一种侧链修饰的长效glp-1类似物的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了所述GLP-1类似物具有下列通式A：7HAEGT FX13SDV SSY X20E X22QAA X26EFIAW LVKGR G37通式A，其中，X13为苏氨酸或侧链修饰的赖氨酸（K-nX），X20为亮氨酸或侧链修饰的赖氨酸（K-nX），X22为甘氨酸或侧链修饰的赖氨酸（K-nX），X26为无侧链修饰的赖氨酸(K-NH2)或侧链修饰的赖氨酸（K-nX）；X13、X20，X22和X26中有且只有一个为赖氨酸K-nX，其中n=4～10，X为甘氨酸、丙氨酸或缬氨酸。本GLP-1类似物能够有效增加GLP-1的血液半衰期，克服其因为半衰期短而无法在临床上使用的现状，在糖尿病、肥胖症治疗药物领域较有应用前景。本发明还公开了所述GLP-1类似物的制备方法及其应用。
【专利说明】一种侧链修饰的长效GLP-1类似物的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及糖尿病相关的药物领域，具体而言，本发明涉及一种具有侧链的胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)类的体内半衰期的GLP-1类似物。本发明还涉及该GLP-1类似物的制备方法以及其在制备糖尿病药物中的应用。
【背景技术】
[0002]本发明涉及的GLP-1 (glucagon-1 ikepeptide-Ι,以下简称:GLP_1)是主要由小肠L细胞分泌的一种37个氨基酸组成的多肽，其活性形式为GLP-1 (7-37) 0H和GLP-1 (7-36)NH2 (Mojsov S，J Clin Invest.1987Feb; 79 (2): 616-9)。GLP-1 明显减低人用餐后的血糖，能刺激胰岛素的产生，同时还能起到一定减肥效应，并且不会引起低血糖症(Drucker D J，Diabetes.1998Feb; 47 (2): 159-69)。近期研究还表明 GLP-1 有胰腺再生作用(Drucker DJ，2003Dec; 144 (12):5145-8)。此外，因为GLP-1为完全人源化多肽，作为临床药物在安全上具有较大优势。然而，GLP-1 (7-37)的血清半衰期仅仅为3-5分钟，每天多次注射给药在临床使用中非常不方便。
[0003]目前已经有不少研究采用GLP-1类似物融合蛋白技术解决GLP-1类似物在体内的存留时间(CN90101167.3、CN200710018734.2、CN200410054397.9、CN01820232.2、CN200380110152.7、CN200510039265.3、CN200610127237.1、CN200910009642.7)，然而，
现有的技术与临床理想的目标还有很大距离，普遍都还没有达到临床标准，最近NovoNorisk生产的利拉鲁肽为GLP-1类似物，其对GLP-1进行了棕榈酸的修饰，并于2009年于美国上市。但是利拉鲁肽也存在半衰期短的问题，其剂型仍需每日注射。
[0004]因此，目前存在对解决GLP-1体内半衰期短的方法的需求。
【发明内容】
[0005]除非另外指出，本文所述的“Fmoc策略”是指以聚合物树脂作为固相反应基质，将氨基端Fmoc保护的氨基酸在偶联试剂的存在下依次缩合，从而合成多肽的合成方法。其具体方法参见 Fmoc solid phase peptide synthesis:a practical approach, 2000, OxfordUniversity Press.
