卵巢功能降低预防或改善剂的制作方法

本发明涉及一种含有紫檀芪的卵巢功能降低预防或改善剂。

背景技术：

女性的年龄与妊娠有密切的关系，存在妊娠率随着年龄增长而变低的倾向。作为其主要理由之一，有卵巢内的卵子的数量降低以及质量降低。女性在出生时，所有的卵原细胞已经存在于卵巢内，随着年龄增长，卵子变少，其质量也降低。在女性的结婚年龄逐年增高的现代，可以说：即使没有明确的不孕原因，因由年龄增长引起的卵巢功能降低、即卵巢内的卵子的数量降低以及质量降低而难以妊娠的女性也正在增加。

近年来，体外受精、显微授精等先进生殖辅助医疗技术取得了进步，但对于由卵巢功能降低引起的妊娠率降低而言，存在即使拥有最先进的生殖医疗也无法治疗的现实。因此，需要抑制卵巢功能降低的方法。

紫檀芪是豆科植物的印度吉纳树等中所含的具有芪(stilbene)骨架的化合物。已知：紫檀芪具有抗氧化作用、血栓预防治疗作用(专利文献1)、ldl胆固醇降低、胰岛素抵抗性改善、抗炎症作用、癌抑制作用(非专利文献1)等生理活性。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2016-44134号

非专利文献

非专利文献1：alternativemedicinereview2010；15:159-163

技术实现要素：

发明所要解决的问题

在现代社会中，根据适合妊娠的年龄期和希望妊娠的年龄期的差距、由希望妊娠的年龄期的卵巢功能降低引起的现代型不孕症的病例正在增加，期望预防和/或改善方法。此外，即使在畜产领域等中，也需要抑制由卵巢功能降低引起的妊娠率降低的方法。为了满足这些需求，本发明的问题在于提供一种对卵巢功能降低的预防和/或改善有效的制剂。

用于解决问题的方案

本发明人等为了解决上述问题而进行了深入研究。其结果是，发现了紫檀芪对由年龄增长等引起的卵巢功能降低的预防和/或改善是有效的。基于该发现，完成了本发明。

即，本发明如下所述。

[1]一种卵巢功能降低预防或改善剂，其含有紫檀芪。

[2]一种卵巢功能降低预防或改善用医药组合物，其含有[1]所述的卵巢功能降低预防或改善剂。

[3]一种卵巢功能降低预防或改善用饮食品组合物，其含有[1]所述的卵巢功能降低预防或改善剂。

发明效果

根据本发明，可提供一种对由年龄增长等引起的卵巢功能降低的预防和/或治疗有效的制剂。

附图说明

图1是表示使用了紫檀芪的实验设计的图。

图2是表示紫檀芪摄取的试验开始时和试验结束时的各组小鼠体重的图。a表示25周龄的各组小鼠(试验开始时)的体重。b表示47周龄的各组小鼠(试验结束时)的体重。

图3是表示摄取了紫檀芪的小鼠的体外受精以及胚胎培养的结果的图。a表示各组小鼠的排卵卵子数。b表示各组小鼠的受精率。c表示各组小鼠的胚泡形成率。

图4是表示从摄取了紫檀芪的小鼠得到的胚胎的胚胎移植的结果的图。a表示各组小鼠的着床率。b表示各组小鼠的生仔获得率。c表示各组小鼠的流产率。d表示在紫檀芪22周摄取组的胚胎移植后出生的仔和胎盘的肉眼观察结果(照片)。

