本发明涉及酚类化合物的提取方法，特别是涉及一种用低共熔溶剂提取茶叶籽油不同形态酚类化合物的方法。
背景技术：
酚类化合物是一类广泛存在于植物体内的多酚类物质，是植物体内一种重要的次生代谢产物，其分子结构中含有若干个酚性羟基基团，根据结构特征主要分为酚酸类、黄酮类、单宁类、黄烷醇类以及苷类等。研究表明，植物酚类成分是一种天然抗氧化剂，能清除人体内的NO和ROS自由基，并且可对自由基诱发的生物大分子损伤起到保护作用；此外，它还能够抑制氧化酶活性，激活抗氧化酶体系，具有明显的抗氧化效果。
茶叶籽是山茶科山茶属茶树的种子，其油脂含量达30％左右，富含天然酚类化合物。研究茶叶籽油中酚类化合物可以为茶叶籽油精炼工艺的改进和活性成分开发提供科学的指导作用。酚类化合物在茶叶籽油中以易溶解的游离型酚类化合物和与其他基质紧密结合的结合型酚类化合物的形态存在，目前研究应用多集中在游离型酚类化合物，结合型由于不易溶解和提取，研究应用受限。植物中潜在大量结合型酚类化合物，若不考虑结合型酚类化合物不能客观评价油脂品质及作用机理。因而，寻求一种实用、高效的茶叶籽油中游离型和结合型酚类化合物的提取方法具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术所存在的不足，提供一种用低共熔溶剂提取茶叶籽油不同形态酚类化合物的方法。
本发明的技术方案为：
一种用低共熔溶剂提取茶叶籽油不同形态酚类化合物的方法，包括以下步骤：
1)将氯化胆碱和氢质子供体化合物根据体积比1：0.5～2的比例混合加热共熔至澄清形成DES溶剂；
2)DES提取茶叶籽油游离型酚类化合物：将茶叶籽油与正已烷混合后加入DES溶剂混合均匀，于20～70℃水浴下搅拌并间断式涡旋振荡，取出，离心后收集DES层得到第一DES提取液，向第一DES提取液中加入正已烷，混合均匀后离心除去正已烷层，得到游离型酚类化合物DES提取液；
3)DES提取茶叶籽油结合型酚类化合物：将步骤2)中两次离心后剩余产物合并后加入氢氧化钠溶液，搅拌并避光碱解，水解液调至pH呈中性，离心分离出水相，往剩余油相中加入DES溶剂，于20～70℃水浴下搅拌并间断式涡旋振荡，离心后收集DES层得到第二DES提取液，向第二DES提取液中加入正已烷，混合均匀后离心除去正已烷层，与所述水相合并得结合型酚类化合物提取液；
4)将游离型酚类化合物DES提取液和结合型酚类化合物提取液分别过XAD-16大孔树脂层析柱，从而回收酚类化合物。
可选的，所述氢质子供体化合物为丙三醇、木糖醇、乙二醇、丙二酸、丙二醇中的至少一种。
可选的，步骤2)中，所述水浴温度为40～60℃。
可选的，步骤3)中，所述水浴温度为40～60℃。
可选的，步骤2)中，根据以下比例关系，取6g茶叶籽油加入3～7mL正己烷溶液并震荡摇匀后，再加入4～8g DES溶剂并混匀，于20～70℃水浴下，搅拌0.5～2h，期间每10～20min涡旋振荡0.5～2min，取出，于3000～4000rmp转速下离心10～20min，收集DES层。
可选的，步骤3)中，根据以下比例关系，将步骤2)中两次离心后剩余产物合并后加入0.1～0.3mol/L氢氧化钠溶液10～15mL，搅拌避免分层，避光碱解8～15h，水解液用浓盐酸调至PH呈中性，2500～3500rmp转速下离心5～15min，分离出水相，往剩余油相中加入4～8g DES溶剂，涡旋混匀后于20～70℃水浴下，搅拌0.5～2h，期间每10～20min涡旋振荡0.5～2min，取出，于3000～4000rmp转速下离心10～20min，收集DES层。
可选的，步骤2)和3)中，所述收集DES层的过程分别重复至少一次，并分别集合DES层得到所述第一DES提取液和第二DES提取液。
可选的，步骤2)和3)中，分别向第一DES提取液和第二DES提取液中加入3～7mL正己烷，混合均匀后于2500～3500rmp转速下离心3～10min，分离出正已烷层以除去残留的油脂。
可选的，步骤4)中，将所述游离型酚类化合物DES提取液和结合型酚类化合物提取液分别以1～2BV/h流速上样后，再依次用去离子水、甲醇溶液淋洗，保持流速在2～3BV/h，收集甲醇洗脱液，将收集到的甲醇洗脱液旋蒸浓缩至干，用体积比为50％的甲醇水重溶，过0.22μm有机滤膜。
本发明的有益效果为：
采用低共熔溶剂实现对茶叶籽油的游离型酚类化合物和结合型酚类化合物的提取，提取得率高，反应条件温和，适于实际应用，对后续茶叶籽油的研究及开发利用提供了指导。
