一类环十肽分子及其应用的制作方法

本发明涉及药物化学领域的技术领域，更具体地，涉及一类环十肽分子及其应用。

背景技术：

β-淀粉样蛋白(Aβ)是由其前体APP蛋白在β-分泌酶以及γ-分泌酶作用下切割产生，其具有高度聚集能力，可形成可溶状态的Aβ寡聚体，然后进一步聚集形成Aβ纤维而沉积在脑内，引发神经元突触功能障碍、Tau蛋白过度磷酸化和继发炎性反应，导致神经元变性死亡，引发神经退行性疾病，如阿尔兹海默症(AD)，青光眼以及视神经老年性黄斑病变等等。在这个病理过程中，Aβ寡聚体是神经毒性的主要贡献者。因此，防止寡聚体的生成成为防治阿尔兹海默症的重要策略之一。

Aβ的中部以及C端序列具有强疏水性，并且容易形成β-片层构象。因此多数的Aβ聚集抑制剂的设计主要针对疏水区域，结合于聚集态β-Strain所形成的空腔中，阻断β-Strain结构的进一步堆积，继而形成原纤维与纤维的过程。这种策略虽然可以阻止Aβ寡聚体进一步形成纤维，但在防止毒性寡聚体形成方面，仍然未有突破。另一方面，Aβ寡聚体不仅可以在Aβ单体聚集过程中形成，也可以从Aβ纤维的解聚过程中产生。尤其最近报道的所谓“扬尘效应”，指出利用抗体清除阿尔兹海默症动物脑部的Aβ斑块时，发现Aβ寡聚体的异常升高，表明当前治疗过程中Aβ斑块的清除存在重要的风险。可见，如何利用化学分子安全清除Aβ斑块而不产生寡聚体，是抗阿尔兹海默症等药物研发的重要问题。但当前对此一领域的研究尚少见报道。由于Aβ的N端序列高度柔性，将作为药物作用靶点进行药物捕获具有一定的难度。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有药物在治疗阿尔兹海默症(AD)，青光眼以及视神经老年性黄斑病变等等的不足，提供一类环十肽分子及其应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

一类环十肽分子，通式为Cyclo(X-dY-Z-W-Arg-Leu-dY'-Z'-W'-Arg)，其中X为Leu，Ala或Val中的一种；dY与dY’为dPhe，dAla或dVal中的一种；Z与Z’为Pro或Ala其中的一种；W与W’为Ala,Thr或Val其中的一种；且当X为Leu且dY与dY’同为dPhe，Z与Z’同为Pro时，W与W’不同时为Val；

式中Leu表示亮氨酰，Phe表示苯丙氨酰，Val表示缬氨酰，dAla表示D型丙氨酰，dVal表示D型缬氨酰，dPhe表示D型的苯丙氨酰，Gly表示甘氨酰，Pro表示脯氨酰，Thr表示苏氨酰，Arg表示精氨酰；Cyclo表示由各氨基酸之间形成首尾相连的酰胺键。

该类环肽分子可以选择性地作用于Aβ的N端序列，通过调控其聚集过程，有效地防止Aβ寡聚体的生成。

优选地，dY’为dPhe，Z’为Pro，其通式为Cyclo(X-dY-Z-W-Arg-Leu-dPhe-Pro-W'-Arg)。所述环十肽分子如表1所示：

表1

优选地，Z为Pro，dY’为dPhe，Z’为Ala，其通式可由Cyclo(X-dY-Pro-W-Arg-Leu-dPhe-Ala-W'-Arg)表示。所述环十肽分子如表2所示：

表2

优选地，dY为dPhe，X不为Leu，dY’不等于dY，Z不等于Z’，其通式为Cyclo(X-dPhe-Z-W-Arg-Leu-dY'-Z'-W'-Arg)。所述环十肽分子如表3所示：

表3

优选地，dY与dY’同为dAla，Z’为Pro，其通式为Cyclo(X-dAla-Z-W-Arg-Leu-dAla-Pro-W'-Arg)。所述环十肽分子如表4所示：

表4

一种所述环十肽分子在制备诊断或治疗与β-淀粉样蛋白相关疾病的药物中的应用。

一种所述环十肽分子在药物学上可接受的盐在制备诊断或治疗与β-淀粉样蛋白相关疾病的药物中的应用。

优选地，所述与β-淀粉样蛋白相关疾病包括青光眼，老年性眼底黄斑变性或阿尔兹海默症。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