图5是表示从摄取了紫檀芪的小鼠得到的生仔体重以及胎盘重量的图。a表示各组小鼠的生仔体重。b表示各组小鼠的胎盘重量。

图6是表示从紫檀芪22周摄取组的小鼠得到的幼仔及其幼仔们的图(照片)。

图7是表示使用了白藜芦醇的实验设计的图。

图8是表示白藜芦醇摄取的试验开始时和试验结束时的各组小鼠体重的图。a表示25周龄的各组小鼠(试验开始时)的体重。b表示47周龄的各组小鼠(试验结束时)的体重。

图9是表示摄取了白藜芦醇的小鼠的体外受精以及胚胎培养的结果的图。a表示各组小鼠的排卵卵子数。b表示各组小鼠的受精率。c表示各组小鼠的胚泡形成率。

图10是表示从摄取了白藜芦醇的小鼠得到的胚胎的胚胎移植的结果的图。a表示各组小鼠的着床率。b表示各组小鼠的生仔获得率。c表示各组小鼠的流产率。

图11是表示使用了紫檀芪的实验设计的图。

图12是表示摄取了紫檀芪的小鼠的排卵卵子数的图。

图13是表示摄取了紫檀芪的小鼠的卵子内线粒体活性的分析结果的图。a表示通过共聚焦激光显微镜得到的观察结果(照片)。b表示卵子内线粒体活性的平均强度。

图14是表示摄取了紫檀芪的小鼠的卵子内atp量的图。

图15是表示摄取了紫檀芪的小鼠的卵子内线粒体dna的拷贝数的图。

图16是表示摄取了紫檀芪或白藜芦醇的小鼠的紫檀芪或白藜芦醇的血清中浓度的图。a是表示摄取了紫檀芪的小鼠的紫檀芪的血清中浓度的图。b是表示摄取了白藜芦醇的小鼠的白藜芦醇的血清中浓度的图。

图17是表示摄取了紫檀芪和白藜芦醇的小鼠的各化合物的血清中浓度的图。

图18是表示摄取了紫檀芪的小鼠卵巢组织的tunel染色图像的图(照片)。a表示小鼠卵巢组织的tunel染色图像。b表示a的放大图。

图19是表示摄取了紫檀芪的小鼠卵巢组织的8-ohdg染色图像的图(照片)。

具体实施方式

本发明的一个方式涉及一种含有紫檀芪的卵巢功能降低预防或改善剂。本发明中使用的紫檀芪(4’-羟基-3，5-二甲氧基-反式-二苯乙烯)(反式-1-(3，5-二甲氧基苯基)-2-(4-羟基苯基)乙烯)是以化学式c16h16o3表示的化合物。

(紫檀芪)

本发明的卵巢功能降低预防或改善剂的特征在于以紫檀芪为有效成分。本发明中使用的紫檀芪可以使用化学合成的紫檀芪或从天然物质得到的紫檀芪中的任一种。作为从天然物质得到的紫檀芪，例如可列举出从属于豆科紫檀属的植物印度吉纳树(pterocarpusmarsupium)得到的紫檀芪。作为紫檀芪的制造方法的一个例子，可列举出：通过常规方法破碎包含印度吉纳树的干、枝、叶、花、根的整棵树木、或者印度吉纳树的干、枝、叶、花、根，通过常规方法从破碎粉体得到含有紫檀芪的提取物的方法等。在本发明中，紫檀芪可以是提取物、破碎物的状态，也可以是适当提纯过的状态。在本发明中，可以将这样的含有紫檀芪的提取物、破碎粉体物、提纯物、化学合成物中的一种或两种以上组合使用。此外，紫檀芪也可以使用市售品。

(卵巢功能降低预防或改善剂)

本发明的卵巢功能降低预防或改善剂具有预防卵巢功能降低、以及改善/治疗已经降低的卵巢功能的作用。卵巢功能降低的预防或改善/治疗作用并不特别限定，例如可以是：抑制排卵卵子数降低/增加排卵卵子数、抑制卵子内线粒体活性降低/增加卵子内线粒体活性、抑制受精卵着床率降低/增加受精卵着床率、抑制生子(生仔)率降低/增加生子(生仔)率、抑制流产率增加/降低流产率、增加人工受精/体外受精/显微授精成功率等。

本发明的卵巢功能降低预防或改善剂具有预防卵巢功能降低、以及改善/治疗已经降低的卵巢功能的作用。因此，本发明的卵巢功能降低预防或改善剂例如对预防、改善、治疗因由年龄增长等引起的卵巢功能降低而导致的不孕以及增加人工受精/体外受精/显微授精成功率等是有效的。

