本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种多肽化合物分子，及该化合物的制备方法与其在制备用于抑制肿瘤生长、提升免疫功能、及抑制血管新生的药物中的应用。
背景技术：
：生物体的遗传基因被存储在多聚脱氧核苷酸链上，遗传基因编码着执行生物学功能的蛋白质。生物体内的蛋白质多种多样，它们行使着各种生物学功能维持生命活动。蛋白质的种类虽然多不胜举，但它们基本上都是由20个自然界存在的天然氨基酸组成。由于氨基酸的组成和排列顺序的差异导致了蛋白质的千差万别。一般来说，含有50个以上氨基酸的分子被称为蛋白质，一般超过10个氨基酸的肽链被称为多肽，少于10个氨基酸的肽链被称做寡肽。目前发现最小的功能小肽只有2个氨基酸，通常较为常见的是4个以上氨基酸的功能小肽。由于人类基因组计划的完成和人类蛋白组计划的开展，将会有越来越多的蛋白质功能片段被发现并被作为药物应用到生物医药领域中来。蛋白质的功能片段通常是指被发现具备某种特定生物学功能的直链多肽片段，它们通常是几十个至两个氨基酸组成的肽类片段，被鉴定和发现的蛋白质功能片段可通过人工合成的途径制备。现已开发并在临床上得到应用的多肽药物有“催产素”、“胸腺肽α1”、“胸腺五肽”等，有在天然肽链的基础上进行人工改构制备成为用于治疗消化道出血和肢端肥大症的多肽药物“奥曲肽”和抗凝血作用的“水蛭肽”等。蛋白质中的功能片段常常能筛选到含有几十个或小到只有二个氨基酸组成的多肽片段，它们为人工合成多肽功能片段并将它们投入应用奠定了基础。在蛋白质、多肽或寡肽中，单一氨基酸的缺失、增加或被替换；氨基端(N端)或羧基端(C端)被封闭；序列中或游离端被添加化学基团都会使得蛋白质、多肽或寡肽原有的生物活性发生改变。设计、筛选和发现具有新的功能肽段或寻找高效肽段是药物开发的一个重要环节。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，一方面，提供一种多拷贝的多肽化合物，其结构式为：A-(A-K)n-Y，n为自然数；其中，A为具有生物活性的短肽片段；K为含有两个活性氨基的赖氨酸Fmoc-Lys(Dde)-OH，n为K的数目，Y为空或任意一个或多个氨基酸或化学基团；当n＝1时，多肽化合物当A为结构式为A-(A-K)-Y；当n＝2时，多肽化合物当A为结构式为A-(A-K)2-Y；当n＝3时，多肽化合物当A为结构式为A-(A-K)3-Y；……；A优选短肽片段XAXBXCXD-X；当A为XAXBXCXD-X时，多肽化合物结构式为XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)n-Y；其中，XA和XB为脂肪族氨基酸中的一种或两种，XC和XD选自脂肪族氨基酸和芳香杂环氨基酸中的一种或两种，X为空或任意一个或多个氨基酸或化学基团。当n＝2时，A为XAXBXCXD-X时，多肽化合物结构式为XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)2-Y，见式3：当n＝4时，A为XAXBXCXD-X时，多肽化合物结构式为XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)4-Y，见式4：X或Y为空、或任意一种氨基酸，或任意个氨基酸组成的肽片段，或能将氨基酸或肽片段连接起来的化学基团，X和Y可相同，可不同；例如X为空，Y为甘氨酸(Gly，G)。XA和XB为脂肪族氨基酸分子，包括：苯丙氨酸(Phe，F)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、蛋氨酸(Met，M)、半胱氨酸(Cys，C)、精氨酸(Arg，R)、赖氨酸(Lys，K)、甘氨酸(Gly，G)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、天冬氨酸(Asp,D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu,E)和谷氨酰胺(Gln，Q)中的任意一种，可相同或不同。XC和XD选自苯丙氨酸(Phe，F)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、蛋氨酸(Met，M)、半胱氨酸(Cys，C)、精氨酸(Arg，R)、赖氨酸(Lys，K)、甘氨酸(Gly，G)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、天冬氨酸(Asp,D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu,E)、谷氨酰胺(Gln，Q)、色氨酸(Trp,W)、组氨酸(His,H)和脯氨酸(Pro,P)中的任意一种，可相同或不同。还包括所述多肽化合物与有机酸或无机酸形成的盐类化合物。所述的多肽化合物所带有的羟基可形成但不限于所形成的醚、酯、苷或甙等的化合物。所述的多肽化合物所带有的巯基可形成但不限于所形成的硫醚、硫苷，或与半胱氨酸或含半胱氨酸的肽所形成的含有二硫键的化合物。