本发明属于医药技术领域，涉及苯并咪唑类化合物及其应用，具体涉及一种作为Pin1(肽脯氨酰顺反异构酶)抑制剂的苯并咪唑类化合物及其药学上可接受的盐或水合物，及其制备方法，以及含有这些化合物的药物组合物及其应用。
背景技术：
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肿瘤的发生往往伴有细胞调节因子的异常，一些重要的细胞调节因子如CyclinD、CyclinE、β-catenin、p53等因子都是Pin1(肽脯氨酰顺反异构酶)的作用底物，因此肿瘤的发生和Pin1密切相关。
大量临床研究数据表明，Pin1在大多数人类肿瘤中过量表达，如前列腺癌、卵巢癌、肺癌、宫颈癌及黑色素瘤等。另外Pin1的表达亦与肿瘤患者的恢复及预后相关。可见Pin1的水平在肿瘤中是一个特异而广泛的指标。
现代研究认为，肿瘤的发生和发展是一个多步骤多阶段的复杂过程，Pin1过表达所导致的致癌性可能是继发于一些原癌信号的激活，相应信号的激活接着导致细胞内特定蛋白的磷酸化，而这些磷酸化的蛋白又是Pin1的底物。最终，Pin1将这些致癌信号整合并放大，并且协同这些激活的致癌途径导致细胞的恶性增殖与转化，从以上研究可以看出，Pin1实际上是致癌信号通路的催化剂。大量分子生物学及Pin1抑制剂研究表明，抑制Pin1可以同时抑制多条致癌信号通路，诱导肿瘤细胞凋亡，因而Pin1有望成为新的肿瘤诊断和治疗的理想靶标。
技术实现要素：
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本发明的目的是提供新型作为Pin1小分子抑制剂的苯并咪唑类化合物及其药学上可接受的盐或水合物。
本发明提供了通式Ⅰ所示的衍生物、及其药学上可接受的盐或水合物：
其中，R1独立选自取代苯胺基、取代苄胺基、取代苯乙胺基、哌啶基或吗啉基；取代基为单取代或多取代的H、卤素、(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、卤代(C1-C4)烷基、二氧亚甲基、硝基、卤代(C1-C4)烷氧基、对硝基苯氧基；
R2独立选自H或(C1-C5)烷基；
n为1-4之间的整数。
本发明优选通式Ⅰ所示的化合物、及其药学上可接受的盐或水合物：
其中，R1独立选自取代苯胺基、取代苄胺基、取代苯乙胺基、哌啶基或吗啉基；取代基为单取代或多取代的H、卤素、三氟甲基、三氟甲氧基、(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、硝基；
R2独立选自H或(C1-C5)烷基；
n为1-4之间的整数。
本发明优选通式Ⅰ所示的化合物、及其药学上可接受的盐或水合物：
其中，R1独立选自取代苯胺基、取代苄胺基、取代苯乙胺基、哌啶基或吗啉基；取代基为单取代或多取代的H、卤素、三氟甲基、三氟甲氧基、(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、硝基；
R2独立选自H；
n为1-4之间的整数。
本发明优选通式Ⅰ所示的化合物、及其药学上可接受的盐或水合物：
其中，R1独立选自取代苯胺基、取代苄胺基、取代苯乙胺基、哌啶基或吗啉基；取代基为单取代或多取代的H、卤素、(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、卤代(C1-C4)烷基、二氧亚甲基、硝基、卤代(C1-C4)烷氧基；
R2独立选自甲基；
n为1-4之间的整数
本发明优选通式Ⅰ所示的化合物、及其药学上可接受的盐或水合物：
其中，R1独立选自取代苯胺基、取代苄胺基、取代苯乙胺基、哌啶基或吗啉基；取代基为单取代或多取代的H、卤素、(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、卤代(C1-C4)烷基、二氧亚甲基、硝基、卤代(C1-C4)烷氧基；
R2独立选自H或(C1-C5)烷基；
n为2。
本发明还包括所述的化合物、其药学上可接受的盐、其易水解的酯或其异构体的药物组合物。
除非另外指出，本发明所用术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘，优选氯、溴；“烷基”是指直链或支链的烷基。
通过体外抑酶实验筛选，我们发现本发明化合物可抑制Pin1活力，因此，本发明化合物可用于与Pin1异常表达相关的疾病中的应用，如各种癌症。
通过体外活性筛选研究，我们发现本发明化合物具有抗肿瘤活性，因此本发明可以用于制备治疗和/或预防各种癌症的药物，如乳腺癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、子宫癌、胰腺癌或卵巢癌。
本发明活性化合物可作为唯一的抗癌药物使用，或者与一种或多种其它抗肿瘤药物联合使用。联合治疗通过将各个组分同时、顺序或隔开给药来实现。下文中提供的实施例和制备例进一步阐明和举例说明本发明化合物及其制备方法。应当理解，下述实施例和制备例的范围并不以任何方式限制本发明的范围。
下面的合成路线描述了本发明的式Ⅰ化合物的制备，所有的原料都是通过这条路线中描述的方法、通过有机化学领域普通技术人员熟知的方法制备的或者可商购。本发明的全部最终化合物都是通过这条路线中描述的方法或通过与其类似的方法制备的，这些方法是有机化学领域普通技术人员熟知的。这条路线中应用的全部可变因数如下文的定义或如权利要求中的定义。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来举例本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
