本发明涉及植物多酚的制备和应用，具体属于一种酸枣仁水溶性结合态多酚及其制备方法，以及该结合态多酚在抗肿瘤药物、特殊医药食品及保健食品中的应用。
背景技术：
酸枣仁(学名：ziziphusjujubamill.var.spinosa)，英文：zizyphispinosisemen是鼠李科植物酸枣的干燥成熟种子，是使用历史悠久的传统中药，我国分布较广，朝鲜俄罗斯也有分布。作为药用，中医将其列为养心安神药类，功用以补肝、宁心、敛汗、生津为主，用于虚烦不眠，惊悸多梦，体虚多汗等，被中国药典2000年版收载，在临床用药和多种保健品中，酸枣仁是镇静安神药的主要成分。研究发现：酸枣仁中含有多种活性成分，如酸枣仁皂苷、萜类化合物白桦脂酸及其衍生物，对中枢神经系统、心血管、降血脂、抗肿瘤及提高免疫力等有显著功效。
植物多酚类物质主要以自由态和结合态多酚两种形式存在。有研究表明，植物中的许多结合态多酚化合物具有抗氧化、抑菌、消炎、降血脂、降血糖、抗肿瘤、增强免疫力功能。不同种类的植物多酚其组分差异较大，其制备工艺也各不相同，因此，针对不同的材料，需要优化改进确定其合适的多酚提取方法。目前对于酸枣仁多酚，尤其是对于结合态多酚的制备工艺尚未见报道，本实验以北方地区酸枣仁为材料，通过优化制备工艺获得一种水溶性结合态多酚，该多酚能够显著抑制多种肿瘤细胞的增殖，尤其能够逆转肿瘤的多药耐药性，因此，本发明为酸枣仁这一传统中药赋予了新的开发和利用价值，同时也将应用于抗肿瘤药物、特殊医药食品及保健品制剂的开发。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种酸枣仁水溶性结合态多酚及其制备方法，以及该多酚在制备抗肿瘤药物、特殊医药食品及保健食品中的应用。该制备方法工艺简单，得率高，耗时短，方便大规模生产。该结合态多酚抗肿瘤活性显著。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
一种酸枣仁水溶性结合态多酚(zssbp)的制备方法，包括如下步骤：
第一步：按体积比1:9取浓硫酸和甲醇配制成酸水解液，酸水解液中硫酸的浓度为1.84mol/l；
第二步：酸枣仁粉碎后，加入预冷的丙酮，4℃下均匀搅拌30-40min，离心，去上清液，残渣重复提取1-2次，留残渣；
所述丙酮的浓度优选为80％；所述的酸枣仁和丙酮重量体积比(w/v)优选为1g︰15-20ml；离心时，离心速度优选为5000rpm，温度优选为4℃，离心时间优选为10min；
第三步：将收集的残渣中加入按第一步配置的酸水解液，用摇床充分孵育消化，然后加入适量10mol/lnaoh溶液使消化溶液ph至中性终止消化；
所述的酸枣仁残渣和酸水解液重量体积比(w/v)优选为1g︰10-15ml；所述消化温度优选为37℃，消化时间优选为1.5-2h；
第四步：终止消化后，离心，弃沉淀，在上清液中加入等体积的乙酸乙酯重复萃取2-3次，离心，取下层水相，得结合态多酚提取液；
所述的离心时，离心速度优选为11,000rpm，温度优选为4℃，离心时间优选为10min；
第五步：将上述获得的结合态多酚提取液在45℃下旋转蒸发，除净有机溶剂，真空冷冻干燥成粉末即得结合态多酚样品，于4℃保存。
与现有技术相比，本发明主要是对传统的酸水解法进行了优化改进，主要包括用浓硫酸代替了浓盐酸，并降低了酸解液中硫酸的浓度；同时大大降低了酸水解的时间和水解温度，以减少酸解时间过长和温度过高处理造成结合态多酚的氧化分解，节省了提取时间；为了除尽酸枣仁中的游离态多酚，在第二步提高了丙酮水解时间和水解次数。
通过上述多方面的改进，本发明获得的酸枣仁结合态多酚，水溶性组分得率高，抗肿瘤活性显著；经抗肿瘤活性检测显示，该酸枣仁水溶性多酚可明显抑制多种肿瘤细胞如：结肠癌细胞株hct-116、dld1、sw620和宫颈癌细胞株hela等的增殖，且能显著逆转肿瘤的多药耐药性。证明该结合态多酚有潜力开发成为新型抗肿瘤药物、特殊医药食品及保健食品。
附图说明
图1酸枣仁水溶性结合态多酚(zssbp)粉末样品；
图2酸枣仁水溶性结合态多酚(zssbp)对肿瘤细胞增殖的影响；
图3倒置显微镜下观察酸枣仁水溶性结合态多酚(zssbp)对肿瘤细胞形态的影响(×20)；
图4酸枣仁水溶性结合态多酚(zssbp)对结肠癌耐药细胞耐药性的影响。
具体实施方式
实施例1：酸枣仁水溶性结合态多酚的制备方法
(1)配制酸水解液。取浓硫酸20ml、甲醇180ml，配制200ml的酸水解液(酸解液中浓硫酸的浓度为1.84mol/l)；
(2)将天然酸枣仁粉碎，取酸枣仁粉末10g，加入预冷的80％丙酮150-200ml，4℃下均匀搅拌30-40min，然后将混合物于5,000rpm、离心10min，去除上清液中的游离态多酚，留残渣；离心后的残渣可重复用以上方法提取1-2次；