所述的多肽化合物所带有的氨基可形成但不限于所形成的酰化物、烃化物、与糖类物质所形成的苷类物质等。所述的多肽化合物所带有的羧基可形成但不限于所形成的酯、酰胺类化合物等。所述的多肽化合物所带有的亚氨基可形成但不限于所形成的苷、酰化物、烃化物等。所述的多肽化合物所带有的酚羟基可形成但不限于所形成的酯、醚、苷、甙类化合物，与有机碱或无机碱所形成的盐类化合物。所述的多肽化合物与金属离子所形成的配合物、络和物或螯合物。所述的多肽化合物所形成的水合物或溶剂物。第二方面，提供一种药物组合物，其含有上述的多肽化合物、其几何异构体、其药学上可接受的盐或溶剂化合物以及可药用载体或赋形剂的药物组合物。第三方面，提供制备上述多肽化合物的方法，A-(A-K)n-Y的合成路线见式5，A优选短肽片段XAXBXCXD-X；当A为XAXBXCXD-X时，多肽化合物结构式为XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)n-Y；其中，XA和XB为脂肪族氨基酸中的一种或两种，XC和XD选自脂肪族氨基酸和芳香杂环氨基酸中的一种或两种，X为空或任意一个或多个氨基酸或化学基团；先把Y固定在固相树脂上，得到Y-固相树脂，对Y-固相树脂进行Fmoc脱保护，逐一缩合n个Fmoc-Lys(Dde)-OH，完成Kn-Y-固相树脂肽骨架的制备；再对Kn-Y-固相树脂肽骨架进行侧链氨基Dde及Fmoc脱保护，在Kn-Y-固相树脂自由氨基上同步进行A片段的延伸引入，获得A-(A-K)nY-固相树脂；将合成完毕的A-(A-K)nY从固相树脂上裂解下来得到肽粗品，经过高效液相色谱纯化得到多肽化合物A-(A-K)nY。根据肽产物羧基端特点选择相应的制备树脂，如肽产物的羧基端为自由羧基，则选用“WANG树脂”；如合成肽的羧基端为酰胺，则选用“Rink树脂”，如肽产物的羧基端为Cys、Pro、His，则选用“CTC树脂”。所述多肽化合物采用多肽固相合成的方法制备，具体步骤为：步骤一：制备Y-固相树脂：当Y为单一氨基酸，可直接购买Y-固相树脂；当Y为含有多个氨基酸的短肽，采用固相Fmoc/tBu法，以Fmoc-aa1-Wang树脂为起始原料，从C端向N端方向合成，脱去N端Fmoc保护基成为自由氨基，与树脂进行缩合，直至得到Y-固相树脂；即：如Y为单一氨基酸aa，可直接购买“aa1-固相树脂”。若Y由含有多个氨基酸的短肽构成，采用固相Fmoc/tBu法，以Fmoc-aa1-Wang树脂(取代值为0.40mmol/g)为起始原料，从C端向N端方向合成，使用20％Piperidine/DMF(V/V)脱去N端Fmoc保护基成为自由氨基(2次，每次10分钟)，用3倍当量Fmoc-aa-OH/HOBt/DIC与树脂进行缩合，反应时长1小时。以上每步反应后都用DMF洗涤树脂6次以上，再用KaiserTest检测反应程度，发现缩合反应不完全需再重复缩合一次。按次序引入Fmoc-aa2-OH、Fmoc-aa3-OH……重复缩合反应直至完成“Y-固相树脂”。步骤二：制备Kn-Y-固相树脂肽骨架：对Y-固相树脂进行Fmoc脱保护露出自由氨基，采用Fmoc-Lys(Dde)-OH进行缩合(缩合方式同步骤一)；反复缩合上n个Fmoc-Lys(Dde)-OH(记为“循环1”)，完成Kn-Y-固相树脂肽骨架的制备；即进行Fmoc脱保护露出自由氨基，采用Fmoc-Lys(Dde)-OH进行缩合(缩合方式见步骤一)。反复缩合上n个Fmoc-Lys(Dde)-OH(“循环1”)，完成“Kn-Y-固相树脂”肽骨架的制备。步骤三：Kn-Y-固相树脂进行氨基脱保护：脱去Kn-Y-固相树脂肽骨架中Lys侧链Dde及Fmoc保护基，获得释放出侧链自由氨基的Kn-Y-固相树脂；即采用2％肼/DMF(V/V)脱去“Kn-Y-固相树脂”肽链中Lys侧链Dde及Fmoc保护基(2次，每次15分钟)，得到释放出侧链自由氨基的Kn-Y-固相树脂。步骤四：在Kn-Y-固相树脂的自由氨基上同步合成A片段：采用步骤一的方式逐一缩合氨基酸，直至完成A片段获得A-(A-K)nY-固相树脂(记为“循环2”)；即采用步骤一方式逐一缩合Fmoc-aa1-OH，Fmoc-aa2-OH，……直至完成A片段获得“A-(A-K)nY-固相树脂”(循环2)。步骤五：将合成完毕的A-(A-K)nY从固相树脂上裂解下来并除去侧链保护基，得到A-(A-K)nY粗品；即采用95％TFA/H2O将合成完毕的A-(A-K)nY从固相树脂上裂解下来并除去侧链保护基(30℃下切割3小时)；收集含有A-(A-K)nY洗脱液，加入大量冷的无水乙醚使A-(A-K)nY沉淀析出，离心。用乙醚洗涤数次后干燥，即得到A-(A-K)nY粗品。步骤六：纯化精品：采用高效液相色谱(HPLC)纯化粗肽，获得纯度>98％的多肽化合物A-(A-K)nY。即采用高效液相色谱(HPLC)柱(型号为DaisoC18，10μm,50x250mm)纯化A-(A-K)nY粗品，流动相A为(含0.05％三氟乙酸，2％乙腈的水溶液)，流动相B为90％乙腈/水，流速为每分钟25毫升，紫外检测波长220纳米，收集流出峰溶液，再经过冷冻干燥，获得纯度>98％的呈白色絮状的多肽化合物A-(A-K)nY。