍的增加（P=0.04)(图1F)，这表明转录调控至少部分导致了蛋白水平的变化。免疫组化的缰脑切片染色显示：CaMKII蛋白表达水平的增加发生在外侧缰（图1G)。[0151]表1[0152]【权利要求】1.一种PCaMKII抑制剂的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗抑郁症的药物。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制剂选自下组：⑴干扰0CaMKII表达的干扰RNA或其前体；(ii)激酶活性下降或丧失的突变型PCaMKII蛋白或其编码序列；(iii)抑制0CaMKII活性的抑制剂；(iv)0CaMKII的竞争性抑制剂；(v)抗PCaMKII的抗体；(vi)阻遏PCaMKII调控AMPARGluRl通路的拮抗剂。3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制剂或拮抗剂包括以下形式：多核苷酸、多肽、表达载体、小分子化合物、或其组合。4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的PCaMKII抑制剂还用于制备降低外侧缰核的神经元峰电位输出的药物和/或降低外侧缰核的突触效能的药物。5.-种可用于预防和/或治疗抑郁症的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括：药学上可接受的载体；和有效量活性成分，其中所述的活性成分为0CaMKII抑制剂或拮抗剂。6.-种PCaMKII蛋白或其编码序列和/或@CaMKII促进剂的用途，其特征在于，用于制备一试剂或组合物，所述试剂或组合物用于构建抑郁症动物模型。7.-种筛选用于预防和/或治疗抑郁症潜在物质的方法，其特征在于，包括步骤：(1)给抑郁症动物模型施用待筛选的测试物，其中在所述抑郁症动物模型的外侧缰核中3CaMKII是高表达的；和(2)观察所述抑郁症动物模型中的抑郁症的相关症状和/或指标，并与对照组进行比较；其中，所述抑郁症动物模型中抑郁症的相关症状有显著改善，则表示该测试物是可用于预防和/或治疗抑郁症潜在物质。8.-种筛选用于预防和/或治疗抑郁症潜在物质的方法，其特征在于，包括步骤：(1)在测试组中，向体外检测体系中加入待检测的测试物；和(2)检测所述测试组的体外检测体系中PCaMKII的表达水平和/或活性，并与阴性对照组进行比较；其中，如果与加入了阴性对照组相比，测试组中0CaMKII的表达水平显著下降，和/或3CaMKII的活性显著下降，则表示所述测试物是预防和/或治疗抑郁症的潜在物质。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下一个或多个步骤：对上一步骤筛选出的潜在物质，进一步测试其对GluRl的膜部分的影响；对上一步骤筛选出的潜在物质，施用于动物模型，观察其对抑郁症症状的影响；在测试其对GluRl的膜部分的影响时，如果与阴性对照组（或空白对照组）相比，加入或施用所述测试物的测试组中GluRl含量降低，则表示该测试物是预防和/或治疗抑郁症的潜在物质；所述的GluRl含量是在神经元细胞膜上的GluRl含量。10.-种GluRl抑制剂的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗抑郁症的药物；较佳地，所述药物还用于降低外侧缰核的神经元峰电位输出和突触效能。【文档编号】A61K39/395GK104338135SQ201310347938【公开日】2015年2月11日申请日期:2013年8月9日优先权日:2013年8月9日【发明者】胡海岚,李坤,周涛申请人:中国科学院上海生命科学研究院