本发明的卵巢功能降低预防或改善剂以需要预防、改善、治疗由卵巢功能降低引起的不孕以及增加人工受精/体外受精/显微授精成功率等的哺乳类为对象，并不特别限定。作为哺乳类并不特别限定，包括：人类、非人类动物，例如，猪类、牛类、牛科(bovids)、马类、水牛类等这样的对肉以及乳畜生产具有商业价值的动物等。

本发明的卵巢功能降低预防或改善剂的制造方法若含有紫檀芪作为有效成分，则并不特别限定。即，可以使用通常的医药的制药技术来进行制造。

对于本发明的卵巢功能降低预防或改善剂而言，除了作为有效成分的紫檀芪之外，根据需要，还可以含有赋形剂、粘合剂、防腐剂、氧化稳定剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂等医药的制药技术领域中通常使用的助剂等来制成医药组合物。

医药组合物中的紫檀芪的含量可以相对于医药组合物的总质量而言通常为0.01质量％～10质量％，优选为0.05质量％～5质量％，更优选为0.01质量％～0.5质量％。

本发明的卵巢功能降低预防或改善剂的给药途径可以是口服给药或非口服给药中的任一种。其剂型可根据给药途径适当选择。例如，可列举出：注射液、输液、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、肠溶剂、含片、内用液剂、悬浮剂、乳剂、糖浆剂、外用液剂、巴布剂、软膏剂、洗剂、栓剂、肠内营养剂等。

本发明的卵巢功能降低预防或改善剂的给药量根据给药目的(症状、症状的程度等)、给药对象者的状况(年龄、体重等)而不同，但通常对于成人，以紫檀芪量计，在口服给药的情况下，可以以每日0.1mg～1000mg给药，优选以1mg～100mg给药。

给药期间根据给药目的(症状、症状的程度等)、给药对象者的状况(年龄、体重等)而不同，但可以给药1天～200天，优选给药7天～100天。本发明的卵巢功能降低预防或改善剂对于生物体的安全性高，根据症状的改善程度或者出于预防发病或复发的目的，可以超过上述期间而进行长期给药。

(饮食品组合物等)

本发明的卵巢功能降低预防或改善剂除了作为医药品之外也可以用作准药品、功能性食品、特定保健用食品、营养助剂、饮食品等。在用作准药品的情况下，根据需要，可以与在准药品或化妆品等技术领域中通常使用的各种助剂一起使用。或者，在用作功能性食品、特定保健用食品、营养助剂、或饮食品的情况下，根据需要，可以与例如甜味料、香辛料、调味料、防腐剂、储存剂(preservative)、杀菌剂、抗氧化剂等在食品中通常使用的添加剂一起使用。此外，也可以以固体状、溶液状、悬浮液状、糖浆状、颗粒状、奶油状、糊状、果冻状等所期望的形状或者根据需要进行成形而使用。它们中所含的紫檀芪的比例并不特别限定，可以根据使用目的、使用形态、以及使用量进行适当选择。例如，准药品、功能性食品、特定保健用食品、营养助剂、饮食物中的紫檀芪的含量可以相对于组合物的总质量而言通常为0.01质量％～10质量％，优选为0.05质量％～5质量％，更优选为0.01质量％～0.5质量％。准药品、功能性食品、特定保健用食品、营养助剂、饮食品等可以使用各领域的通常的制造方法来进行制造。

实施例

以下举出实施例对本发明的详情进行说明，但本发明并不限定于以下的实施例。

＜实施例1＞

(实验动物)

将25周龄的icr雌性小鼠(日本clea，东京，日本)20只随机分为4个笼子，每个笼子5只。在室温22℃、湿度55％、间隔12小时的明暗环境下饲养小鼠。对于小鼠饲料而言，按照图1的实验设计所示的时间表，提供mf对照饲料(东方酵母，东京，日本)或者含有紫檀芪(silvinol90％，sabinsa日本公司，东京，日本)的饲料(含有紫檀芪0.04质量％)，每只小鼠每日6g。水分设为能随时自由地摄取的状态。饲养中每周进行一次体重测定。将25周时的各组小鼠的体重(组平均值)、以及47周时的各组小鼠的体重(组平均值)示于图2。