步骤七：存储：经冷冻干燥得到呈白色絮状物的多肽化合物A-(A-K)nY置于避光低温环境下保存。每引入缩合一个氨基酸，及在“循环1”和“循环2”之间，每一次引入缩合一个氨基酸后进行“KaiserTest”检测游离氨基含量，对缩合率不高的反应再次进行缩合。第四方面，提供上述多肽化合物或上述方法制备得到的多肽化合物在制备人或动物用抑制肿瘤生长药物中的应用。所述肿瘤为人体恶性实体瘤(或术后残瘤)或非实体瘤，如血液病肿瘤(包括白血病及淋巴瘤)。所述肿瘤包括但不限于肉瘤、肝癌、结肠癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、宫颈癌。第五方面，提供上述多肽化合物或上述方法制备得到的多肽化合物在制备人或动物用免疫药物或增强免疫功能药物中的应用。本发明所阐述的多肽化合物有望成为多种药物的有效成分，在制备预防、治疗多种病症的药物用都会有所应用，特别是在制备增强免疫能力、抑制肿瘤生长药物中会广泛应用。具体实施方式以往公开的多拷贝功能片段肽分子采用Fmoc-Lys(Fmoc)-OH制备方式获得，得到的多拷贝肽分子含有的活性肽片段的拷贝数呈2n(n＝1，2，3，……)的方式递增，如形成二拷贝肽分子、或四拷贝肽分子、或八拷贝肽分子、或十六拷贝、……等功能片段的多肽化合物分子。以该方式制备的多肽化合物随着活性片段拷贝数的级数递增，其分子量也同样以级数递增的方式增加。由于不同级数拷贝数之间的分子量差别很大，可能超出了实际应用最佳范围。在实际应用中通常需要顾及肽分子大小及免疫原性之间的相互关系、肽分子与靶分子反应之间关系、肽分子合成的投入产出比效益等诸多因素，综合评价后确定实际应用的最佳肽分子形式。本发明充分考虑了上述肽分子存在的问题，提出了一种更为实用、且可具有任意拷贝数的多肽分子及其制备方法，克服了目前只能以级数增加的方式制备得到的多拷贝多肽分子存在的诸多缺陷。本发明设计和制备出一种含有任意拷贝A片段的分支状多肽分子A-(A-K)n-Y，其中，A为具有特定生物功能的活性肽片段；K为含有两个活性氨基的赖氨酸Fmoc-Lys(Dde)-OH，n为K的数目，Y为空或任意一个或多个氨基酸或化学基团。结构式A-(A-K)n-Y的表述如下：当多肽化合物结构式为A-(A-K)-Y时，n＝1，多肽化合物中生物活性短肽片段A的拷贝总数为n+1为2；当结构式为A-(A-K)2-Y时，n＝2，多肽化合物中A的拷贝总数为3；以此类推……。本发明以A代表泛指具有特定生物功能的活性肽片段，为便于阐述本发明的意图，具体实施方式中特以A为XAXBXCXD-X时加以说明。其中，XA和XB为脂肪族氨基酸分子，包括：苯丙氨酸(Phe，F)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、蛋氨酸(Met，M)、半胱氨酸(Cys，C)、精氨酸(Arg，R)、赖氨酸(Lys，K)、甘氨酸(Gly，G)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、天冬氨酸(Asp,D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu,E)和谷氨酰胺(Gln，Q)中的任意一种，可相同或不同。XC和XD可选自以上脂肪族氨基酸分子中的任意一种，可相同或不同；也可以选自杂环氨基酸，包括：色氨酸(Trp,W)、组氨酸(His,H)和脯氨酸(Pro,P)中的任意一种，可相同或不同；X为空或任意一个氨基酸或任意多个氨基酸组成的肽片段或能将氨基酸、肽片段连接起来的化学基团。本发明的多肽化合物通过变化XA、XB、XC、XD的种类用于抑制肿瘤的生长、提高机体的免疫应答能力从而可开发一种可在临床应用(人用或动物用)的增强免疫功能和/或抗肿瘤的药物。1963年美国科学家R.B.Merrifield发明创立了将目的肽的氨基酸的羧基端(C端)固定在不溶性树脂上，树脂上结合的氨基酸的氨基端(N端)与有待连接的氨基酸的羧基端进行缩合反应达到延长肽链的固相合成法。也就是从多肽的羧基端(C端)开始逐个氨基酸缩合并向多肽段的氨基端(N端)方向不断延伸。因此，在进行氨基酸的缩合反应时，要将有待连接的氨基酸上的氨基及侧链基团保护起来避免发生反应。目前常用的有叔丁氧羰基(Boc)保护法、芴甲氧羰基(Fmoc)保护法和水合肼(Dde)保护法，因此每连接上一个氨基酸就要经历一次脱保护-缩合的循环过程(即固相载体上的氨基先脱保护，再同过量的有待连接的下一个目标氨基酸的羧基发生缩合反应以延长肽链)。每经历一个循环，即：氨基酸缩合→洗涤→脱保护→中和→洗涤，接上一个目标氨基酸，直至达到所需要合成的目标肽链长度。本发明先采用带有2个活性氨基的赖氨酸(Lys，K)Fmoc-Lys(Dde)-OH依次发生缩合反应至想要的拷贝数(想要的拷贝数减1是需要缩合的Fmoc-Lys(Dde)-OH数目n)，合成得到由-Lys(Dde)-组成的固定在固相树脂上的Kn-Y分子骨架。将“Kn-Y-固相树脂”上的赖氨酸(Lys，K)脱去侧链氨基的Dde及Fmoc保护露出自由氨基，启动Fmoc-aa-OH氨基酸缩合反应循环，直至完成A片段的合成，获得“A-(A-K)nY-固相树脂”。