用微小RNA治疗糖尿病溃疡的方法与流程

本发明是关于通过给予微小rna(microrna)或其载体来治疗糖尿病患者溃疡的新方法，尤其是关于应用微小rna-210及其前体治疗和/或促进糖尿病溃疡的愈合。

背景技术：

在本说明书中列出或讨论的显然是先前出版的文件不应被认为是现有技术的一部分或是公知常识。

糖尿病(糖尿病)是指体内葡萄糖稳态失衡而导致的长期血糖增高的一组疾病。糖尿病的主要亚型有1型糖尿病(或胰岛素依赖型糖尿病)和2型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病)。

糖尿病患者是发生皮肤溃疡的高危人群。发生皮肤溃疡的风险最大的区域为腿部，尤其是足部。慢性高血糖症常导致周围神经病变，进而引发足部和腿部肌肉群的协调性丧失，这增加了步行期间的机械应力，从而增大了小腿或足上形成溃疡的可能性。而且受周围神经病的影响，四肢的疼痛感也会降低，从而使患者缺乏实施预防性措施的认识，进一步增加了溃疡形成的可能性。在其他情况下，糖尿病晚期发展的血管疾病也可能导致溃疡病变的形成。

除了增加溃疡形成的可能性外，与糖尿病相关的生物学因素也对开放性伤口的正常愈合造成损害。糖尿病溃疡，尤其是糖尿病足部溃疡是糖尿病最严重的并发症之一。确实，与其他糖尿病的并发症相比，糖尿病足部溃疡更易导致患者住院治疗。在美国，糖尿病是非创伤性下肢截肢的主要原因，每年约有5％的糖尿病患者发展为足部溃疡，有1％的糖尿病患者需要截肢。

目前，尚无有效的治疗糖尿病足溃疡的方法。因此，对此类治疗有着显著的未满足的需求。

技术实现要素：

发明人现在令人惊讶地发现，成熟的微小rna-210或其前体的应用可以促进糖尿病溃疡患者的溃疡愈合。

治疗方法

在本发明的第一方面，本发明提供了一种在糖尿病患者中治疗溃疡的方法。该方法包括把有效治疗量的含有成熟的微小rna-210及成熟的微小rna-210的前体的一组核酸给予需要这种治疗的患者。

也可以说，本发明的第一方面是应用包括成熟的微小rna-210及成熟的微小rna-210的前体的一组核酸治疗糖尿病患者的溃疡。

或者也可以说，本发明的第一方面是应用包括成熟的微小rna-210及成熟的微小rna-210的前体的一组核酸制造用于治疗糖尿病患者的溃疡的药物。

除非另有说明，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。

除非上下文另有指示，否则应将本发明的给定条件、实施方式、特征或参数的偏好和选项视为已结合本发明所有其他方面、特征和参数的任何和所有优先权和选项进行了公开。

为了避免疑义，这里定义的成熟的微小rna-210及成熟的微小rna-210的前体，在本文中可以被称为"本发明的核酸"。

通过参考本领域技术人员可获得的资源，技术人员将能够鉴定如本文所定义的合适的成熟的微小rna及其前体。例如，本领域技术人员可以参考ncbi数据库和mirbase数据库(http://www.mirbase.org)等数据库，其中的内容完整地包含在本文中。

例如，技术人员将理解，成熟的微小rna-210(例如用于包括小鼠和人在内的多个物种)包含核苷酸序列cugguggugugacagcggcuga(seqidno：1)或由以上核苷酸序列组成。

为了避免疑惑，微小rna-210可以是指成熟的微小rna-210，pre-microrna-210和/或初级微小rna-210(pri-microrna-210)，这些术语将被本领域技术人员所理解。

如本文所述，本发明的核酸包括成熟的微小rna-210及其前体。适合的前体包括生物前体，例如可以通过一个或多个细胞加工步骤加工成成熟的微小rna-210和/或在将其加入细胞后形成成熟的微小rna-210的核酸。此类前体包括pri-microrna-210、pre-microrna-210、成熟的微小rna-210的双链模拟物和编码微小rna-210的载体。在某些实施方案中，核酸也可以是微小rna-210的双链模拟物。

技术人员应理解，pri-microrna-210和pre-microrna-210是成熟的微小rna-210的上游前体。不希望受理论的束缚，可以将pri-microrna-210理解为是指通过rna聚合酶ii对编码微小rna-210的基因产生的初级转录本，并且可将pre-microrna-210认为是成熟核糖核酸酶ii型酶drosha处理pri-microrna-210后产生的成熟的微小rna-210的发夹前体。在其较长的核苷酸序列中，pri-microrna-210和pre-microrna-210都包含成熟的微小rna-210的核苷酸序列(cugugcgugugacagcggcuga(seqid:1))。