[0006]本发明的一个目的是针对临床上GLP-1类似物在体内存留时间较短，需要每天注射给药的缺限，提供一种半衰期较长的GLP-1的类似物。
[0007]本发明的另一个目的是提供一种GLP-1类似物在制备治疗糖尿病的药物中的应用，以及该GLP-1类似物在制备治疗和/或预防肥胖症的药物中的应用。
[0008]本发明的又一个目的是提供一种以GLP-1类似物作为有效成分的药用组合物，其包含上述GLP-1类似物。其中，所述的药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的辅料，并且所述药物组合物优选为注射剂，进一步优选为冻干粉针或溶液注射剂。
[0009]用于实现上述目的的技术方案如下:
[0010]一方面，本发明提供一种GLP-1类似物，所述GLP-1类似物具有下列通式:
[0011]7haegt fx13sdv ssy x20e x22qaa x26efiaw lvkgr g37
[0012]其中，X13为苏氨酸或侧链修饰的赖氨酸(K_nX)，X2CI为亮氨酸或侧链修饰的赖氨酸(1(-1^)，&2为甘氨酸或侧链修饰的赖氨酸(1(-1^)，&6为赖氨酸(K-NH2)或侧链修饰的赖氨酸(K-nX) ;Χ13、Χ20, Χ22和Χ26中有且只有一个为侧链修饰的赖氨酸(Κ-ηΧ)，其中η=4?10，X为甘氨酸、丙氨酸或缬氨酸。
[0013]所述的具有通式的GLP-1类似物，具有下列通式1:
[0014]7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (nX) EFIAff LVKGR G37
[0015](I)
[0016]其中n=4?10，优选为n=5?8 ;X为甘氨酸、丙氨酸或缬氨酸；
[0017]优选地，所述GLP-1类似物为:
[0018]SEQ ID N01:7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (GGGGG) EFIAff LVKGR G37 ；
[0019]SEQ ID N02: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (GGGGG G) EFIAff LVKGR G37 ;或
[0020]SEQ ID N03: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK(GGGGG GG)EFIAff LVKGR G37 ;或
[0021]SEQ ID N04:7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK(GGGGG GGG)EFIAff LVKGR G37 ;或
[0022]SEQ ID N05: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (AAAAA) EFIAff LVKGR G37 ；
[0023]SEQ ID N06: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (AAAAA A) EFIAff LVKGR G37 ;或
[0024]SEQ ID N07: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (AAAAA AA) EFIAff LVKGR G37 ;或
[0025]SEQ ID N08: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (AAAAA AAA) EFIAff LVKGR G37 ;或
[0026]SEQ ID N09: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (VVVVV) EFIAff LVKGR G37 ；
[0027]SEQ ID N010:7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (VVVVV V) EFIAff LVKGR G37 ;或
[0028]SEQ ID N011:7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (VVVVV VV) EFIAff LVKGR G37 ;或
[0029]SEQ ID N012:7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK(VVVVV VVV)EFIAff LVKGR G37。
[0030]另外所述具有通式的GLP-1类似物，也可以具有下列通式II:
[0031]7HAEGT FTSDV SSYLE K (nX) QAAK EFIAff LVKGR G37
[0032](II)
[0033]其中n=4?10，优选为n=5?8 ;X为甘氨酸、丙氨酸或缬氨酸；
[0034]优选地，所述GLP-1类似物为:
[0035]SEQ ID N013:7HAEGT FTSDV SSYLE K (GGGGG) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0036]SEQ ID N014:7HAEGT FTSDV SSYLE K (GGGGG G) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0037]SEQ ID N015:7HAEGT FTSDV SSYLE K (GGGGG GG) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0038]SEQ ID N016:7HAEGT FTSDV SSYLE K (GGGGG GGG) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0039]SEQ ID N017:7HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0040]SEQ ID N018:7HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA A) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0041]SEQ ID N019:7HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA AA) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0042]SEQ ID N020: 7HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA AAA) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0043]SEQ ID N021:7HAEGT FTSDV SSYLE K (VVVVV) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0044]SEQ ID N022: 7HAEGT FTSDV SSYLE K (VVVVV V) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0045]SEQ ID N023: 7HAEGT FTSDV SSYLE K (VVVVV VV) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0046]SEQ ID N024:7HAEGT FTSDV SSYLE K(VVVVV VVV)QAA KEFIAff LVKGR G37。
[0047]所述具有通式的GLP-1类似物，也可以具有下列通式III:
[0048]7HAEGT FTSDV SSY K (nX) Ε GQAAK EFIAff LVKGR G37
[0049](III)
[0050]其中η=4?10，优选为η=5?8 ;Χ为甘氨酸、丙氨酸或缬氨酸；
[0051 ]优选地，所述GLP-1类似物为:
[0052]SEQ ID N025: 7HAEGT FTSDV SSYK (GGGGG) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0053]SEQ ID N026: 7HAEGT FTSDV SSYK (GGGGG G)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0054]SEQ ID N027: 7HAEGT FTSDV SSYK (GGGGG GG)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0055]SEQ ID N028: 7HAEGT FTSDV SSYK (GGGGG GGG)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0056]SEQ ID N029: 7HAEGT FTSDV SSYK (AAAAA) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0057]SEQ ID N030: 7HAEGT FTSDV SSYK (AAAAA A)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0058]SEQ ID N031:7HAEGT FTSDV SSYK (AAAAA AA)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0059]SEQ ID N032: 7HAEGT FTSDV SSYK (AAAAA AAA)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0060]SEQ ID N033: 7HAEGT FTSDV SSYK (VVVVV) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0061]SEQ ID N034:7HAEGT FTSDV SSYK (VVVVV V)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0062]SEQ ID N035: 7HAEGT FTSDV SSYK (VVVVV VV)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0063]SEQ ID N036: 7HAEGT FTSDV SSYK (VVVVV VVV)E GQAA KEFIAff LVKGR G37。
[0064]所述具有通式的GLP-1类似物，也可以具有下列通式IV:
[0065]7HAEGT FK (nX) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37
[0066](IV)
[0067]其中n=4?10，优选为n=5?8 ;X为甘氨酸、丙氨酸或缬氨酸；
[0068]优选地，所述GLP-1类似物为:
[0069]SEQ ID N037: 7HAEGT FK (GGGGG) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0070]SEQ ID N038: 7HAEGT FK(GGGGG G)SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0071]SEQ ID N039: 7HAEGT FK (GGGGG GG) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0072]SEQ ID N040: 7HAEGT FK (GGGGG GGG) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0073]SEQ ID N041:7HAEGT FK (AAAAA) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0074]SEQ ID N042: 7HAEGT FK (AAAAA A) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0075]SEQ ID N043: 7HAEGT FK (AAAAA AA) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0076]SEQ ID N044:7HAEGT FK (AAAAA AAA) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0077]SEQ ID N045: 7HAEGT FK (VVVVV) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0078]SEQ ID N046: 7HAEGT FK (VVVVV V) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0079]SEQ ID N047: 7HAEGT FK (VVVVV VV) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0080]SEQ ID N048: 7HAEGT FK (VVVVV VVV) SDV SSYLE GQAA KEFIAff LVKGR G37。
[0081]另一方面，本发明提供上述GLP-1类似物的制备方法，所述制备方法包括Fmoc策略的固相多肽合成。
[0082]又一方面，本发明提供上述GLP-1类似物在制备治疗糖尿病，肥胖症及其相关疾病和预防肥胖症的药物中的应用。
[0083]并且，本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含上述GLP-1类似物和一种或多种药学上可接受的辅料。
[0084]所述药物组合物优选为注射剂，进一步优选为冻干粉针或溶液注射剂。
[0085]以下是本发明的详细描述:
[0086](l)GLP-l 类似物
[0087]本发明所述的GLP-1类似物的通式如下:
[0088]通式:
[0089]7HAEGT FX13SDV SSY X20E X22QAA X26EFIAff LVKGR G37
[0090]7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 为人源 GLP-1 序列，上述通式 A 的GLP-1类似物为人工序列，分别在第13、20、22或26位氨基酸上进行了修饰，由带侧链的赖氨酸K-nX取代了原有的氨基酸。其中11=4?10，乂可为617^1&，￥&1。
[0091]基于26位氨基酸突变为带侧链的赖氨酸K-nX通式可优选为:
[0092]通式1:
[0093]7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (nX) EFIAff LVKGR G37
[0094]其中n=4?10，优选为n=5?8 ;X为甘氨酸、丙氨酸或缬氨酸；
[0095]基于22位氨基酸突变为带侧链的赖氨酸K-nX通式可优选为:
[0096]通式II:
[0097]7HAEGT FTSDV SSYLE K (nX) QAAK EFIAff LVKGR G37
[0098]其中n=4?10，优选为n=5?8 ;X为甘氨酸、丙氨酸或缬氨酸；