所述环十肽分子既可以防止Aβ单体聚集过程中寡聚体的形成，也可以安全地解聚已形成的Aβ纤维，而不产生寡聚体的积累。

所述环十肽分子可以有效地降低由Aβ引起的神经细胞损害。

所述环十肽分子可以高效地清除阿尔兹海默症动物脑内的Aβ斑块。

本发明提供的环十肽分子，具有在与Aβ相关的疾病，包括青光眼，老年性眼底黄斑变性以及阿尔兹海默症中病理诊断与治疗过程中作为单方或复方药物的应用前景。

附图说明

图1为所述环十肽分子的合成路线通式；

图2为所测环十肽分子抑制Aβ聚集过程中寡聚体形成；

图3为所测环十肽分子有效解聚Aβ聚集体并抑制寡聚体形成；

图4为LTT2显著提高Aβ存在下PC12细胞的生存率；

图5为LTT2处理显著降低APP/PS1转基因小鼠脑部Aβ斑块体积。

图6为对照例GSA和GSB未能有效解聚Aβ聚集体；

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明。以下实施例仅为示意性实施例，并不构成对本发明的不当限定，本发明可以由发明内容限定和覆盖的多种不同方式实施。除非特别说明，本发明采用的试剂、化合物和设备为本技术领域常规试剂、化合物和设备。

实施例1所述环十肽分子的合成

本发明的环十肽分子基于标准的Fmoc/tBu固相多肽合成方法合成。合成的固相支持物为磺酰胺树脂(200mg)。合成步骤1：首位氨基酸的上载用缩合剂PyBOP(即：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷)(5eq)和二异丙基乙胺(10eq)，-20℃条件下过夜反应。反应完取少量树脂经哌啶处理后，于290nm处测吸光度，计算上载率；步骤2：用20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基，从第二个氨基酸开始，用N，N－二异丙基碳二亚胺(3eq)和羟基苯并三唑(3eq)在常温下缩合2～3小时，重复上述脱保护、缩合、脱保护操作，所有环肽第十个氨基酸都为Boc保护的氨基酸；步骤3：所有氨基酸缩合完成后，用碘乙腈(15eq)，DIEA(10eq)的NMP溶液避光条件下活化树脂24小时；步骤4：用Reagent B(三氟乙酸88％,苯酚5％,水5％,三异丙基硅烷2％)脱掉侧链保护基；步骤5：在20％二异丙基乙胺的四氢呋喃溶液下环合24小时，经减压旋蒸，冷乙醚沉淀得到多肽粗品。(见图1)半制备高效液相色谱纯化多肽，冷冻干燥后得到纯品，经过高分辨质谱进行分子量确证。所得环十肽分子的纯度及高分辩质谱信息见表5。

表5

实施例2所述环十肽分子对Aβ的N端选择性作用测试

使用Dot-Blot法分析环十肽分子对Aβ不同区段的选择性结合能力。具体的，通过环十肽分子影响特异性抗体结合Aβ位点，分析其作用区段。在本实施例中，使用了识别Aβ三个区段的特异性抗体：N端抗体6E10(3-8)，中部抗体13-28，近碳端抗体22-35。通过计算加环十肽分子作用后相应的抗体识别Aβ后斑点的灰度值与不加环十肽的对照组的灰度降低率R来表征环十肽在不用Aβ区域的作用强弱。三个参数分别是R_N(N端)、R_M(中部)以及R_C(C端)。比值越小，说明对该区域的作用越强。最后我们用参数K来表征所述环十肽分子对Aβ的N端选择性作用，K＝R_N/(R_M+R_C+R_N)，K值越大，表明对N端的选择性越好。

具体的，Aβ₄₂(终浓度5μM，终体积10μL)与不同浓度的化合物在37℃孵箱里孵育2小时，然后用PBS稀释样品到100μL，样品用真空转印器(Bio-Dot)转印到硝酸纤维膜上，常温风干后用5％脱脂牛奶室温封闭2小时，再分别加入识别不同位点的Aβ一抗4℃孵育过夜，洗膜后加入相应辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗，用ECL western blot化学发光测试剂盒进行ECL发光以及成像，读取灰度值后计算上述参数。各环十肽分子的选择性参数K值如表5所示。由表中可见，本发明所述环肽分子对Aβ₄₂的N端具有不同程度的选择性。

实施例3环十肽分子对Aβ聚集的抑制作用测试

本实施例对本发明中所公开的环十肽分子，采用硫磺素T(Thioflavin T，ThT)荧光定量分析法进行体外Aβ的抑制活性评估。其原理为ThT与Aβ纤维体结合后，可用445nm波长的激发光激发484nm波长的荧光。荧光值与Aβ蛋白纤维的含量正相关。Aβ₄₂(终浓度20μM，终体积5μL)与环十肽(终浓度30μM)在恒温37℃孵育72小时后转移至384孔黑板中，加入45μL/孔的硫磺素T溶液(5μM，用50mM pH 8.5甘氨酸-NaOH缓冲配制)，混匀，反应5min。多功能酶标仪测定484nm处的荧光强度，扣除背景后，通过比较样品孔与阴性对照孔的荧光吸收值，再用1减去相应的百分比，得到每个样品孔的抑制率。每个样品均重复三次。