成熟的微小rna-210的双链模拟物包括用于模拟内源性成熟的微小rna-210功能的人工双链寡核苷酸。这种模仿物在结构上可能与dicer核糖核酸酶裂解pre-microrna-210发夹后产生的双链rna相类似，因此可以被装载到rna诱导沉默复合物(risc)中，加工成单链成熟的微小rna-210。例如，miridianmir-210模拟物(miridianmmu-mir-210-3p；产品号:c-310570-05,dharmacon公司)就是一个适合的微小rna-210的双链模拟物。

技术人员将理解，载体是被用作在靶细胞中表达多核苷酸的重组核苷酸构建体。载体通常包括编码待表达的多核苷酸的核酸序列和促进该多核苷酸的有效转录的一种或多种调节(或控制)序列。载体的实施例包括质粒、病毒以及非病毒载体等。

如本文所述，编码微小rna-210的载体可以被理解为是包含编码微小rna-210的多核苷酸序列(pri-microrna-210、pre-microrna-210或成熟的微小rna-210(例如pri-microrna-210))以及可选的一个或多个调控序列的核酸分子。在一些示例中，载体是包含编码微小rna-210的多核苷酸序列(pri-microrna-210、pre-microrna-210或成熟的微小rna-210(例如pri-microrna-210))以及可选的一个或多个调控序列的dna分子。本领域的技术人员可以很容易地用已知的方法制备这类载体(例如，在green和sambrook编写的由coldspringharbourlaboratorypress(2012)出版的《molecularclone:alaboratorymanual,fourthedition》中描述的方法，其内容完整地包含在本文中)。

在一些实施方案中，成熟的微小rna-210包含核苷酸序列cugugcgugugacagcggcuga(seqidno：1)或由其组成。在替代实施方案中，可以使用本发明的核酸类似物，只要应用的成熟的微小rna-210或其前体使用之后产生的成熟微小rna保持调节其靶标的能力即可。此类类似物包括其中一个或多个碱基被取代或缺失的mirna序列。为了维持对靶mrna的活性，应优先保证与微小rna-210靶向mrna内的序列完全互补的‘种子’序列保持不变。在一些实施方案中，类似物与成熟的微小rna-210具有至少约75％的同一性或互补性。例如，与成熟的微小rna-210有至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约99％的同一性或互补性。为了避免疑惑，每种可能性均代表本发明的单独实施案例。

技术人员将理解，在医疗领域引入对特定病症的治疗(或是类似于该病症的治疗)具有其标准的含义。特别地，该术语可以指减轻与该病症有关的一种或多种临床症状的严重性。例如在糖尿病患者合并溃疡(即糖尿病溃疡)中，这可能指促进溃疡愈合，例如与未治疗的溃疡相比，使溃疡愈合(即，皮肤或粘膜(例如皮肤)愈合)的时间范围得到改善。这个时间范围可以在三至十二个月的范围内(例如六至十二个月)。在特定的实施方案中，例如神经性糖尿病溃疡，时间范围一般为三个月，而对于缺血性糖尿病溃疡，时间范围可以是六个月。除此之外，成功的治疗也可包括在一定时间范围内(例如一个月内、例如三个月内、例如六个月内)实现可测量的溃疡尺寸(例如宽度，深度，体积等)的减小。在一些实施方案中，溃疡的大小可以减少至少10％；例如，至少20％，比如至少50％(例如至少75％)。

如本文所用，患者指被治疗的活体，包括哺乳动物(例如，人)患者。因此，在本发明的第一方面的特定实施方案中，所述治疗是在哺乳动物(例如人)中进行的。

在本发明的替代第二方面，提供了一种促进糖尿病溃疡愈合的方法。该方法包括把有效治疗剂量的选自成熟的微小rna-210及其前体的核酸(即，如本文所定义的本发明的核酸)用于需要这种治疗的患者。

在本发明的另一个替代方面，提供了用选自成熟的微小rna-210和成熟的微小rna-210的前体的核酸(即，如本文所定义的本发明的核酸)来制造用于促进糖尿病溃疡愈合的药物。

在本发明的第三方面，提供了一种在患有糖尿病的患者中促进溃疡愈合的方法。该方法包括把有效治疗剂量的选自成熟的微小rna-210及成熟的微小rna-210的前体的核酸(即，如本文所定义的本发明的核酸)用于需要这种治疗的患者。