[0099]基于20位氨基酸突变为带侧链的赖氨酸K-nX通式可优选为:
[0100]通式III:
[0101]7HAEGT FTSDV SSY K (nX) Ε GQAAK EFIAff LVKGR G37
[0102]其中η=4?10，优选为η=5?8 ;Χ为甘氨酸、丙氨酸或缬氨酸；
[0103]基于13位氨基酸突变为带侧链的赖氨酸K-nX通式可优选为:
[0104]通式IV:
[0105]7HAEGT FK (nX) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37
[0106]其中n=4?10，优选为n=5?8 ;X为甘氨酸、丙氨酸或缬氨酸；
[0107](2)本发明的药用组合物
[0108]本发明的含有GLP-1类似物可以与一种或多种药学上可接受的辅料共同制成药用组合物，这些辅料包括:水溶性填充剂、PH调节剂、稳定剂、注射用水、渗透压调节剂等坐寸。
[0109]本发明所述的水溶性填充剂辅料为选自以下的一种或一种:甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖等。
[0110]PH调节剂为选自以下的一种或一种:枸橼酸、磷酸、乳酸、酒石酸、盐酸等非挥发性的酸以及氢氧化钾、氢氧化钠或氢氧化钾或氢氧化铵、碳酸钠或碳酸钾或碳酸铵盐、碳酸氢钠或碳酸氢钾或碳酸氢铵盐等生理可接受的有机或无机酸和碱及盐等。
[0111]稳定剂为选自以下的一种或一种:EDTA_2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷等。优选焦亚硫酸钠、磷酸氢二钾、精氨酸、聚乙二醇6000、三羟甲基氨基甲烷。
[0112]渗透压调节剂是氯化钠、氯化钾的一种或两种的组合。
[0113](3)注射剂的制备方法
[0114]本发明的药用组合物可以通过肌肉、静脉内、皮下注射途经进行给药，优选的剂型为冻干粉或溶液注射剂。
[0115]冷冻干燥注射剂的制备方法:取GLP-1类似物溶液适量，加入水溶性填充剂、稳定齐?、渗透压调节剂等，加入注射用水适量，调节PH值至4-8使其溶解，加水稀释至适当浓度，加入0.1-0.5%活性炭，在0-10°C下搅拌10-20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液进行分装，采用冷冻干燥法，制得白色疏松块状物，封口即得，每个规格含有GLP-1类似物在5 μ g至lj lmg之间。
[0116]注射液的制备方法:取GLP-1类似物溶液或冻干粉适量，加入水溶性填充剂、稳定齐IJ、渗透压调节剂等，加入注射用水适量，调节PH值至4-8使其溶解，加水稀释至适当浓度，加入0.1-0.5%活性炭，在0-10°C下搅拌10-20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液进行分装，封口即得，每个规格含有GLP-1类似物在5 μ g到lmg之间。
[0117](4)药用组合物的用途
[0118]本发明的GLP-1类似物可以用在制备糖尿病治疗药物方面。具体地，本发明的组合物可以静脉、肌肉或皮下注射剂形式给药。虽然剂量依治疗对象、给药方式、症状及其它因素而改变，本发明的GLP-1类似物在相当宽的剂量范围内是有效的。在成人的治疗中，剂量范围在5 μ g/人一lmg/人，每日一次或每几日一次给药。实际剂量应该由医生根据有关的情况来决定，这些情况包括被治疗者的身体状态、给药途径、年龄、体重、患者对药物的个体反应，患者症状的严重程度等等，因此上述剂量范围并不是以任何方式限制本发明的范围。
[0119]本发明的GLP-1类似物克服了 GLP-1半衰期短的问题，所提供的GLP-1类似物在体内的半衰期可达到15?75小时以上，较单独给药的GLP-1的半衰期(半衰期仅为3-5分钟)明显延长，极大地便利了其临床推广和应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0120]以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中:
[0121]图1为实施例2中含GLP-1类似物(SEQ ID N01-12)的降血糖实验；其中，图1-A表示GLP-1类似物(SEQ ID NO 1-6)的降血糖实验，其中对应于每个时间点的七个数据条从左到右依次代表SEQ1-6及对照；图1-B表示GLP-1类似物(SEQ ID N07-12)的降血糖实验，其中对应于每个时间点的七个数据条从左到右依次代表SEQ7-12及对照；
[0122]图2为实施例3中含GLP-1类似物(SEQ ID N013-24)的降血糖实验；其中，图2-A表示GLP-1类似物(SEQ ID N013-18)的降血糖实验，其中对应于每个时间点的七个数据条从左到右依次代表SEQ13-18及对照；图2-B表示GLP-1类似物(SEQ ID N019-24)的降血糖实验，其中对应于每个时间点的七个数据条从左到右依次代表SEQ19-24及对照；
[0123]图3为实施例4中含GLP-1类似物(SEQ ID N025-36)的降血糖实验；其中，图3-A表示GLP-1类似物(SEQ ID N025-30)的降血糖实验，其中对应于每个时间点的七个数据条从左到右依次代表SEQ25-30及对照；图3-B表示GLP-1类似物(SEQ ID N031-36)的降血糖实验，其中对应于每个时间点的七个数据条从左到右依次代表SEQ30-36及对照；
[0124]图4为实施例5中含GLP-1类似物(SEQ ID N037-48)的降血糖实验，其中，图4-A表示GLP-1类似物(SEQ ID N037-42)的降血糖实验，其中对应于每个时间点的七个数据条从左到右依次代表SEQ37-42及对照；图4-B表示GLP-1类似物(SEQ ID N043-48)的降血糖实验，其中对应于每个时间点的七个数据条从左到右依次代表SEQ43-48及对照；
[0125]图5为实施例6中描述了 GLP-1类似物在人血清中的稳定性的图；
[0126]图6为实施例7中描述了 GLP-1类似物在人血清中的稳定性的图。
[0127]图7为实施例8中描述了 GLP-1类似物在人血清中的稳定性的图。
【具体实施方式】
[0128]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0129]在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
[0130]实施例1:多肽的固相合成
[0131]使用Fmoc策略的固相多肽合成方法，使用CSB1公司生产的CS336X型仪器进行本发明的多肽的合成。合成的方法按照生产商的仪器说明书进行。
[0132]将制得的多肽使用HPLC C18半制备柱进行纯化，流动相为乙腈。经脱盐及冷冻干燥得到多肽冻干粉。
[0133]实施例2:GLP-1类似物(通式I)相关的降血糖功能
[0134]本实施例中，采用的多肽如下:
[0135]SEQ ID N01:7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (GGGGG) EFIAff LVKGR G37 ；
[0136]SEQ ID N02: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (GGGGG G) EFIAff LVKGR G37 ；
[0137]SEQ ID N03: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (GGGGG GG) EFIAff LVKGR G37 ；
[0138]SEQ ID N04:7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (GGGGG GGG) EFIAff LVKGR G37 ；
