一种检测炎症反应的生物发光/超声双模态显影剂的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体设计了一种检测炎症反应的生物发光/超声双模态显影剂。

背景技术：

炎症是机体对于刺激的一种防御反应，是十分常见而又重要的基本病理过程，在病菌感染、肿瘤、动脉粥样硬化、关节炎等多种疾病的发展过程中都有重要作用，因此通过准确识别炎症反应将有利于这些重要疾病的诊断、监测。在炎症反应过程中，巨噬细胞激活并分泌髓过氧化物酶(myeloperoxidase，mpo)是其中很重要的一个环节。前期的研究报道表明鲁米诺可以在活体条件下在mpo特异性催化下产生最大发射波长为425nm的光，从而实现了以极高的灵敏度对炎症反应进行生物发光成像。

但是鲁米诺反应产生的光波长太短，组织穿透能力非常弱，只能检测非常表浅的生物组织，应用潜力受到很大的限制。为了解决这一问题，专利号为us20130101511a1的专利提出了一种将鲁米诺和近红外量子点联合使用的方法，鲁米诺在mpo的作用下产生峰值为425nm的光，这种光能够激活近红外量子点，从而发射波长在近红外区的光，由于近红外光具有很高的组织穿透能力，这种方法能够实现对深层炎症反应高灵敏的生物发光成像。但是这种方法的局限性在于量子点的生物安全性一直受到质疑，并且单一模态的生物发光成像的时间分辨率很低(一次成像的时间需要几分钟)，空间分辨率差。

与生物发光成像相比，超声成像的特点在于时间和空间分辨率都很高，但是在检测炎症组织的时候主要缺点是灵敏度太差，因此将生物发光成像与超声成像结合来用于炎症的检测可以很好的实现优势互补。

技术实现要素：

基于以上问题，本发明提出了一种将鲁米诺溶液和负载染料的超声造影剂联用的方法，实现了对炎症的生物发光/超声双模态显影。

本发明的目的是提供一类基于荧光共振能量转移的多色荧光/超声双模态造影剂以及该类造影剂的制备方法。基于以上问题，本发明提出了一种将鲁米诺溶液和负载染料的超声造影剂联用的方法，实现了对炎症的生物发光/超声双模态显影。

本发明的一个重要创新点是利用将鲁米诺和负载染料的超声造影剂联用用于深层炎症组织的生物发光成像。为了将鲁米诺在mpo的作用下产生的短波长光转换成具有长波长的光，从而使得深层组织的信号能够被检测到，本发明提出了在超声造影剂上负载染料将短波长的光通过荧光共振能量转移的方式转换成长波长光的方法。超声造影剂上负载的染料有两种，染料一和染料二。染料一的特征吸收峰在450-600nm，荧光发射峰在550-650nm，代表性染料是cy3系列的染料，优选为dii染料，这类染料能够接收鲁米诺产生的光并转换为波长在550-650nm的光。染料二的特征吸收峰在550-700nm，荧光发射峰650-750nm，包括cy5系列的染料，优选为did染料，这类染料能够接收染料一产生的光并进一步转换为波长在650-750nm的光。

本发明中所采用的超声造影剂是双亲性脂质包裹气体形成的尺寸在10微米以下的气泡结构，这种造影剂在经过静脉注射后能够在血液中循环，从而增强超声成像的对比度，在临床上已经被广泛使用。所用的两种染料可以通过共价键或者非共价键的方式掺杂到脂质膜中。这种负载染料的超声造影剂在经过静脉注射后在血液中长时间循环，当鲁米诺在炎症组织反应发射出峰值为425nm的光时，这种光能够被在炎症组织血管中循环的超声造影吸收，并产生波长在650-750nm的光，从而以更高的组织穿透力穿透组织并被检测到，从而通过这种生物发光成像的方式检测到炎症的大概位置，紧接着可以利用超声造影剂通过超声成像对这一位置进行高分辨率的成像。

本发明中所用的负载染料的超声造影剂除了可以静脉注射外，也可以皮下注射。皮下注射的超声造影剂能够快速地在注射位点附近的淋巴结富集，如果淋巴结发生了炎症(如肿瘤转移性淋巴结)，鲁米诺也会在该部位反应从而激活负载染料的超声造影剂。