在本发明的可替代的第三方面，提供了应用选自成熟的微小rna-210及成熟的微小rna-210的前体的核酸(即，如本文所定义的本发明的核酸)促进糖尿病患者的溃疡愈合。

在本发明的另一个可选的第三方面，提供了应用选自成熟的微小rna-210和成熟的微小rna-210的前体的核酸(即，本文所定义的本发明的核酸)用于制造促进糖尿病患者溃疡愈合的药物。

为避免疑惑，本文所提到的促进糖尿病溃疡愈合和促进糖尿病患者的溃疡愈合都可理解为糖尿病患者(即糖尿病溃疡)的溃疡愈合率提高。例如，与未治疗的溃疡相比，在一定的时间范围内，溃疡愈合(即皮肤或粘膜(例如皮肤))愈合)的患者数增多或是溃疡愈合的时间得到改善。在特定的实施方案中，例如对于神经性糖尿病溃疡，时间范围可以是三个月；对于缺血性糖尿病性溃疡，时间范围可以是六个月。除此之外，促进糖尿病性溃疡愈合也可通过一定时间范围内(例如一个月内、例如三个月内、例如六个月内)测量的溃疡尺寸(例如宽度、深度、体积等)的减小来评估。在某些实施方案中，应用本发明的核酸治疗后，溃疡的大小可减少至少10％，或至少20％，或至少50％(甚至，至少75％)。

如本文所用，术语糖尿病可被理解为包括1型糖尿病、2型糖尿病和较不常见的亚型，例如妊娠糖尿病、年轻人的成年发作型糖尿病(mody)、成人潜伏性自身免疫糖尿病(lada)、和囊性纤维化相关糖尿病(cfrd)等。

在本发明的第一至第三方面的特定实施方案中，对糖尿病的提及(例如在糖尿病患者中)将指1型或2型糖尿病。

技术人员将理解，术语溃疡可指由于皮肤或粘膜破裂而愈合缓慢和/或无法愈合而引起的内部或外部身体表面上的开放性病变。溃疡可在一系列身体表面上形成，例如在口腔、胃肠道或皮肤上。在本发明的第一至第三方面的特定实施方案中，用本发明的核酸治疗的溃疡发生在皮肤上，这种溃疡可以称为皮肤溃疡。

技术人员将理解，皮肤溃疡可以位于被治疗的患者身体上的任何位置。在本发明的第一到第三方面的特定实施例中，溃疡可以位于被治疗的患者的腿或足(例如足)上。此类溃疡可分别称为“腿溃疡”和“足溃疡”。在本发明的第一至第三方面的特定实施方案中，所述溃疡不是缺血性溃疡(即，所述溃疡是非缺血性溃疡)。

患有糖尿病的患者的溃疡可以被称为糖尿病溃疡。在某些实施方案中，溃疡是糖尿病溃疡。在本发明的第一至第三方面的更具体的实施方案中，所述溃疡是糖尿病腿溃疡或糖尿病足溃疡(例如糖尿病足溃疡)。

如本文所用，术语(糖尿病)腿溃疡可理解为是指在患病患者的腿上形成的溃疡。这样的溃疡可以在大腿上(例如在腹股沟和/或在大腿上)、在膝盖上/周围、和/或更具体地在小腿(例如在胫骨，小腿和/或踝上/踝周围)上。术语(糖尿病)足溃疡可以理解为是指在患病患者的脚上形成的溃疡。这种溃疡可能在脚踝上/周围，脚上，脚跟上/周围，脚趾上和/或更特别地在脚的底部(即脚底)上形成。为了避免疑惑，在患病患者的脚踝上/周围形成的溃疡可能属于(糖尿病)腿和足溃疡的定义。

糖尿病溃疡(例如糖尿病足溃疡)可根据引起其发病的潜在病因分为不同的亚型。在患肢中患有由糖尿病引起的周围神经病(最好基本上没有血管疾病)的患者发生的溃疡可被称为神经性糖尿病溃疡，而在患有血管疾病(例如糖尿病引起的血管疾病)的患者患肢中发生的溃疡可能称为缺血性糖尿病溃疡。糖尿病溃疡也可能具有混合的病因，这种溃疡可以称为神经缺血性溃疡。

不希望被理论所束缚，据信，由于慢性高血糖症导致所有糖尿病溃疡中的低氧反应受损，因此，无需考虑病因，本发明的核酸的应用可为糖尿病溃疡(例如糖尿病皮肤溃疡)提供有效的治疗。