[0139]SEQ ID N05: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (AAAAA) EFIAff LVKGR G37 ；
[0140]SEQ ID N06: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (AAAAA A) EFIAff LVKGR G37 ；
[0141]SEQ ID N07: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK(AAAAA AA)EFIAff LVKGR G37 ；
[0142]SEQ ID N08: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (AAAAA AAA) EFIAff LVKGR G37 ；
[0143]SEQ ID N09: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (VVVVV) EFIAff LVKGR G37 ；
[0144]SEQ ID N010:7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (VVVVV V) EFIAff LVKGR G37 ；
[0145]SEQ ID N011:7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (VVVVV VV) EFIAff LVKGR G37 ；
[0146]SEQ ID N012:7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK(VVVVV VVV)EFIAff LVKGR G37 ；
[0147]将上述多肽各lmg溶于1ml生理盐水制成多肽溶液，将此多肽溶液皮下注射于小鼠(200 μ 1/只，6只/组，购自中科院上海实验动物中心)，给药30分钟后将400微克葡萄糖注射于每只小鼠。分别于葡萄糖注射后2小时、24小时、48小时、72小时及96小时测定小鼠的血糖(注:每次测血糖前两个小时再次给相同剂量的葡萄糖)，结果见图1，其中本实施例中的对照(空白)为向小鼠皮下注射生理盐水，用量lml，葡萄糖的注射与其他试验组相同。
[0148]实施例3 =GLP-1类似物(通式II)相关的降血糖功能。
[0149]本实施例中，采用的多肽如下:
[0150]SEQ ID N013:7HAEGT FTSDV SSYLE K (GGGGG) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0151]SEQ ID N014:7HAEGT FTSDV SSYLE K (GGGGG G) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0152]SEQ ID N015:7HAEGT FTSDV SSYLE K (GGGGG GG) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0153]SEQ ID N016:7HAEGT FTSDV SSYLE K (GGGGG GGG) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0154]SEQ ID N017:7HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0155]SEQ ID N018:7HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA A) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0156]SEQ ID N019:7HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA AA) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0157]SEQ ID N020: 7HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA AAA) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0158]SEQ ID N021:7HAEGT FTSDV SSYLE K (VVVVV) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0159]SEQ ID N022: 7HAEGT FTSDV SSYLE K (VVVVV V) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0160]SEQ ID N023: 7HAEGT FTSDV SSYLE K (VVVVV VV) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0161]SEQ ID N024:7HAEGT FTSDV SSYLE K(VVVVV VVV)QAA KEFIAff LVKGR G37 ；
[0162]将上述多肽各lmg溶于lml生理盐水制成多肽溶液，将此多肽溶液皮下注射于小鼠(200 μ 1/只，6只/组，购自中科院上海实验动物中心)，给药30分钟后将400微克葡萄糖注射于每只小鼠。分别于葡萄糖注射后2小时、24小时、48小时、72小时及96小时测定小鼠的血糖(注:每次测血糖前两个小时再次给相同剂量的葡萄糖)，结果见图2，其中本实施例中的对照(空白)为向小鼠皮下注射生理盐水，用量lml，葡萄糖的注射与其他试验组相同。
[0163]实施例4 =GLP-1类似物(通式III)相关的降血糖功能
[0164]本实施例中，采用的多肽如下:
[0165]SEQ ID N025: 7HAEGT FTSDV SSYK (GGGGG) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0166]SEQ ID N026: 7HAEGT FTSDV SSYK (GGGGG G)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0167]SEQ ID N027: 7HAEGT FTSDV SSYK (GGGGG GG)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0168]SEQ ID N028: 7HAEGT FTSDV SSYK (GGGGG GGG)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0169]SEQ ID N029: 7HAEGT FTSDV SSYK (AAAAA) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0170]SEQ ID N030: 7HAEGT FTSDV SSYK (AAAAA A) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0171]SEQ ID N031:7HAEGT FTSDV SSYK (AAAAA AA)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0172]SEQ ID N032: 7HAEGT FTSDV SSYK (AAAAA AAA) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0173]SEQ ID N033: 7HAEGT FTSDV SSYK (VVVVV) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0174]SEQ ID N034:7HAEGT FTSDV SSYK (VVVVV V)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0175]SEQ ID N035: 7HAEGT FTSDV SSYK (VVVVV VV) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0176]SEQ ID N036: 7HAEGT FTSDV SSYK (VVVVV VVV) E GQAA KEFIAff LVKGR G37 ；