采用95％TFA/H2O将A-(A-K)nY从固相树脂上裂解下来进行纯化，即得到精品A-(A-K)nY。n的数量决定了最终得到的多肽分子含有的生物活性片段的拷贝数(n+1)，即，若n＝2，得到的是含三拷贝A片段的三拷贝A-(A-K)2-Y肽分子；若n＝4，得到的是含五拷贝A片段的五拷贝A-(A-K)4-Y肽分子；以此类推，可以得到含有四拷贝、六拷贝、七拷贝、……A片段的多拷贝肽分子。使用WANG树脂合成完成后，采用TFA法将肽链从固相树脂上裂解下来得到的两拷贝、三拷贝、四拷贝、五拷贝、六拷贝、七拷贝、八拷贝、……的A-(A-K)nY分子。本发明所阐述的是一种多拷贝多肽化合物分子的结构及制备方法，采用其它方式合成具备此分子骨架A-(A-K)4-Y的肽化合物理所当然地包含在本发明之中；与其结构特征相关联的分子骨架(A-K)n-Y或在K之间插入氨基酸或化学基团等方式形成的分子也理所当然地包含在本发明之中。(A-K)n-Y即在完成肽分子末端缩合Fmoc-Lys(Dde)-OH后，分子的N端Fmoc被Boc酸酐封端，然后采用2％肼/DMF进行Dde脱保护，再实施A片段的缩合连接，使肽化合物骨架上相比A-(A-K)n-Y减少了一个A片段的拷贝成为(A-K)n-Y，此方式为A-(A-K)n-Y的变通方式。采用Fmoc-Lys(Fmoc)-OH替代多拷贝A片段中的n数目也属于本发明A-(A-K)n-Y的变通方式，如在“Kn-Y-固相树脂”的末端以Fmoc-Lys(Fmoc)-OH替代Fmoc-Lys(Dde)-OH，获得相同的产物A-(A-K)n-Y。在多拷贝A片段A-(A-K)n-Y分子制备中，以Fmoc-Lys(Fmoc)-OH替代1至多个Fmoc-Lys(Dde)-OH，所形成的3拷贝A片段A2K-(A-K)-Y分子、5拷贝A片段(A2K)2K-(A-K)-Y分子、9拷贝A片段〔(A2K)2K〕2K-(A-K)-Y分子，它们所形成的变通结构包含了制备任意拷贝数A片段的特征，理所当然地属于本发明之中。为便于更加具体地说明本
发明内容，列举以下具体实施例对本案发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施例中所作的任何变动和衍生都将属于本发明。实施例1：拷贝肽片段的合成本发明的多肽化合物不论是两拷贝、还是三拷贝、五拷贝、……，都具有相同的拷贝肽A片段，A为具有生物活性的短肽片段XAXBXCXD-X片段；其中，XA和XB为脂肪族氨基酸分子，包括：苯丙氨酸(Phe，F)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、蛋氨酸(Met，M)、半胱氨酸(Cys，C)、精氨酸(Arg，R)、赖氨酸(Lys，K)、甘氨酸(Gly，G)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、天冬氨酸(Asp,D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu,E)和谷氨酰胺(Gln，Q)中的任意一种，可相同或不同；XC和XD可选自以上脂肪族氨基酸分子中的任意一种，可相同或不同；也可选自杂环氨基酸，包括：色氨酸(Trp,W)、组氨酸(His,H)和脯氨酸(Pro,P)中的任意一种，可相同或不同。K为含有两个活性氨基的赖氨酸Fmoc-Lys(Dde)-OH，X或Y为空或任意一个氨基酸或任意多个氨基酸组成的肽片段或能将氨基酸、肽片段连接起来的化学基团，组合方式见表2，但不限于此。本实施例以自由羧基端肽片段的合成为说明，但实际应用时采用的肽其羧基端可附加其它化学修饰，如酰胺化等。采用固相Fmoc/tBu人工合成法，也可采用多肽自动合成仪(ABI433A型)合成法，具体操作如下：取用Fmoc-aax-WANG树脂(取代值为0.40mmol/g)为起始原料，从C端向N端方向合成，使用20％Piperidine/DMF(V/V)脱去树脂上起始氨基酸N端Fmoc保护基使其成为自由氨基(2次，每次10分钟)，用3倍当量Fmoc-aaD-OH/HOBt/DIC与树脂进行缩合，反应时长1小时。以上每步反应后都用DMF洗涤树脂6次以上，再用KaiserTest检测缩合反应程度，发现缩合反应不完全需再重复缩合一次。依据A片段的序列XAXBXCXD-X，依次缩合Fmoc-aaD-OH、Fmoc-aaC-OH、Fmoc-aaB-OH、Fmoc-aaA-OH(Fmoc-aaD-OH、Fmoc-aaC-OH、Fmoc-aaB-OH、Fmoc-aaA-OH分别代表氨基被Fmoc保护起来的氨基酸XD、XC、XB、XA),每缩合一个氨基酸都重复一次反应循环，直至把A片段合成完毕。合成完毕后采用95％TFA/H2O法将A片段从固相树脂上裂解下来并除去侧链保护基(30℃下切割3小时)。含有切割下来的A片段收集液加入大量冷的无水乙醚中使肽沉淀析出，经离心去除上清，沉淀用乙醚洗涤数次后干燥，即得到A片段粗品。采用高效液相色谱(HPLC)柱(型号为DaisoC18，10μm,50×250mm)纯化A片段粗品。