因此，在本发明的第一至第三方面的某些实施方案中，(糖尿病)溃疡(例如，糖尿病腿或足溃疡(例如，糖尿病足溃疡))是神经性糖尿病性皮肤溃疡(例如，神经性糖尿病腿或足溃疡(例如，神经性糖尿病足溃疡))。在特定的实施方案中，神经性糖尿病溃疡(例如，神经性糖尿病腿或足溃疡(例如神经性糖尿病足溃疡))不是缺血性溃疡(即，神经性糖尿病性溃疡为非缺血性溃疡)。

在本发明的第一个至第三个方面的替代性实施方案中，糖尿病皮肤溃疡(例如，糖尿病腿溃疡或足溃疡(例如，糖尿病足溃疡))是缺血性的糖尿病性皮肤溃疡(例如，缺血性的糖尿病腿或足溃疡(例如，缺血性的糖尿病足溃疡))。

在其他替代实施方案中，糖尿病皮肤溃疡(例如，糖尿病腿溃疡或足溃疡(例如，糖尿病足溃疡))是神经缺血性糖尿病皮肤溃疡(例如，神经缺血性糖尿病腿或足溃疡(例如，神经缺血性糖尿病足溃疡))。

为了避免疑惑，上文中本发明的第一至第三方面描述的所有优选方案和实施案例均等同地适用于本发明的第四至第七方面，如下文所述。

其他治疗方法

不希望受理论的束缚，据信微小rna-210可增强糖尿病患者体内由于长期慢性高糖而导致的缺氧应答减弱，进而促进糖尿病溃疡的愈合。成纤维细胞是负责产生纤维组织如胶原蛋白和细胞外基质的细胞，在高糖条件下，成纤维细胞的增殖与迁移受到影响是缺氧应答受损伤的一部分。

根据本发明的第四方面，提供了一种增强糖尿病性溃疡中的低氧反应的方法。这方法将包括选自成熟的微小rna-210及成熟的微小rna-210的前体的核酸(即，本文所定义的本发明的核酸)用于需要其的患者。

技术人员将理解，增强低氧反应可以指在低氧条件下改善由低氧诱导因子1(hif-1)介导的一种或多种过程。例如血管生成、细胞增殖、细胞存活、细胞迁移、红细胞生成和细胞分化(例如成纤维细胞增殖、迁移和分化)、内皮前体细胞募集、和抗菌能力。

根据本发明的第五方面，提供了一种在糖尿病溃疡中恢复成纤维细胞功能(例如细胞外基质和胶原蛋白的增殖和迁移和/或合成)的方法。这方法将包括选自成熟的微小rna-210及成熟的微小rna-210的前体的核酸(即，本文所定义的本发明的核酸)用于需要其的患者。

根据本发明的第六方面，提供了一种在糖尿病性溃疡中促进真皮组织中细胞外基质和/或胶原蛋白形成的方法。这方法将包括选自成熟的微小rna-210及成熟的微小rna-210的前体的核酸(即，本文所定义的本发明的核酸)用于需要其的患者。

技术人员将理解，溃疡愈合的最后阶段(例如糖尿病溃疡愈合)的关键过程是伤口的再上皮化。

根据本发明的第七方面，提供了促进糖尿病溃疡再上皮化的方法。这方法将包括选自成熟的微小rna-210及成熟的微小rna-210的前体的核酸(即，本文所定义的本发明的核酸)用于需要其的患者。

药物组成

如本文所述，本发明中的核酸可用作药物。这种核酸既可以单独使用也可以加入到已知的药物组合物/制剂中使用。

本领域技术人员应理解，本文中定义的核酸可以以药物组合物的形式给药，在治疗中能够促进愈合，增强缺氧反应，恢复成纤维细胞功能，促进细胞外基质和/或胶原蛋白的形成以及促进本文所定义的再上皮化(例如，本发明的第一至第七方面)。

因此，在本发明的第八方面，提供了一种药物组合物。它包含选自成熟的微小rna-210及成熟的微小rna-210的前体的核酸(即，本文所定义的本发明的核酸)和任意一种或多种药学上可接受的佐剂、稀释剂和/或载体，用于本文所定义的治疗和方法(例如，用于本发明的第一至第七方面)。

在本发明的替代第八方面，提供了如本文所定义的(治疗有效量)药物组合物方法(例如，用于本发明的第一至第七方面)。这种药物组合物包含选自成熟的微小rna-210及成熟的微小rna-210的前体的核酸(即，本文所定义的本发明的核酸)和任意一种或多种药学上可接受的赋形剂，用于需要其的患者。