实施例1：(E)-1-(N-苯基)丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯的制备
步骤A：(E)-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯的制备
室温下，将3.79g(27.4mmol)K2CO3置于100ml茄形瓶中，加入40ml干燥的THF，搅拌下加入3.17g(15mmol)膦酰基乙酸甲酯二乙酯，室温搅拌30min后，向茄形瓶中加入2g(13.7mmol)苯并咪唑-2-甲醛，然后将反应体系置于N2氛围中，66℃回流24小时。反应结束后，冷却反应液，过滤，滤液蒸干，大量乙酸乙酯重新溶解，然后用饱和NaCl溶液洗三次，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，蒸干溶剂得黄色固体，用快速制备液相纯化(石油醚：乙酸乙酯＝4:1)，得白色固体，收率：85％～90％。
步骤B：(E)-3-[(2′-丙烯酸甲酯)-1(H)-苯并咪唑]丙酸的制备
将0.404g(2mmol)(E)-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯置于100ml茄形瓶中，向茄形瓶中加入40ml丙酮，8ml DMF，0.8ml水，然后再加入5.52g(40mmol)碳酸钾，1.224g(8mmol)溴丙酸，70℃回流4小时，TLC监测反应完全。反应结束后，蒸干溶剂，所得固体用50ml水溶解，0℃下6mol/L盐酸调pH至5左右，然后用乙酸乙酯萃取至水层在紫外下几无荧光，合并有机层，然后用NaCl溶液洗六次，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干，得白色至黄色固体，不需纯化可直接投下一步，收率：80％～85％。
步骤C：(E)-1-(N-苯基)丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯的制备
0℃下，0.473g(1.73mmol)(E)-3-[(2′-丙烯酸甲酯)-1(H)-苯并咪唑]丙酸和0.177g苯胺(1.903mmol)置于100ml茄形瓶中，加入50ml CH2Cl2，接着加入0.465g HOBt(3.46mmol)和0.97ml N-甲基吗啉，最后分批加入0.664g EDCI(3.46mmol)，搅拌30min，撤掉冰浴，室温过夜反应，TLC监测反应完全，饱和NaCl溶液洗CH2Cl2层三次，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干，得黄色固体，快速制备液相分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1:3)，得白色固体，收率50.2％。
ESI-MS m/z:370.1[M+H]+.
实施例2：(E)-1-(N-苯基)丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸的制备
室温下，0.21g(0.601mmol)(E)-1-(N-苯基)丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯置于20ml茄形瓶中，加入6ml THF，1.6ml氢氧化锂溶液(3.57mol/L)，室温反应，TLC监测反应完成后，用2mol/L盐酸调节pH至7左右，蒸除THF，加入10ml水，冰浴下，用2mol/L盐酸调节pH至固体不再析出，过滤，干燥，得白色固体，收率94.5％。
ESI-MS m/z:356.1[M+H]+.
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:12.89(1H,s)，9.95(1H,s)，7.81(2H,d)，7.67(2H,t)，7.46(2H,d)，7.30(1H,t)，7.24(3H,t)，7.00(1H,t)，6.91(1H,d)，4.71(2H,t)，2.85(2H,t)
按照实施例1和实施例2的制备方法，选择合适的原料，制的实施例3-实施例32的化合物。
实施例3(E)-1-[N-(4′-甲基苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，
ESI-MS m/z:364.1[M+H]+.
实施例4(E)-1-[N-(4′-甲基苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，
ESI-MS m/z:350.1[M+H]+.
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:12.93(1H,s)，9.88(1H,s)，7.80(1H,d)，7.67(2H,t)，7.35(2H,d)，7.30(1H,t)，7.24(1H,t)，7.04(2H,d)，6.91(1H,d)，4.70(2H,t)，2.83(2H,t)，2.21(3H,s).
实施例5(E)-1-[N-(4′-甲氧基苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，
ESI-MS m/z:380.1[M+H]+.
实施例6(E)-1-[N-(4′-甲氧基苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，
ESI-MS m/z:366.1[M+H]+.