[0177]将上述多肽各lmg溶于lml生理盐水制成多肽溶液，将此多肽溶液皮下注射于小鼠(200 μ 1/只，6只/组，购自中科院上海实验动物中心)，给药30分钟后将400微克葡萄糖注射于每只小鼠。分别于葡萄糖注射后2小时、24小时、48小时、72小时及96小时测定小鼠的血糖(注:每次测血糖前两个小时再次给相同剂量的葡萄糖)，结果见图3，其中本实施例中的对照(空白)为向小鼠皮下注射生理盐水，用量lml，葡萄糖的注射与其他试验组相同。
[0178]实施例5:GLP-1类似物(通式IV)相关的降血糖功能
[0179]本实施例中，采用的多肽如下:
[0180]SEQ ID N037: 7HAEGT FK (GGGGG) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0181]SEQ ID N038: 7HAEGT FK (GGGGG G) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0182]SEQ ID N039: 7HAEGT FK (GGGGG GG) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0183]SEQ ID N040: 7HAEGT FK (GGGGG GGG) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0184]SEQ ID N041:7HAEGT FK (AAAAA) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0185]SEQ ID N042: 7HAEGT FK (AAAAA A) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0186]SEQ ID N043: 7HAEGT FK(AAAAA AA)SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0187]SEQ ID N044:7HAEGT FK(AAAAA AAA)SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0188]SEQ ID N045: 7HAEGT FK (VVVVV) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0189]SEQ ID N046: 7HAEGT FK (VVVVV V) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0190]SEQ ID N047: 7HAEGT FK(VVVVV VV)SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0191]SEQ ID N048: 7HAEGT FK (VVVVV VVV) SDV SSYLE GQAA KEFIAff LVKGR G37 ；
[0192]将上述多肽各lmg溶于lml生理盐水制成多肽溶液，将此多肽溶液皮下注射于小鼠(200 μ 1/只，6只/组，购自中科院上海实验动物中心)，给药30分钟后将400微克葡萄糖注射于每只小鼠。分别于葡萄糖注射后2小时、24小时、48小时、72小时及96小时测定小鼠的血糖(注:每次测血糖前两个小时再次给相同剂量的葡萄糖)，结果见图4，其中本实施例中的对照(空白)为向小鼠皮下注射生理盐水，用量lml，葡萄糖的注射与其他试验组相同。
_3] 实施例6:GLP-1类似物在人血清中的稳定性测定
[0194]本实施例中，采用的多肽如下:
[0195]SEQ ID N01:7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (GGGGG) EFIAff LVKGR G37 ；
[0196]SEQ ID N04:7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (GGGGG GGG) EFIAff LVKGR G37 ；
[0197]用真空采血针(BD B1sciences, Franklin Lakes, NJ)取志愿者血样三份，而后立即于离心机上13000rpm离心20分钟，取上层血清备用。
[0198]将上述两条多肽及GLP-1标准品(购自上海生工公司，其序列为:HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG)各0.lmg溶于0.5ml生理盐水中，充分溶解后分别加入到lml血清中，将血清标记为空白组(0.lmg GLP-1溶于0.5ml生理盐水中)、N01实验组(0.lmg序列为SEQ ID N01的肽溶于0.5ml生理盐水中)和N04实验组(0.lmg序列为SEQID N04的肽溶于0.5ml生理盐水中)。于37°C孵育0，0.1，0.3，2.5，5，10，15及24h后，分别取50 μ 1血清混合物，用GLP-1酶联免疫检测试剂盒(购自ALPCO Immunoassays)对各组血清进行检测，于SpectraMax M5酶标仪上读取吸光值，算出不同血清样品中GLP-1类似物在不同时间点的浓度，结果见图5。其中圆圈代表空白组，倒三角代表N01实验组，正三角代表N04实验组。结果表明Nol及No4实验组的半衰期>24h。
_9] 实施例7 =GLP-1类似物在人血清中的稳定性测定
[0200]本实施例中，采用的多肽如下:
[0201]SEQ ID N017:7HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA) QAAK EFIAff LVKGR G37
[0202]SEQ ID N020: 7HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA AAA) QAAK EFIAff LVKGR G37
[0203]用真空采血针(BD B1sciences, Franklin Lakes, NJ)取志愿者血样三份,而后立即于离心机上13000rpm离心20分钟,取上层血清备用。
[0204]将上述多肽及GLP-1标准品(购自上海生工公司，其序列为:SEQ ID NO 49，HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG)各0.1mg溶于0.5ml生理盐水中，充分溶解后分别加入到血清中，将血清标记为空白组(0.1mgGLP-1溶于0.5ml生理盐水中)、N0.17实验组(0.1mg序列为SEQ ID N017的肽溶于0.5ml生理盐水中)和N020实验组(0.1mg序列为SEQID N02520 的肽溶于 0.5ml 生理盐水中)。于 37°C孵育 O, 0.5，I, 4，8，12，24，48，72 及 96h后，分别取50 μ I血清混合物,用GLP-1酶联免疫检测试剂盒(购自ALPCO Immunoassays)对各组血清进行检测，于SpectraMax M5酶标仪上读取吸光值，算出不同血清样品中GLP-1类似物在不同时间点的浓度，结果见图6。其中倒三角代表空白组，空心圆圈代表N0.17实验组，实心圆圈代表N0.20实验组。结果表明N0.17及N0.20实验组的半衰期为48h。