药学上可接受的赋形剂包括媒介、佐剂、载体、稀释剂、ph调节剂和缓冲剂、张度调节剂、稳定剂、湿润剂等。

技术人员将理解，本发明的核酸可以局部应用(即在溃疡部位)。因此，技术人员将理解，本发明的第一至第八方面所述的核酸和组合物可以以药学上可接受的剂型局部使用。合适的给药途径可包括直接给药于皮肤(皮肤)或粘膜表面、皮下、皮内或透皮给药(例如通过微针注射或透皮贴剂)。

合适的剂型包括例如脂质体系统(例如混悬剂)和乳剂，并且可以是液体、洗剂、乳膏、软膏和/或气雾剂的形式。液体制剂可以是水基或油基的，也可以以干粉形式制备，在使用前用合适的溶剂复溶。

根据一些实施方案，可应用多种递送系统将本发明的核酸转移/引入细胞中，例如封装在脂质体、靶向脂质体、树突状聚甘油胺纳米载体、纳米颗粒、微粒、微胶囊、电穿孔、核转染、基于超声的、基于激光的、能够表达微小rna-210的重组细胞、受体介导的内吞作用、构建微小rna-210作为病毒载体或其他载体的一部分、能够在感染过程中不杀死细胞进行复制的病毒载体、不能复制的病毒载体、注射能够产生本发明核酸的病毒载体的细胞、注射多核苷酸、电穿孔、磷酸钙介导的转染等，或本领域技术人员已知的任何其他方法。

技术人员将理解，本发明的核酸和包含其的组合物可以以不同的剂量(例如，如上所述的制剂)给予，本领域技术人员可以容易地确定合适的剂量。可以根据要递送的核酸(即裸rna、载体、所使用的递送颗粒等)的药理学性质选择给药的剂量和频率。在一些实施方案中，本发明的核酸(单独或与其他试剂组合)可以以每天每次使用/治疗约0.01mg至约10mg之间的剂量来应用。

例如，可以在每次给药/治疗约0.01mg至约8mg之间，也可每次给药/治疗约0.01mg至约2mg之间，也可每次给药/治疗约0.05mg至约4mg之间。有时也可以每次给药/治疗约0.05mg至约2mg，更特别地也可每次给药/治疗约0.08mg至约2mg(例如，每次给药/治疗约0.08mg至约1mg)。或者每次使用/治疗的量可以在约0.5mg至约9mg之间。在一些示例性实施方案中，本发明的核酸可以在盐溶液(例如pbs)中配制。在一些实施方案中，本文公开的剂量可以在任何方案下应用，例如每天1至5次、每周1至10次或每月1至15次，其中此类应用可以在相同或不同的时间进行。这种应用可有不同的时间间隔且可在一天中的相同或不同时间应用。

如本文中所使用的，术语"约"可用于指代一系列数值，可被理解为所述值的±10％的变化，特别是±5％，也可指代±2％(例如±1％)的变化。

本发明的核酸可以允许向每个被治疗的细胞递送至少一个拷贝(即成熟的微小rna-210)的任何剂量。更高的剂量可以产生改善的效果，例如至少5个拷贝或至少10个拷贝，例如至少100个拷贝或至少500个拷贝(例如至少1000个拷贝)。

为了避免疑惑，技术人员(例如，医师)应能够确定最适合患者的个体化的实际剂量。该剂量可能会随给药途径、所要治疗的患者的病情类型和严重程度、以及所治疗患者的人种、年龄、体重、性别、肾功能、肝功能和患者治疗后的特殊反应而发生变化。上述剂量是示例性的。当然，在个别情况下，应设定较高或较低的剂量范围，并且这也在本发明的范围之内。

本发明所述的核酸和方法具有的优点是：与现有治疗方法相比，无论是按照上述所述方法还是其他方式使用，它们可能更有效、毒性更低、作用时间更长、效价更高、产生的副作用更少、和/或具有其他有用的药理特性。尤其是这样的方法还具有如下优点：它们显著改善了糖尿病溃疡患者的溃疡愈合，从而改善了其预后。

附图说明

图1说明了mir-210模拟物对糖尿病小鼠伤口愈合的影响。与阴性对照相比，mir-210模拟物明显改善伤口愈合速率。

图2说明了mir-210模拟物与对照相比对人成纤维细胞迁移的影响。在常氧常糖(n5)、低氧常糖(h5)、以及低氧高糖(h30)状态下探索了其作用。在低氧高糖状态下，与对照组相比，mir-210模拟物能显著提高纤维细胞的迁移。