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:12.80(1H,s)，9.80(1H,s)，7.81(1H,d)，7.67(2H,t)，7.36(2H,d)，7.32(1H,s)，7.25(1H,t)，6.90(1H,d)，6.82(2H,d)，4.70(2H,t)，3.69(3H,s)，2.80(2H,t).
实施例7(E)-1-[N-(4′-氯苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，
ESI-MS m/z:384.1[M+H]+.
实施例8(E)-1-[N-(4′-氯苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，
ESI-MS m/z:370.1[M+H]+.
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.23(1H,s)，7.67(1H,d)，7.64(2H,t)，7.52(2H,d)，7.30(2H,d)，7.25(1H,t)，7.22(1H,t)，6.95(1H,d)，4.68(2H,t)，2.86(2H,t).
实施例9(E)-1-[N-(4′-溴苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，
ESI-MS m/z:428.1[M+H]+，430.1[M+H]+.
实施例10(E)-1-[N-(4′-溴苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，
ESI-MS m/z:414.1[M+H]+，416.1[M+H]+.
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.18(1H,s)，7.66(1H,d)，7.64(2H,t)，7.46(4H,m)，7.26(1H,t)，7.22(1H,t)，6.94(1H,d)，4.68(2H,t)，2.86(2H,t).
实施例11(E)-1-[N-(3′-溴苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，
ESI-MS m/z:428.1[M+H]+，430.1[M+H]+.
实施例12(E)-1-[N-(3′-溴苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，
ESI-MS m/z:414.1[M+H]+，416.1[M+H]+.
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:12.46(1H,s)，10.15(1H,s)，7.80(1H,s)，7.78(1H,d)，7.67(2H,t)，7.36(1H,d)，7.30(1H,t)，7.24(1H,t)，7.21(1H,d)，7.20(1H,s)，6.92(1H,d)，4.71(2H,t)，2.86(2H,t).
实施例13(E)-1-(N-哌啶基)丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，
ESI-MS m/z:332.1[M+H]+.
实施例14(E)-1-(N-哌啶基)丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，
ESI-MS m/z:328.2[M+H]+.
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:12.74(1H,s)，7.79(1H,d)，7.67(1H,m)，7.66(1H,m)，7.33(2H,m)，6.90(1H,d)，4.60(2H,t)，3.34(2H,t)，3.21(2H,t)，2.84(2H,t)，1.74(2H,m)，1.32(2H,m)，1.26(2H,m).
实施例15(E)-1-(N-吗啉基)丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，
ESI-MS m/z:344.1[M+H]+.
实施例16(E)-1-(N-吗啉基)丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，
ESI-MS m/z:330.1[M+H]+.
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:12.81(1H,s)，7.79(1H,d)，7.66(2H,t)，7.28(2H,m)，6.91(1H,d)，4.61(2H,t)，3.44(2H,t)，3.37(4H,t)，3.26(2H,t)，2.86(2H,t).
实施例17(E)-1-[N-(3′,5′-二甲氧基苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，
ESI-MS m/z:410.1[M+H]+.
实施例18(E)-1-[N-(3′,5′-二甲氧基苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，
ESI-MS m/z:396.1[M+H]+.
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:12.81(1H,s)，9.90(1H,s)，7.80(1H,d)，7.67(2H,t)，7.31(1H,t)，7.25(1H,t)，6.91(1H,d)，6.87(1H,s)，6.71(2H,s)，4.70(2H,t)，3.67(6H,s)，2.86(2H,t).
实施例19(E)-1-[N-(4′-溴苄基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，
ESI-MS m/z:442.1[M+H]+，444.1[M+H]+.
实施例20(E)-1-[N-(4′-溴苄基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，
ESI-MS m/z:428.1[M+H]+，430.1[M+H]+.
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:12.78(1H,s)，8.42(1H,t)，7.77(1H,d)，7.72-7.76(1H,m)，7.66-7.58(1H,m)，7.35(2H,d)，7.33-7.22(2H,m)，6.89(3H,d)，4.65(2H,t)，4.11(2H,d)，2.86(2H,t).
实施例21(E)-1-[N-(4′-溴苯乙基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，
ESI-MS m/z:454.1[M+H]+，456.1[M+H]+.
实施例22(E)-1-[N-(4′-溴苯乙基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，
ESI-MS m/z:440.1[M+H]+，442.1[M+H]+.
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:12.82(1H,s)，8.00(1H,t)，7.77-7.59(3H,m)，7.34(2H,d)，7.31-7.21(2H,m)，6.93(1H,d)，6.89(2H,d)，4.59(2H,t)，3.12(2H,dd)，2.56(2H,t)，2.46(2H,t).