[0205]实施例8 =GLP-1类似物在人血清中的稳定性测定
[0206]本实施例中，采用的多肽如下:
[0207]SEQ ID N033: 7HAEGT FTSDV SSYK (VVVVV) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0208]SEQ ID N036: 7HAEGT FTSDV SSYK (VVVVV VVV) E GQAA KEFIAff LVKGR G37 ；
[0209]用真空采血针(BD B1sciences, Franklin Lakes, NJ)取志愿者血样三份,而后立即于离心机上13000rpm离心20分钟,取上层血清备用。
[0210]将上述多肽及GLP-1标准品(购自上海生工公司，其序列为:SEQ ID N049,HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG)各0.1mg溶于0.5ml生理盐水中，充分溶解后分别加入到血清中，将血清标记为空白组(0.1mgGLP-1溶于0.5ml生理盐水中)、N0.33实验组(0.1mg序列为SEQ ID N033的肽溶于0.5ml生理盐水中)和N036实验组(0.1mg序列为SEQ ID N036的肽溶于0.5ml生理盐水中)。于37°C孵育0，0.5，1，4，8，12，24及48h后，分别取50 μ I血清混合物,用GLP-1酶联免疫检测试剂盒(购自ALPCO Immunoassays)对各组血清进行检测，于SpectraMax M5酶标仪上读取吸光值，算出不同血清样品中GLP-1类似物在不同时间点的浓度，结果见图7。其中倒三角代表代表空白组，空心圆圈N0.33实验组，实心圆圈代表N0.36实验组。结果表明N0.33及N0.36实验组的半衰期为24h。
【权利要求】
1.一种GLP-1类似物，所述GLP-1类似物具有下列通式:
7HAEGT FX13SDV SSY X20E X22QAA X26EFIAff LVKGR G37 其中，X13为苏氨酸或侧链修饰的赖氨酸(K-nX)，X2tl为亮氨酸或侧链修饰的赖氨酸(K-nX)，X22为甘氨酸或侧链修饰的赖氨酸(K-nX)，X26为无侧链修饰的赖氨酸(K-NH2)或侧链修饰的赖氨酸(K-nX) ；X13>X20, X22和X26中有且只有一个为侧链修饰的赖氨酸(Κ-ηΧ)，其中η=4?10，X为甘氨酸、丙氨酸或缬氨酸。
2.如权利要求1所述的GLP-1类似物，其特征在于，所述GLP-1类似物具有下列通式I:
7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK(nX)EFIAff LVKGR G37
(I) 其中η=4?10，优选为η=5?8 ;Χ为甘氨酸、丙氨酸或缬氨酸； 优选地，所述GLP-1类似物为:
SEQ ID NOl I7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK(GGGGG)EFIAff LVKGR G37 ；
SEQ ID Ν02: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (GGGGG G)EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID Ν03: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK(GGGGG GG)EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID Ν0417HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK(GGGGG GGG)EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID Ν05: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK(AAAAA)EFIAff LVKGR G37 ；
SEQ ID Ν06: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK(AAAAA A)EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID Ν07: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK(AAAAA AA)EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID Ν08: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK(AAAAA AAA)EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID Ν09: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (VVVVV)EFIAff LVKGR G37 ；
SEQ ID NOlO I7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (VVVVV V)EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID NOl II7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (VVVVV VV)EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID Ν01217HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (VVVVV VVV)EFIAff LVKGR G37。
3.如权利要求1所述的GLP-1类似物，其特征在于，所述GLP-1类似物具有下列通式II:
7HAEGT FTSDV SSYLE K(nX)QAAK EFIAff LVKGR G37
(II) 其中η=4?10，优选为η=5?8 ;Χ为甘氨酸、丙氨酸或缬氨酸； 优选地，所述GLP-1类似物为:
SEQ ID Ν01317HAEGT FTSDV SSYLE K (GGGGG)QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
SEQ ID Ν01417HAEGT FTSDV SSYLE K (GGGGG G) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID Ν01517HAEGT FTSDV SSYLE K (GGGGG GG)QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID Ν01617HAEGT FTSDV SSYLE K(GGGGG GGG)QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID Ν01717HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA)QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