图3说明mir-210模拟物与对照相比对人成纤维细胞增殖的影响。在常氧常糖(n5)、常氧高糖(n30)、低氧常糖(h5)、以及低氧高糖(h30)状态下探索了其作用。在低氧高糖状态下，与对照组相比，mir-210模拟物能显著提高纤维细胞的迁移。

示例

通过以下实施例解释本发明，但决不限于此。

实施例1：局部注射微小rna-210模拟物对糖尿病小鼠伤口愈合的影响

皮内注射微小rna-210(mir-210)模拟物和阴性对照

使用c57bi/6j背景(charlesrivers，jacksonlabs，usa)的12周龄雄性糖尿病(db/db)小鼠。所有实验组均为年龄、体重、血糖匹配。3％异氟烷(abbott)将小鼠麻醉。用刮刀以及脱毛膏去除小鼠背部的毛发。用酒精清洗皮肤后，在背部中线两侧使用6mm活检打孔器制造创口。小鼠通过每日两次的丁丙诺啡(003毫克/公斤体重)注射来缓解了创伤后前两天任何潜在的痛苦，并在创伤后放置于单笼饲养。

创伤后，0.125nmolmiridianmir-210模拟物(miridianmmu-mir-210-3p(基于序列mimat0000658(cugugcgugugacagcggcuga(seqidno：1)；目录号：c-310570-05；dharmacon))或阴性对照(miridiancel-mir-67(基于序列mimat0000039(ucacaaccuccuagaaagaguaga(seqidno：2)；cat#：cn-001000-01；dharmacon)沿伤口边缘皮内注射。创伤后第6天重复注射。创伤后12天后从注射部位取出伤口和完整的皮肤。

伤口愈合评价

在创伤当日以及处死前每隔一日对伤口进行拍照。将已知面积的圆形参考放置在受伤小鼠的旁边同时拍照。使用imagej软件(美国国立卫生研究院)计算伤口面积与已知圆形参考面积的比例，并表示为初始伤口面积的百分比。从图1可以看出，与阴性对照相比，mir-210模拟物改善了伤口愈合的速率。

实施例2：在常糖与高糖、低氧与常氧环境下，微小rna-210模拟物对成纤维细胞迁移的影响

微小rna-210(mir-210)模拟物在hdf细胞中的转染：

在第一天，将人真皮成纤维细胞(hdf)细胞以80-90％的密度接种。第二天，用1、10和20nmmir-210模拟物(miridianmmu-mir-210-3p；目录号:c-310570-05；dharmacon公司)或阴性对照(miridiancel-mir-67；目录号:cn-001000)用rnaimax(thermofisherscientific公司，目录号:13778075)转染剂进行转染。48小时后进行细胞迁移分析。

细胞迁移分析

在24孔培养板中接种和转染hdf细胞。48小时后，刮擦，将细胞在常氧(21％o2)或低氧(1％o2)环境下暴露于常糖(5mm)或高糖(30mm)。细胞处于血清饥饿状态，加入丝裂霉素-c(10ug/ml，roche公司，目录号:10107409001)抑制细胞增殖。用0小时和24小时无细胞的区域面积计算迁移。如图2所示，在低氧高糖条件下，微小rna-210模拟物显著增加了成纤维细胞迁移。

实施例3：在正常和高糖以及低氧和常氧条件下，微小rna-210模拟物对成纤维细胞增殖的影响

在hdf细胞中的转染微小rna-210(mir-210)模拟物

第一天以80％-90％的密度接种人真皮成纤维细胞(hdf)细胞。第二天，1、10和20nmmir-210模拟物(miridianμ-mir-210-3p；目录号：c-310570-05；dharmacon公司)或阴性对照(miridiancel-mir-67；目录号：cn-001000-01；dharmacon公司)用rnaimax转染试剂(thermofisherscientific公司，目录号：13778075)转染。48小时后进行细胞增殖分析。

细胞增殖分析

将hdf细胞饥饿24小时，暴露于在常氧(21％o2)或低氧(1％o2)以及常糖(5mm)或高糖(30mm)24小时。使用brdu细胞增殖elisa试剂盒(abcam公司，ab-126556)测量细胞增殖。从图3可以看出，在低氧和高糖条件下，微小rna-210模拟物显著增加了成纤维细胞的增殖。