本发明中所用的鲁米诺溶液主要是指鲁米诺或鲁米诺衍生物在水溶液中溶解得到的可用于生物体注射的水溶液，其主要特点是能够在活体条件下与炎症部位的mpo特异性反应产生光。鲁米诺溶液的注射方式除了静脉注射外，还可以通过皮下注射、腹腔注射、肺腔内注射、鼻腔内注射等方式进行，这是由于鲁米诺分子量较小具有很好的组织穿透力，能够很容易到达全身各处。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是单独注射鲁米诺溶液和同时注射鲁米诺溶液和负载染料的超声造影剂的对小鼠腹腔炎症部位的生物发光成像结果

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例1

(1)配置负载染料的超声造影剂将dppc，dppe，dppa按照5∶2∶1的质量比用乙醇配成8mg/ml的母液。取1ml的磷脂母液，将dii和did染料按照1∶1的比例加入，再加入1ml氯仿，混合均匀，蒸发除去溶剂。加入1ml0.6mg/ml的pluronicl61溶液(含有50ul的甘油，63.1mg)68℃水化30min。将制备好的脂质体溶液转移到西林瓶中，充气，机械震荡，从而得到负载染料的超声造影剂。

(2)配置鲁米诺溶液将鲁米诺钠盐按100μm的浓度在水溶充分溶解，然后用0.22μm的滤膜过滤得到鲁米诺溶液。

实施例2

(1)配置负载染料的超声造影剂将dspe-peg2000和dspc的摩尔比9∶1的比例用乙醇配成8mg/ml的母液。取1ml的磷脂母液，将dii和did染料按照2∶1的比例加入，再加入1ml氯仿，混合均匀，蒸发除去溶剂。加入1ml0.6mg/ml的pluronicl61溶液(含有50ul的甘油，63.1mg)68℃水化30min。将制备好的脂质体溶液转移到西林瓶中，充气，机械震荡，从而得到负载染料的超声造影剂。

(2)配置鲁米诺溶液将鲁米诺钠盐按100μm的浓度在水溶充分溶解，然后用0.22μm的滤膜过滤得到鲁米诺溶液。

实施例3

(1)配置负载染料的超声造影剂将dspe-peg2000和dspc的摩尔比9∶1的比例用乙醇配成8mg/ml的母液。取1ml的磷脂母液，将dii和did染料按照2∶1的比例加入，再加入1ml氯仿，混合均匀，蒸发除去溶剂。加入1ml0.6mg/ml的pluronicl61溶液(含有50ul的甘油，63.1mg)68℃水化30min。将制备好的脂质体溶液转移到西林瓶中，充气，机械震荡，从而得到负载染料的超声造影剂。

(2)配置鲁米诺溶液将异鲁米诺(鲁米诺衍生物)按100μm的浓度在水溶充分溶解，然后用0.22μm的滤膜过滤得到鲁米诺溶液。

实施例4

将20μg脂多糖溶解于生理盐水中腹腔注射入小鼠体内后3h，从而构建小鼠腹腔炎症模型。

将实施例1中的100μl负载染料的超声造影剂通过静脉注射入小鼠体内，然后通过腹腔注射入100μl鲁米诺溶液，对照组中只注射100μl鲁米诺溶液。然后将小鼠放于生物发光成像仪中检测生物发光图像。(成像结果如附图1)

利用超声成像仪对生物发光检测到的炎症部位进行超声造影成像，从而得到炎症部位的超声诊断结果。

实施例5

在新西兰大白兔左侧大腿中注入vx2肿瘤组织块，约2周后肿瘤形成，并转移至转移性肿瘤，从而构建淋巴结肿瘤转移模型将实施例2中的100μl负载染料的超声造影剂通过静脉注射入兔子体内，然后通过皮下注射入1ml鲁米诺溶液，对照组中只注射鲁米诺溶液。然后将兔子放于生物发光成像仪中检测生物发光图像。利用超声成像仪对发生肿瘤转移的淋巴结进行超声造影成像，从而得到转移性淋巴结的超声诊断结果。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。