(3)将(2)中获得的酸枣仁残渣中按重量体积比(w/v＝1g:10-15ml)加入预先配置好的酸解液100-150ml，用摇床在37℃下水解消化1.5-2h。然后加入适量10mol/lnaoh溶液使消化溶液ph至中性终止消化；
(4)消化完成后，11,000rpm离心10min，弃沉淀，在上清液中加入等体积的乙酸乙酯萃取，后11,000rpm离心10min，溶液分为三层，取下层水相，重复萃取2-3次，即为水溶性活性多酚组分。
(5)将上述水溶性活性多酚组分在45℃旋转蒸发，除净有机溶剂，真空冷冻干燥成粉末即可得纯多酚样品，于4℃保存。
(6)测定酸枣仁水溶性结合态多酚的含量。用超纯水溶解冻干的多酚粉末，用福林酚比色法，以没食子酸为标准品测定酸枣仁水溶性多酚含量。标准液的浓度梯度分别为：0，0.02，0.06，0.1，0.15，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6mg/ml。加入100μl标准液或多酚样品，400μl去离子水到试管中，再加入100μl福林酚试剂混匀静置反应6min，随后各个试管中加入1ml7％na2co3混匀静置90min。于760nm波长处测定吸光度。以吸光值为横坐标，没食子酸量(mg)为纵坐标做标准曲线，通过标准曲线计算样品中多酚的含量。
结果表明：每100g酸枣仁中提取到的水溶性结合态多酚的含量约为2684±68.75mg，提取得率平均为2.68±0.07％。酸枣仁水溶性结合态多酚粉末样品(如图1所示)。
实施例2：酸枣仁水溶性结合态多酚的抗肿瘤活性鉴定
取对数生长期的肿瘤细胞株hct116、dld1、sw620、hela，细胞制成悬液后，通过细胞计数，将各种细胞的细胞密度调整为密度为每孔6000个/100μl，接种到96孔板中，在37℃、5％co2的培养箱培养过夜后，弃掉旧培养基，加入含不同浓度酸枣仁结合态多酚的培养基，其多酚终浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.6mg/ml，设5个平行孔，继续孵育24h；弃去旧培养液，pbs洗2次，每孔加入20μl5.0mg/mlmtt，继续孵育4h。弃去板中培养液，每孔加入150μl的dmso溶解活细胞产生的甲瓒结晶，置摇床上振荡10min，在波长570nm处的酶标仪上测定各孔吸光值。
结果表明：本发明所得酸枣仁水溶性结合态多酚(zssbp)，经上述体外抗肿瘤活性检测，结果表明：用上述不同浓度的zssbp处理hct116、dld1、sw620和hela细胞24h，其hct116细胞的ic50值为：0.16mg/ml，dld1细胞的ic50值为：0.189mg/ml，sw620细胞的ic50值为：0.225mg/ml，hela细胞的ic50值为：0.158mg/ml(如图2所示)。
实施例3：酸枣仁水溶性结合态多酚(zssbp)对肿瘤细胞形态的影响
取对数生长期的肿瘤细胞珠hct116、dld1和sw620，细胞制成悬液后，通过细胞计数，将各种细胞的密度调整为密度为每孔2.4×104个细胞，接种到24孔板中，在37℃、5％co2的培养箱培养过夜后，弃旧培养基，加入含不同浓度酸枣仁结合态多酚的培养基，其多酚终浓度分别为0.1、0.2mg/ml，设5个平行孔，继续孵育24h；于olympus倒置显微镜下观察肿瘤细胞的形态变化情况(×20)。
结果显示：上述不同浓度的酸枣仁结合态多酚zssbp处理肿瘤细胞后，与对照组相比，细胞数量明显减少，细胞形态皱缩变圆，显示出明显的凋亡形态，这说明，zssbp能显著抑制上述肿瘤细胞的增殖，并诱导其凋亡(如图3所示)。
实施例4：酸枣仁水溶性结合态多酚(zssbp)对结肠癌耐药细胞耐药性的影响
选取对数生长期的结肠癌hct-8细胞株和结肠癌多药耐药hct-8/mdr细胞株，每孔6×103个的细胞密度接种于96孔培养板中。于37℃，5％的co2培养箱中过夜孵育，加入不同浓度的5-fu、0.2mg/mlzssbp，设五个复孔。孵育24h后，移除旧培养液，用pbs洗2次，加入新鲜培养基，每孔加20μlmtt溶液(5mg/ml)，继续孵育4h后终止培养。吸弃培养上清液，每孔加入150μldmso，摇床振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫监测仪上于570nm波长处测定各孔吸收值。结果显示：zssbp能够显著逆转结肠癌多药耐药细胞株hct-8/mdr的耐药性，其逆转倍数达到9.13倍(如表1、表2、图4所示)。
表1:化疗药物5-fu对结肠癌细胞hct-8和耐药细胞hct-8/mdr细胞增殖的影响
表2：zssbp对结肠癌耐药细胞株hct8/mdr逆转5-fu耐药性的影响