关于所有小鼠的处理、饲养，依据圣玛丽安娜医科大学的实验动物设施的基准。

如图2所示，对于试验开始时的25周龄的对照组与22周紫檀芪给药组之间的小鼠的体重没有观察到显著差异。此外，对于试验结束时的47周龄的对照组与22周紫檀芪给药组之间的小鼠的体重也没有观察到显著差异。

(体外受精以及胚胎培养)

超过了47周龄的小鼠通过阴道涂片确认了性周期。在发情前期的定时，将促性腺激素(aska制药公司，东京，日本)10iu给药至腹腔内。在给药后15小时，从输卵管内回收卵子卵丘细胞复合体(cocs：cumulusoocytecomplexes，卵丘卵母细胞复合体)，在100mltyh培养基(lsimediencecorporation，东京，日本)内进行30分钟预培养。其间，利用戊巴比妥(somnopentyl)麻醉药(共立制药，东京，日本)对icr雄性小鼠(10-12周龄)实施全身麻醉，并摘除附睾尾部。切开附睾尾部的一部分并以挤出的方式回收内部的精子。将所回收的精子块浸没在装有400mltyh培养基的1.5ml微量管(microtube)中，并在co2培养箱内进行了10分钟上游(swimup)(37℃，5％co2，95％空气)。以最终浓度为2-3×10⁵/ml的方式将上游后的精子加入至装有cocs的100mltyh培养基中，在co2培养箱(37℃，5％co2，95％空气)内培养了5-6小时。在30mlksom培养基(默克密理博，达姆施塔特，德国)内，对培养后的卵子进行精子的去除，此时计算出准确的排卵卵子数。之后，转移至另一个30mlksom培养基中，在co2培养箱内培养了4天。受精率和胚泡形成率分别通过二细胞期胚胎数/第二次减数分裂中期(mii)卵子数、胚泡数/二细胞期胚胎数计算出来。将结果示于图3。

如图3所示，对于对照组和22周紫檀芪给药组之间的排卵卵子数观察到显著差异(p<0.05；单因素方差分析(one-wayanova)，事后检验(posthoctest)：邓尼特法(dunnett法))。通过22周的紫檀芪给药，观察到排卵卵子数增加效果。

(胚胎移植以及剖腹产)

在培养4天后，对到达胚泡期胚胎的胚胎进行了胚胎移植。受体(recipient)小鼠是6-10周龄的icr雌性小鼠，使用了在采卵日的前一天与被进行了输精管结扎的icr雄性小鼠交配，并在第二天能够确认阴道栓的个体。利用戊巴比妥麻醉药实施全身麻醉，通过切开后背部使子宫露出。利用镊子固定子宫，利用30g的注射针(dentronics，东京，日本)在输卵管接合部开孔，插入吸进了胚泡的玻璃毛细管，将胚胎移植至子宫内部。移植后，小心地将子宫放回体内，缝合了后腹膜以及皮肤。在移植时，将从各组小鼠得到的胚泡按照个体分别移植至受体小鼠。将采卵的第二天设为第一天，在第十九天实施了剖腹产。使受体小鼠安乐死并进行开腹，摘除子宫并取出胎仔以及胎盘。着床率通过着床痕迹数/胚胎移植数计算出，生仔获得率通过生仔数/胚胎移植数计算出，流产率通过1－生仔获得率计算出。将结果示于图4。此外，对生仔体重以及胎盘重量进行了测定。将结果示于图5。

如图4所示，对于对照组与22周紫檀芪给药组之间的着床率、生仔获得率、流产率观察到显著差异(p<0.05；单因素方差分析，事后检验：邓尼特法)。通过22周的紫檀芪给药，观察到着床率增加、生仔获得率增加、流产率降低效果。需要说明的是，如图5所示，对于对照组与22周紫檀芪给药组之间的生仔体重以及胎盘重量没有观察到显著差异。

将从22周紫檀芪给药组得到的幼仔培育至成体，实施了交配试验。从22周紫檀芪给药组得到的幼仔没有应当特别记载的异常，正常完成了妊娠、分娩。因此，能够确认到繁殖能力也是正常的。将结果示于图6。

＜比较例1＞

使用与紫檀芪同样地作为芪衍生物的白藜芦醇进行了实验。

(实验动物)