抑制率％＝(1-IF_i/IF_c)×100％

其中，IF_i指环十肽样品扣除空白背景后的荧光值，IF_c指Aβ蛋白单独存在的样品扣除空白背景后的荧光值，各环十肽分子对Aβ聚集的抑制率如表5所示。

实施例4环十肽分子对Aβ纤维的解聚集作用测试

用5X PBS配制200μM的Aβ₄₂储备液，恒温37℃老化72小时，先稀释至40μM，后等体积加入供试环十肽分子，Aβ₄₂(终浓度20μM，终体积5μL)与环十肽(终浓度30μM)继续37℃孵育72小时，之后转移至384孔黑板中，加入45μL/孔的硫磺素T溶液(5μM，用50mM pH 8.5甘氨酸-NaOH缓冲配制)，混匀，反应5min。多功能酶标仪测定484nm处的荧光强度，扣除背景后，通过比较样品孔与阴性对照孔的荧光吸收值，再用1减去相应的百分比，得到每个样品孔的解聚率。每个样品均重复三次。

解聚率％＝(1-IF_d/IF_c)×100％

其中，IF_d指环肽样品组扣除空白背景后的荧光值，IF_c指Aβ蛋白单独存在的样品扣除空白背景后的荧光值，各环肽分子对Aβ聚集的抑制率如表5所示。

实施例5ATT1等环十肽分子对Aβ聚集过程中寡聚体形成的抑制作用

25μM Aβ单体在含与不含环十肽分子125μM(ATT1、VTT4、LTV4、LTT2、LVV4、ATT9、ATT12、LTT10)的PBS缓冲液中孵育不同时间，72小时后采用PICUP-Western blot assay观察不同体系中的寡聚体状态。由图2可见，ATT1等环十肽分子显著抑制了Aβ聚集过程中寡聚体形成。

实施例6环十肽分子对Aβ纤维解聚过程中寡聚体形成的检测

25μM Aβ预先老化72小时形成纤维与高分子量寡聚体，然后加入不同的环十肽分子(LTT2、LAV2、LAA2、LVV10、ATT2、AAV2)，并进一步孵育96小时，用PICUP-Western blot assay观察不同体系中的寡聚体状态。由图3可见，各化合物明显提升了Aβ单体的含量，并显著抑制了Aβ聚集过程中寡聚体形成。表明所测试的环十肽分子能有效地解聚Aβ纤维与高分子量寡聚体，同时有效地防止了寡聚体的生成。

实施例7环十肽分子LTT2对Aβ引发的神经细胞的毒性的影响

本不同浓度LTT2与16小时老化的Aβ42溶液(终浓度0.5μM)加入生长期的PC－12细胞中，共同孵育24小时后，采用CCK8法测试细胞生存率，并与不含Aβ比效的体系比较。如图4所示，LTT2显著提高了Aβ存在下PC12细胞的生存率，表明其可以有效地抵抗Aβ所引起的细胞毒性。

实施例8环肽分子对AD模型鼠体内Aβ斑块的清除作用

本实施例举了环十肽分子LTT2对AD模型鼠体内Aβ斑块的清除作用的检测方法与结果。

采用薄颅骨技术开影像窗口，利用双光子成像技术，首先对7月龄的APP/PS1转基因小鼠脑部进行染色(染料：Methoxy-X04)，然后脑部注射环肽分子LTT2，72小时后，再次染色，观察同一窗口Aβ斑块体积的变化。结果如图5所示。相比给药前，LTT2在72小时内有效地降低了所观察多个Aβ斑块体积，表明LTT2能高效率地清除AD动物模型脑内的Aβ斑块，具有极好的应用前景。

对比例1

本对比例列举了2条与通式不同的环十肽分子GSA和GSB。GSA和GSB的序列分别为Cyclo(Thr-dPhe-Pro-Val-Arg-Thr-dPhe-Pro-Val-Arg)和Cyclo(Thr-dPhe-Pro-Thr-Arg-Thr-dPhe-Pro-Thr-Arg)，经实施例6所述环十肽促进Aβ纤维解聚集作用测试，结果如图6可见：与LTT2相比，GSA和GSB不能够有效地解聚Aβ纤维与高分子量寡聚体，未能表现出本发明的效果。