实施例23(E)-1-[N-(4′-甲氧基苄基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，
ESI-MS m/z:394.1[M+H]+.
实施例24(E)-1-[N-(4′-甲氧基苄基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，
ESI-MS m/z:380.1[M+H]+.
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:12.85(1H,s)，8.32(1H,t)，7.78(1H,d)，7.69(1H,d)，7.63(1H,d)，7.29(2H,m)，6.89(3H,m)，6.75(2H,d)，4.65(2H,t)，4.08(2H,d)，3.70(3H,s)，2.66(2H,t).
实施例25(E)-1-[N-(4′-甲氧基苯乙基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，
ESI-MS m/z:408.1[M+H]+.
实施例26(E)-1-[N-(4′-甲氧基苯乙基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，
ESI-MS m/z:394.1[M+H]+.
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:12.85(1H,s)，8.32(1H,t)，7.78(1H,d)，7.69(1H,d)，7.62(1H,d)，7.31(2H,t)，7.26(2H,t)，6.91(1H,d)，6.87(2H,d)，6.73(2H,d)，4.60(2H,t)，3.68(3H,s)，3.08(2H,q)，2.57(2H,t)，2.42(1H,t).
实施例27(E)-1-[N-(3′,5′-二氯苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，
ESI-MS m/z:418.2[M+H]+，420.1[M+H]+.
实施例28(E)-1-[N-(3′,5′-二氯苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，
ESI-MS m/z:404.2[M+H]+，406.0[M+H]+.
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.48(1H,s)，7.63(2H,d)，7.60(1H,d)，7.54(2H,d)，7.26(1H,t)，7.23(1H,s)，7.20(1H,t)，6.92(1H,d)，4.67(2H,t)，2.86(2H,t).
实施例29(E)-1-[N-(2′,4′,6′-三甲基苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，
ESI-MS m/z:392.1[M+H]+.
实施例30(E)-1-[N-(2′,4′,6′-三甲基苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，
ESI-MS m/z:378.1[M+H]+.
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.17(1H,s)，7.73(1H,d)，7.65(2H,t)，7.26(2H,dq)，6.93(1H,d)，6.76(2H,s)，4.68(2H,t)，2.88(2H,t)，2.16(3H,s)，1.73(6H,s).
实施例31(E)-1-{N-[4′-氧代-(4″-硝基苯基)苯基]}丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，
ESI-MS m/z:487.1[M+H]+.
实施例32(E)-1-{N-[4′-氧代-(4″-硝基苯基)苯基]}丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，
ESI-MS m/z:473.1[M+H]+.
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.34(1H,s)，8.21(2H,d)，7.64(2H,t)，7.60(2H,d)，7.58(1H,d)，7.25(1H,t)，7.20(1H,t)，7.09(2H,d)，7.06(2H,d)，6.96(1H,d)，4.67(2H,s)，2.89(2H,s).
实施例33本发明产物药理作用研究
紫外-可见光分光光度计预冷，至温度＜10℃，比色皿调零。加入860μL缓冲液(35mM Hepes)，20μL Pin1纯蛋白，混匀。加入10μL待测化合物或溶剂对照(DMSO)，分光光度计中预冷孵育20-30min，加入150μL糜蛋白酶(60mg/mL，溶于蒸馏水中，现用现配)，快速混匀。最后加入40μL底物(顺式脯氨酸底物)启动反应，立即测定，在390nm下连续检测90秒。计算抑制率，目标化合物对Pin1抑制率见表1。
表1.目标化合物的Pin1抑制活性
抗细胞增值的体外抑制实验
MTT试验测定方法
1.MTT的配制
称取100mg MTT，加入50mL磷酸盐缓冲溶液，避光搅拌30min，0.22μM滤膜过滤除菌，分装，-20℃保存。
2.药物溶液的配制
去目标化合物溶于DMSO中，配成一定浓度的母液，将母液用乙醇和培养液稀释成不同浓度的溶液。加药时溶液中DMSO终浓度应低于1‰，乙醇的终浓度应低于1％。
3.加药及数据处理
待PC-3细胞(人前列腺癌细胞)贴壁24h后加药，然后将药物与细胞共同孵育96h。孵育完成后，加入MTT，3.5h后甩板，以DMSO溶解蓝紫色结晶物，使用酶标仪测定570nm处吸光度值，以DMSO为空白对照，计算生长抑制率。目标化合物对PC-3细胞的抗增殖活性见表2。
表2.目标化合物对PC-3细胞的抗增殖活性
上述实验结果表明，本发明要保护的通式的化合物具有一定的抗肿瘤活性和Pin1抑制作用。本发明的化合物具有一定的工业应用前景。