将25周龄的icr雌性小鼠(日本clea，东京，日本)15只随机分为3个笼子，每个笼子5只。在室温22℃、湿度55％、间隔12小时的明暗环境下饲养小鼠。对于小鼠饲料而言，按照图7的实验设计所示的时间表，提供mf对照饲料(东方酵母，东京，日本)或者含有白藜芦醇(3，4'，5-三羟基-反式-芪(反式-1，2-(3，4'，5-三羟基二苯基)乙烯)，东京化成工业株式会社，东京，日本)的饲料(含有白藜芦醇0.04质量％)，每只小鼠每日6g。水分设为能随时自由地摄取的状态。饲养中每周进行了一次体重测定。将25周时的各组小鼠的体重(组平均值)、以及47周时的各组小鼠的体重(组平均值)示于图8。

关于所有小鼠的处理、饲养，依据圣玛丽安娜医科大学的实验动物设施的基准。

如图8所示，对于试验开始时的25周龄的对照组与22周白藜芦醇给药组之间的小鼠的体重没有观察到显著差异。此外，对于试验结束时的47周龄的对照组与22周白藜芦醇给药组之间的小鼠的体重也没有观察到显著差异。

(体外受精以及胚胎培养)

基于实施例1中记载的方法，对超过了47周龄的各组小鼠进行了体外受精以及胚胎培养。计算出排卵卵子数、受精率以及胚泡形成率。将结果示于图9。

如图9所示，对于对照组与22周白藜芦醇给药组之间的排卵卵子数、受精率、胚泡形成率没有观察到显著差异。

(胚胎移植以及剖腹产)

基于实施例1中记载的方法，对到达胚泡期胚胎的胚胎进行了胚胎移植以及剖腹产。计算出着床率、生仔获得率、流产率。将结果示于图10。

如图10所示，对于对照组与22周白藜芦醇给药组之间的着床率观察到显著差异(p<0.05；单因素方差分析，事后检验：邓尼特法)。通过22周的白藜芦醇给药，观察到着床率增加。另一方面，虽然对于生仔获得率以及流产率没有观察到统计学上的显著差异，但确认到生仔获得率增加倾向、流产率降低倾向。

紫檀芪与作为芪衍生物的白藜芦醇比较，显示出了：排卵卵子数增加、生仔率增加、流产率降低等效果优异，具有优异的卵巢功能降低的预防或改善/治疗作用。

＜实施例2＞

(实验动物)

将25周龄的icr雌性小鼠(日本clea，东京，日本)20只随机分为4个笼子，每个笼子5只。在室温22℃、湿度55％、间隔12小时的明暗环境下饲养小鼠。对于小鼠饲料而言，按照图11的实验设计所示的时间表，提供mf对照饲料(东方酵母，东京，日本)或者含有紫檀芪(silvinol90％，sabinsa日本公司，东京，日本)的饲料(含有紫檀芪0.04质量％)，每只小鼠每日6g。水分设为能随时自由地摄取的状态。本试验重复进行3次，在实验中使用了各组总计30只小鼠。

关于所有小鼠的处理、饲养，依据圣玛丽安娜医科大学的实验动物设施的基准。

(排卵卵子的回收)

超过了47周龄的小鼠通过阴道涂片确认了性周期。在发情前期的定时，将促性腺激素(aska制药公司，东京，日本)10iu给药至腹腔内。在给药后15小时，从输卵管内回收卵子卵丘细胞复合体(cocs：cumulusoocytecomplexes，卵丘卵母细胞复合体)，在m16培养基+透明质酸酶中剥离卵丘细胞，分离出卵子。此时，记录各组的排卵数。将结果示于图12。

如图12所示，对于对照组与紫檀芪给药组之间的排卵卵子数观察到显著差异(p<0.05；t-检验(t-test))。通过22周的紫檀芪给药，观察到排卵卵子数增加效果。

(卵子内线粒体活性的分析)

将分离出的卵子用添加了mitotracker以及hoechst33342的m16培养基处理10分钟。之后，用m16培养基清洗3次，用共聚焦激光显微镜(lsm510：zeiss)进行了观察、荧光强度的测定。将结果示于图13。