SEQ ID Ν01817HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA A) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID Ν01917HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA AA) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID Ν020: 7HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA AAA) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID Ν02117HAEGT FTSDV SSYLE K (VVVVV)QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
SEQ ID N022: 7HAEGT FTSDV SSYLE K (VVVVV V) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N023: 7HAEGT FTSDV SSYLE K (VVVVV VV) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N024:7HAEGT FTSDV SSYLE K(VVVVV VVV)QAA KEFIAff LVKGR G370
4.如权利要求1所述的GLP-1类似物，其特征在于，所述GLP-1类似物具有下列通式III:
7HAEGT FTSDV SSY K (nX)E GQAAK EFIAff LVKGR G37
(III) 其中n=4?10，优选为n=5?8 ;X为甘氨酸、丙氨酸或缬氨酸； 优选地，所述GLP-1类似物为:
SEQ ID N025: 7HAEGT FTSDV SSYK(GGGGG)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
SEQ ID N026: 7HAEGT FTSDV SSYK (GGGGG G)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N027: 7HAEGT FTSDV SSYK (GGGGG GG) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N028: 7HAEGT FTSDV SSYK (GGGGG GGG) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N029: 7HAEGT FTSDV SSYK(AAAAA)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
SEQ ID N030: 7HAEGT FTSDV SSYK (AAAAA A)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N03117HAEGT FTSDV SSYK (AAAAA AA) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N032: 7HAEGT FTSDV SSYK (AAAAA AAA) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N033: 7HAEGT FTSDV SSYK(VVVVV)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
SEQ ID N03417HAEGT FTSDV SSYK (VVVVV V) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N035: 7HAEGT FTSDV SSYK (VVVVV VV) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N036: 7HAEGT FTSDV SSYK (VVVVV VVV) E GQAA KEFIAff LVKGR G37。
5.如权利要求1所述的GLP-1类似物，其特征在于，所述GLP-1类似物具有下列通式IV:
7HAEGT FK(nX)SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37
(IV) 其中n=4?10，优选为n=5?8 ;X为甘氨酸、丙氨酸或缬氨酸； 优选地，所述GLP-1类似物为:
SEQ ID N037: 7HAEGT FK (GGGGG)SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
SEQ ID N038: 7HAEGT FK (GGGGG G) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N039: 7HAEGT FK (GGGGG GG) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N040: 7HAEGT FK (GGGGG GGG) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N04117HAEGT FK (AAAAA)SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
SEQ ID N042: 7HAEGT FK (AAAAA A) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N043: 7HAEGT FK (AAAAA AA) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N04417HAEGT FK (AAAAA AAA) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N045: 7HAEGT FK (VVVVV)SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
SEQ ID N046: 7HAEGT FK (VVVVV V) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N047: 7HAEGT FK (VVVVV VV) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N048: 7HAEGT FK (VVVVV VVV) SDV SSYLE GQAA KEFIAff LVKGR G37。
6.如权利要求1-5中任一项所述的GLP-1类似物的制备方法，所述制备方法包括Fmoc策略的固相多肽合成。
7.如权利要求1-5中任一项所述的GLP-1类似物在制备治疗糖尿病、肥胖症及其相关疾病的药物中的应用。
8.如权利要求1-5中任一项所述的GLP-1类似物在制备预防肥胖症的药物中的应用。
9.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-5中任一项所述的GLP-1类似物和一种或多种药学上可接受的辅料。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物优选为注射剂，进一步优选为冻干粉针或溶液注射剂。
【文档编号】A61P3/10GK104262481SQ201310347849
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2013年8月9日 优先权日:2013年8月9日
【发明者】孔维苓, 郑学敏, 王玉丽, 徐为人, 汤立达, 龚珉 申请人:天津药物研究院有限公司