具体实施方式
以下实施例对本发明做进一步具体的说明。
实施例1
1.低共熔溶剂(DES)制备
将氯化胆碱和氢质子供体化合物混合加热共熔至澄清。采用的氢质子受体化合物及其与氯化胆碱摩尔质量配比如表1所示。准确称量氯化胆碱和一系列氢质子供体化合物于烧杯中，封口后置于80℃下恒温水浴，搅拌，直至得到澄清透明的液体，取出，常温下静置备用。
表1DES
2.DES提取茶叶籽油游离型酚类化合物
准确称取6g茶叶籽油于50mL离心管中，加入5mL正己烷溶液并震荡摇匀后，再加入6g DES溶剂并于涡旋振荡器下混匀，试管置于25℃水浴下，搅拌1h，期间每15min涡旋振荡1min。取出，于3500rmp转速下离心15min，收集DES层，重复上述步奏提取两次，集合两次DES提取液得到第一DES提取液。向第一DES提取液中加入5mL正己烷试剂，充分涡旋混匀，然后在3000rmp转速下离心5min，分离出己烷层以洗去残留的油脂，即得到游离型酚类化合物DES提取液。
3.DES溶剂提取茶叶籽油结合型酚类化合物
向上述两次离心后剩余产物(提取游离型酚类化合物后的茶叶籽油与正已烷的混合溶液)合并后加入0.2mol/L氢氧化钠溶液12mL，搅拌避免分层，避光碱解12h，水解液用浓盐酸调至PH呈中性，3000rmp转速下离心10min，分离出水相。往剩余油相中加入6g DES溶剂，涡旋混匀后25℃水浴搅拌1h，期间每15min涡旋振荡1min。试样于3500rmp转速下离心15min，收集DES层，重复两次，集合DES层得到第二DES提取液，向第二DES提取液中加入5mL正己烷试剂，充分混匀，然后在3000rmp转速下离心5min，分离出己烷层，合并碱解后水层及DES层，得结合型酚类化合物提取液。
4.回收酚类化合物
上述游离型酚类化合物DES提取液、结合型酚类化合物提取液，均要过XAD-16大孔树脂层析柱，从而回收酚类化合物。以1.5BV/h流速上样后，再依次用200mL去离子水、200mL甲醇溶液淋洗，保持流速在2.5BV/h，收集甲醇洗脱液。将收集到的甲醇洗脱液于36℃下旋蒸浓缩至干，用250μL甲醇水(50％,v/v)重溶，过0.22μm有机滤膜，避光冷藏。
对上述酚类化合物进行分析，采用HPLC-QqQ-MS多反应监测(MRM)模式，同时绘制25种标准品酚类化合物线性曲线，外标法定量分析茶叶籽油不同形态酚类化合物。
色谱条件见表2、3所示。
表2色谱基本条件
表3梯度洗脱程序
质谱参数见如表4所示。
表4质谱条件
多反应监测模式(MRM)测定优化的各离子对参数见表5所示。
表5离子参数
表6酚类化合物回归方程、线性范围、检测限及定量限
检测结果见表7及表8：
表7不同DES溶剂提取茶叶籽油游离型酚类化合物组成(μg/g)
由表7可看出，共检测到31种酚类化合物，其中包含14种酚酸类化合物、11种黄酮类化合物、6种黄酮苷类化合物。不同低共熔溶剂都能提取游离态酚类化合物，且得到的总酚含量普遍高于传统甲醇/水溶剂，其中总酚含量最高的为氯化胆碱/丙三醇，明显高出常规的甲醇/水提取液。
表8不同DES溶剂提取茶叶籽油结合型酚类化合物组成(μg/g)
由表8可以看出，不同低共熔溶剂都能提取结合态酚类化合物，且得到的总酚含量普遍高于传统甲醇/水溶剂。结合态酚类化合物可能与油脂中脂肪酸甘油酯或微量游离脂肪酸结合存在，使其不易提取，其中酚酸类占比达90％左右。酚酸类化合物的羟基、羧基可作为氢质子供体基团，与DESs间存在的相互作用，可能增加其溶解性及提取效率，同时相较于黄酮类化合物，其空间位阻明显减小。
实施例2
DES(氯化胆碱-丙三醇1:2)分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃提取茶叶籽油不同形态酚类化合物，提取方式参照实施例1，其结果见表9。
表9不同温度提取茶叶籽油游离型酚类化合物和结合型酚类化合物(μg/g)
温度对不同酚类化合物含量具有影响，但对其分布比例并无显著影响。对于游离态和结合态酚类化合物，大部分酚类化合物提取含量在50℃时达到峰值，但也有少数酚类化合物如香草酸在70℃时提取量最高，而肉桂酸、阿魏酸在60℃时提取量最高。
上述实施例仅用来进一步说明本发明的一种用低共熔溶剂提取茶叶籽油不同形态酚类化合物的方法，但本发明并不局限于实施例，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均落入本发明技术方案的保护范围内。