色谱操作流动相A为(含0.05％三氟乙酸，2％乙腈的水溶液)，流动相B为90％乙腈/水，流速为每分钟25毫升，紫外检测波长220纳米。收集流出峰溶液，反纯度>98％的A片段肽产物。经冷冻干燥得到呈白色絮状A片段肽产物，经密封包装置于避光低温环境中存储。XA、XB、XC、XD相应的氨基酸合成原料Fmoc-aa-OH均可通过商业途经采购获得。在制备本发明阐述的肽化合物A片段时，也可直接外购XD-WANG树脂或X-WANG树脂为原料，按照上述方法得到本发明的拷贝肽A片段，表1中列出部分合成得到的拷贝肽A片段，并测得其质谱分子量。表1单拷贝肽片段XAXBXCXD-X的各基团列表本发明合成得到的表1中的A片段的质谱分子量与理论值的检测误差值要求在0.01％范围之内，说明该A片段确证为对应实施例的A片段。此实施例的表1是为了举例说明A片段的部分内容，但并不局限于所列出的片段，实际合成方式可按以下实施例中的说明进行，但可不拘泥于此方式。实施例2：分别合成三拷贝A-(A-K)2-Y肽分子，五拷贝A-(A-K)4-Y肽分子本发明以制备自由羧基端的肽分子为例进行合成说明，实际应用中合成的肽分子其羧基端可不受此限制，并将根据需要选取相应的固相树脂进行合成。三拷贝肽类分子A-(A-K)2-Y即为三拷贝XAXBXCXD-X多肽化合物XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)2-Y，其结构与合成线路见式1，其中，XA和XB为脂肪族氨基酸分子，包括：苯丙氨酸(Phe，F)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、蛋氨酸(Met，M)、半胱氨酸(Cys，C)、精氨酸(Arg，R)、赖氨酸(Lys，K)、甘氨酸(Gly，G)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、天冬氨酸(Asp,D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu,E)和谷氨酰胺(Gln，Q)中的任意一种，可相同或不同；XC和XD可选自以上脂肪族氨基酸分子中的任意一种，可相同或不同；也可选自杂环氨基酸，包括：色氨酸(Trp,W)、组氨酸(His,H)和脯氨酸(Pro,P)中的任意一种，可相同或不同。K为含有两个活性氨基的赖氨酸Fmoc-Lys(Dde)-OH，X或Y为空或任意一个氨基酸或任意多个氨基酸组成的肽片段或能将氨基酸、肽片段连接起来的化学基团。制备三拷贝A肽分子的方法为：Y-固相树脂→进入缩合Fmoc-Lys(Dde)-OH的“循环1”→完成2个“循环1”→Fmoc-Lys(Dde)-Lys(Dde)-Y-固相树脂→Dde及Fmoc脱保护→H2N-Lys(H2N)-Lys(H2N)-Y-固相树脂→合成A片段，进入缩合Fmoc-aa-OH“循环2”→A-Lys(A)-Lys(A)-Y-固相树脂→合成完毕→脱去侧链保护基并把肽从树脂上裂解下来得到A-Lys(A)-Lys(A)-Y粗品→纯化→肽精品→低温存储。本实施例采用多肽固相合成法，具体操作如下：本实施例中多肽是通过手工合成，自多肽的羧基端(C)向氨基端(N)逐个氨基酸缩合延伸，合成完成后采用TFA法将多肽从固相树脂上裂解下来。先把Y固定在固相树脂上，再通过逐个缩合2个带有两个活性氨基的赖氨酸Fmoc-Lys(Dde)-OH，获得K2-Y-树脂。由于其末端的赖氨酸具有一个活化的氨基，与另外一个带有一个活性氨基的赖氨酸(Lys,K)发生反应，就会得到直链延伸的K2Y-WANG树脂；然后在末端赖氨酸的活性氨基位置与A片段(XAXBXCXD-X)反应，得到直链延伸的XAXBXCXD-X-K2Y-WANG固相树脂；采用2％肼/DMF(V/V)对K2Y-WANG树脂中赖氨酸被保护的侧链氨基进行Dde及Fmoc脱保护,然后在其侧链自由氨基上同时进行A片段XAXBXCXD-X氨基酸X、XD、XC、XB、XA的逐一缩合。得到三拷贝A片段XAXBXCXD-X合成物XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)2-Y-WANG树脂，或A-(A-K)2-Y-WANG树脂。此步骤中，合成时可以按照实施例1先合成好XAXBXCXD-X片段，再与K2-Y-WANG树脂缩合；或者，在K2-Y-WANG树脂的自由氨基上同时依次引入缩合组成A片段的氨基酸X、XD、XC、XB、XA，得到A-Lys(A)-Lys(A)-Y-WANG树脂。最后采用95％TFA/H2O法将A-Lys(A)-Lys(A)-Y从WANG树脂上裂解下来，就得到了A-Lys(A)-Lys(A)-Y，或A-(A-K)2-Y多肽化合物粗品。纯化XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)2-Y肽化合物：采用色谱柱(型号为DaisoC18，10μm,50×250mm)，色谱操作流动相A为(含0.05％三氟乙酸，2％乙腈的水溶液)，流动相B为90％乙腈/水，流速为每分钟25毫升，紫外检测波长220纳米。收集流出峰溶液，再经过冷冻干燥。