如图13所示，对于对照组与紫檀芪给药组之间的卵子内线粒体活性观察到显著差异(p<0.05；t-检验)。通过22周的紫檀芪给药，观察到卵子内的线粒体活性增强效果。

(卵子内atp量测定)

将分离出的卵子用酸化台式液(acidifiedtyrode'ssolution)进行处理，去除了透明带。将所得的卵细胞质与5μl的m16培养基一起转移至1.5ml微量管中，并在－20℃下进行保存。日后，使用atp-glo测定试剂盒(atp-gloassaykit)，通过多光谱酶标仪(multi-spectromicroplatereader)(varioskanflash：thermoscientific)来测定发光，由此测定出atp量。将结果示于图14。

如图14所示，对于对照组与紫檀芪给药组之间的卵子内atp含量没有观察到统计学上的显著差异。但是，紫檀芪给药组与对照组相比显示出atp含量更高的倾向。

(卵子内线粒体dna拷贝数分析)

将分离出的卵子用酸化台式液进行处理，去除了透明带。将所得的卵细胞质与10μl的裂解缓冲液(lysisbuffer)一起转移至1.5ml微量管中，并在－20℃下进行保存。日后，将细胞裂解物(celllysate)作为模板(template)实施实时pcr(polymerasechainreaction，聚合酶链式反应)。根据所得的结果，计算出线粒体dna拷贝数。将结果示于图15。

对于对照组与紫檀芪给药组之间的卵子内线粒体dna拷贝数、atp含量没有观察到统计学上的显著差异。没有观察到通过22周的紫檀芪给药带来的卵子内线粒体dna拷贝数增加效果。

＜实施例3＞

(血中紫檀芪以及白藜芦醇浓度测定)

使用在实施例1以及比较例1中的怀孕性试验实施时回收并在－80℃下保存的血清样品进行了实施。血清样品在冻结状态下送往株式会社住化分析中心。委托通过lc-ms(liquidchromatography-massspectrometer，液相色谱-质谱)和hplc(highperformanceliquidchromatography，高效液相色谱)进行了分析。将结果示于图16。

如图16所示，在给药了紫檀芪的各组中从血清中检测到了紫檀芪。此外，在非给药组(对照)中，完全没有检测到。同样地，白藜芦醇也仅在给药组中被检测到。认为：在紫檀芪试验组中，给药组之间的血液中浓度没有显著差异，紫檀芪与给药期间没有关系且稳定地存在于血液中。另一方面，在白藜芦醇试验组中，长期给药组(22wk)的血液中浓度与短期给药组(1wk)相比显著减少(p<0.05；t-检验)。

＜参考例＞

(反式白藜芦醇给药实验)

紫檀芪是白藜芦醇的甲基化结构体，是比一般经常使用的反式白藜芦醇更稳定的结构体。在与实施例2的紫檀芪给药的添加实验设计完全相同的设计中，通过实施反式白藜芦醇添加给药实验，并比较血液中浓度，研究了在生物体内的稳定性。将结果示于图17。

如图17所示，紫檀芪给药组的血清中浓度为反式白藜芦醇给药组的血清中浓度的约70倍(p<0.05；t-检验)。由于不是完全相同的物质，因此不能一概而论，但在以相同条件给药的情况下，确认了紫檀芪更稳定地存在于血液中，显示出了紫檀芪的有用性。

＜实施例4＞

(卵巢组织分析)

使用在实施例1中的怀孕性试验实施时回收并进行福尔马林固定后保存的卵巢组织(对照以及22wk)，实施了组织分析。将卵巢组织用石蜡包埋，利用切片机(microtome)制作出4μm厚度的切片。使用所制作的切片，实施tunel染色以及8-ohdg染色，利用荧光显微镜(bz-x710：keyence)进行了观察。在tunel染色中检测了细胞的凋亡(apoptosis)，在8-ohdg染色中研究了细胞dna的氧化损伤。将结果示于图18以及19。

如图18、19所示，在紫檀芪给药组的卵巢中，与作为非给药组的对照的卵巢相比，显示出了凋亡以及氧化损伤减少的可能性。

产业上的可利用性

本发明能适用于医药、饮食品等。