得到呈白色絮状的XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)2Y多肽化合物，经密封包装后放入冰箱保存待用；其纯度可＞99％。XA、XB、XC、XD相应的氨基酸合成原料Fmoc-aa-OH均可通过商业途经采购获得。在制备本发明的多肽化合物时，也可直接外购获得Y-WANG树脂原料，按照上述方法得到本发明阐述的多肽化合物。按照本实施例举例的方法分别合成三拷贝A片段肽分子XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)2-Y，及五拷贝A片段肽分子XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)4-Y，它们的具体基团的选择分别见表2及表3。表2.三拷贝A片段肽分子XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)2-Y的各基团列表本发明合成得到的表2中的三拷贝A片段肽分子的质谱分子量与理论值的检测误差值要求在0.01％范围之内，说明该三拷贝A片段肽分子确证为对应实施例的肽分子。此实施例部分是为了举例说明A片段及形成的分子结构形式，但并不局限于所列出的片段。以上内容并不是对本发明的限制，实际合成方式可按以下实施例中的说明进行，但可不拘泥于此方式。实施例3：五拷贝肽类分子XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)4-Y的合成本发明提供的五拷贝肽类分子A-(A-K)4-Y即为五拷贝XAXBXCXD-X多肽化合物XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)4-Y，其结构与合成线路见式2，其中，XA和XB为脂肪族氨基酸分子，包括：苯丙氨酸(Phe，F)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、蛋氨酸(Met，M)、半胱氨酸(Cys，C)、精氨酸(Arg，R)、赖氨酸(Lys，K)、甘氨酸(Gly，G)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、天冬氨酸(Asp,D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu,E)和谷氨酰胺(Gln，Q)中的任意一种，可相同或不同；XC和XD可选自以上脂肪族氨基酸分子中的任意一种，可相同或不同；也可选自杂环氨基酸，包括：色氨酸(Trp,W)、组氨酸(His,H)和脯氨酸(Pro,P)中的任意一种，可相同或不同。K为含有两个活性氨基的赖氨酸Fmoc-Lys(Dde)-OH，X或Y为空或任意一个氨基酸或任意多个氨基酸组成的肽片段或能将氨基酸、肽片段连接起来的化学基团:制备五拷贝A肽分子的方法：Y-固相树脂→进入缩合Fmoc-Lys(Dde)-OH的“循环1”→完成4个“循环1”→Fmoc-Lys(Dde)-Lys(Dde)-Lys(Dde)-Lys(Dde)-Y-固相树脂→侧链氨基Dde及Fmoc脱保护→H2N-Lys(H2N)-Lys(H2N)-Lys(H2N)-Lys(H2N)-Y-固相树脂→合成A片段，进入缩合Fmoc-aa-OH“循环2”→A-Lys(A)-Lys(A)-Lys(A)-Lys(A)-Y-固相树脂→合成完毕→脱去侧链保护基并把肽从树脂上裂解下来得到A-Lys(A)-Lys(A)-Lys(A)-Lys(A)-Y粗品→纯化→肽精品→低温存储。本实施例采用多肽固相合成方法，具体操作如下：合成XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)4-Y多肽化合物:本实施例中的多肽采用手工合成方式，自多肽的羧基端(C)向氨基端(N)逐个氨基酸缩合延伸，合成完成后采用TFA法将多肽从固相树脂上裂解下来。先把Y固定在固相树脂上，再通过逐个缩合4个带有两个活性氨基的赖氨酸Fmoc-Lys(Dde)-OH，获得K4-Y-树脂。由于其末端的赖氨酸具有一个活化的氨基，与另外一个带有一个活性氨基的赖氨酸(Lys,K)发生反应，进而再与第三个、第四个带有一个活性氨基的赖氨酸(Lys,K)发生反应，就会得到直链延伸的K4Y-WANG树脂；然后在末端赖氨酸的活性氨基位置与A片段(XAXBXCXD-X)反应，得到直链延伸的XAXBXCXD-X-K4-Y-WANG树脂；使用2％肼/DMF(V/V)对K4Y-WANG树脂中赖氨酸侧链氨基进行Dde及Fmoc脱保护；然后对K4Y-WANG树脂上的自由氨基同时进行A片段的氨基酸X、XD、XC、XB、XA引入缩合反应，即在赖氨酸(Lys,K)脱保护后的自由氨基上缩合A片段(XAXBXCXD-X)，得到五拷贝A片段XAXBXCXD-X合成物XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)4-Y-WANG树脂,或A-(A-K)4-Y-WANG树脂。最后采用95％TFA/H2O法将A-(A-K)4-Y肽化合物从WANG树脂上裂解下来，就得到了XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)4Y或A-(A-K)4-Y粗品。纯化A-(A-K)4-Y多肽化合物：采用色谱柱(型号为DaisoC18，10μm,50×250mm)，色谱操作流动相A为(含0.05％三氟乙酸，2％乙腈的水溶液)，流动相B为90％乙腈/水，流速为每分钟25毫升，紫外检测波长220纳米。收集流出峰溶液，再经过冷冻干燥。得到呈白色絮状的A-(A-K)4-Y多肽化合物，经密封包装后放入冰箱保存待用；其纯度可＞99％。合成A片段的氨基酸原料XA、XB、XC、XD均可通过商业途经采购获得。在制备本发明的多肽化合物时，可直接外购Y-WANG树脂作为起始合成的原料，按照上述方法在Y的氨基末端引入缩合氨基酸，得到本发明的多肽化合物。按照本实施例方法合成一系列五拷贝肽类分子XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)4-Y，具体基团的选择见表3。表3.五拷贝A片段肽分子XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)4-Y的各基团列表本发明合成得到的表3中的五拷贝A片段肽分子的质谱分子量与理论值的检测误差值要求在0.01％范围之内，说明该五拷贝A片段肽分子确证为对应实施例的肽分子。此实施例部分是为了举例说明A片段及形成的分子结构形式，但并不局限于所列出的片段。以上内容并不是对本发明的限制，实际合成方式可按以下实施例中的说明进行，但可不拘泥于此方式。按照本发明阐述的方式可制备任意拷贝生物活性肽片段的肽分子，实施例中刻意挑选具有代表性的三拷贝及五拷贝生物活性肽片段(A片段)的肽分子加以制备说明及试验检验，证实本发明阐述的肽分子A-(A-K)n-Y涵盖的制备可行性及有效性。本发明涉及制备含有多拷贝生物活性肽片段的化合物，分子式A-(A-K)n-Y中A即代表生物活性肽片段，为便于说明将实施例中采用的部分生物活性片段罗列于表格中，但在实际应用中A代表所有具备生物活性的肽片段，涉及的生物功能不仅仅局限于本实施例所陈述的举列说明的有限功能范围的活性肽片段。按照本实施例公布的生物功能片段，以及在此基础上通过对已知活性肽片段A所做的增减氨基酸、氨基酸替换、氨基酸末端修饰、氨基酸侧链修饰衍生而出的肽化合物分子，按照A-(A-K)n-Y肽分子结构制备的分子都涵盖在本专利的范围之内。下面通过具体实验例来对本发明提供的多肽化合物的生物活性及其功效进行阐述。实验例一：本发明多肽化合物在禽类动物(鸡)中的免疫效果实验含有血凝素(Hemagglutinin，HA)的病毒能凝集人或动物红细胞，称为血凝现象。这种血凝现象能被特异性免疫血清或特异性抗体所抑制，被称为“血凝抑制试验”(HemagglutinationInhibitionTest，HI)。新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus,NDV)能够与鸡红细胞发生凝集现象，鸡免疫新城疫病毒疫苗后，可以通过检测鸡血清的血凝抑制试验(HI)鉴定抗体水平。检测所用的抗血清稀释的最高倍数即是抗体的滴度。抗体的滴度越高，说明免疫的效果越好。HI方法具有以下优点：1.敏感性强，可以检测到微量的抗体，结果也较为准确，是较敏感的血清学检测反应之一；2.特异性强，病毒凝集红细胞只能被特异性的抗体所抑制；3.检测速度快，1次HI试验只需2小时左右即可判定结果；4.HI试验对环境要求不高，操作简单快捷，一次可检测大量的样品。本实验例采用表2中3拷贝的不同片段进行检测，考察多拷贝生物活性肽分子与疫苗联用对机体产生抗体的影响。实验方法为：选取10日龄无特定病原(SpecificPathogenFree)鸡(简称为SPF雏鸡)。将SPF雏鸡分为12组，每组10只。在SPF雏鸡的翅膀腋部皮下按以下组别接种。然后各组同时饲养在隔离器内。接种后第10天翅下静脉采血约1ml，分离血清进行HI检测，检测结果见表4(仅列出部分多肽化合物的检测结果)。具体操作参见由郭鑫主编，中国农业大学出版社2007年出版的《动物免疫学实验教程》。空白组：注射0.3ml生理盐水；对照组：接种0.3ml鸡新城疫活疫苗(简写为“疫苗”，CS2株，成都天邦生物制品有限公司出品)；实验组：接种混合有0.2μg本发明多肽化合物的疫苗0.3ml。实验期间各组SPF雏鸡按照常规饲养，饲养管理条件一致，饮食活动未见异常，未见不良反应，未发生SPF雏鸡死亡，表明本发明的多肽化合物使用安全。表4结果表明鸡疫苗中添加了本发明阐述的多肽化合物后，HI的抗体滴度均值比空白组和对照组(仅有疫苗)均有所提高，说明本发明多肽化合物与疫苗联用具有良好的免疫增强效果。表4SPF雏鸡免疫实验结果组别接种物质平均抗体滴度组别接种物质平均抗体滴度空白组生理盐水阴性对照组疫苗8.2log2实验组8疫苗+#8-39.0log2实验组1疫苗+#1-38.9log2实验组9疫苗+#9-39.2log2实验组2疫苗+#2-39.0log2实验组10疫苗+#10-39.1log2实验组3疫苗+#3-39.2log2实验组11疫苗+#11-39.1log2实验组4疫苗+#4-39.2log2实验组12疫苗+#12-38.8log2实验组5疫苗+#5-39.1log2实验组13疫苗+#13-39.2log2实验组6疫苗+#6-39.2log2实验组14疫苗+#14-39.1log2实验组7疫苗+#7-38.8log2实验组15疫苗+#15-39.1log2注：阴性是指HI的抗体滴度为零。实验例二：比较含有不同拷贝数的生物活性片段的肽分子对免疫效果的影响实验从实验例一中随机选取一种生物活性肽分子、含有3拷贝活性肽分子、5拷贝活性肽分子检测不同拷贝数活性肽片段分子对免疫效果的影响，检测结果见表5。实验分组为：空白组：注射0.3ml生理盐水；对照组：按照疫苗生产厂商提供的说明书，每只鸡给予接种0.3ml新城疫活疫苗(简写为“疫苗”，CS2株)；实验组：按照疫苗生产厂商提供的说明书，每只鸡给予接种混有0.2μg编号肽及疫苗0.3ml；表5SPF雏鸡免疫实验结果注：阴性是指HI的抗体滴度为零。实验期间各组SPF雏鸡饮食活动未见异常，未见不良反应，未发生SPF雏鸡死亡，表明本发明的多肽化合物使用安全。表5结果表明随着肽片段拷贝数量的增加，免疫增强效果得到进一步提升，意味着生物学效果与肽片段拷贝数量呈正相关的作用机制。实施例三：不同拷贝数的肽化合物抑制实体瘤的效果实验实验目的：检测不同拷贝数的合成肽样品对小鼠实体瘤的抑制效果。受试样品：合成肽样品#6-1、#6-3、#6-5、均为冻干品，规格：5mg/瓶，纯度>98.5％，置于-20℃冰箱中保存，采用注射用水现用现配制为2mg/ml，在小鼠的颈背处进行皮下注射给药，每次注射后的剩余样品丢弃。阳性对照样品：5-氟尿嘧啶(简写：5-FU),购自金耀氨基酸，规格：250mg/10ml/瓶，批号：1600108，对小鼠的腹腔实施注射给药，每次注射后的剩余药品丢弃。实验动物：MusMusculusBalb/c雌性小鼠，6-8周，体重：23+2g。实验动物由北京华阜康生物科技有限公司提供。小鼠在SPF级22+3℃/40-80％保持恒温恒湿的层流动物房内5只小鼠/笼饲养，自由摄取清洁级鼠料块及自由饮用过滤灭菌水，按照动物房小鼠饲养规程管理。实验方法：采用体外培养处于对数生长期的小鼠肝癌H22肿瘤细胞用于接种，使用PBS缓冲液稀释悬浮肿瘤细胞至浓度1×106个/0.1ml并将它们接种到小鼠右侧肩胛皮下。密切观察小鼠出瘤情况，待小鼠皮下的肿块长到约50-80mm3时进行分组给药。实验终止：每两天使用游标尺对各组小鼠的瘤体积进行测量，测量肿瘤的长径和短径，当对照组的瘤体积均值达到约2000mm3时将实验动物全部实施颈部脱臼处死，剥离肿瘤组织并称重、记录各组各个肿瘤的重量及各组平均瘤重。根据各组平均瘤重计算抑瘤率(％)＝(1-样品组瘤重平均值/空白组瘤重平均值)×100％。应用SPSS13.0统计学软件进行one-wayANOVA检验，结果见表6。表6小鼠肝癌H22模型实体瘤抑制试验结果结果分析：实验样品组间的平均瘤重与空白组平均瘤重进行比较，结果表明随着活性肽拷贝数的增加，抑瘤效果得到增强。实施例四：检测含有5个拷贝生物活性肽化合物的抑瘤实验实验目的：随机选取3种含有5个拷贝生物活性肽化合物，检测它们对小鼠肝癌H22实体瘤模型的抑制效果。受试样品：合成肽样品#4-5、#9-5、#14-5、均为冻干品，规格：5mg/瓶，纯度>98.5％，置于-20℃冰箱中保存，采用注射用水现用现配制为2mg/ml，在小鼠的颈背处进行皮下注射给药，每次注射后的剩余样品丢弃。阳性对照样品：5-氟尿嘧啶(简写：5-FU),购自金耀氨基酸规格：250mg/10ml/瓶，批号：1600108，对小鼠的腹腔实施注射给药，每次注射后的剩余药品丢弃。实验动物：MusMusculusBalb/c雌性小鼠，6-8周，体重：23+1g。实验动物由北京华阜康生物科技有限公司提供。小鼠在SPF级22+3℃/40-80％保持恒温恒湿的层流动物房内5只小鼠/笼饲养，自由摄取清洁级鼠料块及自由饮用过滤灭菌水，按照动物房小鼠饲养规程管理。实验方法：采用体外培养处于对数生长期的小鼠肝癌H22肿瘤细胞用于接种，使用PBS缓冲液稀释悬浮肿瘤细胞至浓度1x106个/0.1ml并将它们接种到小鼠右侧肩胛皮下。密切观察小鼠出瘤情况，待小鼠皮下的肿块长到约50-80mm3时进行分组给药。实验终止：每两天使用游标尺对各组小鼠的瘤体积进行测量，测量肿瘤的长径和短径，当对照组的瘤体积均值达到约2000mm3时将实验动物全部实施颈部脱臼处死，剥离肿瘤组织并称重、记录各组各个肿瘤的重量及各组平均瘤重。根据各组平均瘤重计算抑瘤率(％)＝(1-样品组瘤重平均值/空白组瘤重平均值)x100％。应用SPSS13.0统计学软件进行one-wayANOVA检验，结果见表7。表7小鼠肝癌H22模型实体瘤抑制试验结果结果分析：各实验样品组间的平均瘤重与空白组平均瘤重进行比较，经统计学分析P<0.05表明实验样品#4-5、#9-5、#14-5对抑制小鼠肝癌H22模型的抑瘤效果显示有显著性差异。当前第1页1 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