一种荧光/光声/SPECT多模式成像纳米探针的制备方法及其在癌症诊断中的应用与流程

本发明属于纳米生物医药材料领域，涉及一种荧光/光声/spect多模式成像纳米探针的制备方法及其在癌症诊断中的应用。

背景技术：

据世界卫生组织统计显示，癌症已成为人类的第一大杀手。虽然治疗癌症的药物和手段都取得了巨大进步，但癌症患者的五年生存率与二十年前相比并没有得到显著提高，而目前提高癌症治愈率的最有效手段依然是“早发现、早治疗”。因此，发展能够对癌症进行早期、快速检测并准确定位的诊断方法能够大大降低癌症患者的死亡率。

分子影像学技术能对活体状态下的生物过程进行可视化观察，获得直观的医学影像，目前已成为临床癌症诊断的主要手段之一。然而不同的分子影像学方法具有不同的特点，有些灵敏度高，但空间分辨率低，有些空间分辨率高，但灵敏度低，因此单模式成像很难获得完善的癌症诊断图像。将不同的成像模式融合在一起，发展多模式成像技术，能尽可能地发挥各种影像学手段的优势，得到同时具有高灵敏度和高空间分辨率的医学图像，提供综合的影像学信息以便充分了解病灶部位，为医生对癌症做出准确的诊断和制定合适的治疗方案提供可靠依据。

设计制备适合临床肿瘤诊断的安全灵敏、精准高效多模式成像探针是多模式成像技术的关键。近年来，研究人员基于纳米技术，将不同的单模式成像探针通过物理包裹或化学键连的方式负载到纳米材料上，开发出具有纳米结构的多模式成像探针。该类多模式成像纳米探针不仅能发挥多种模式成像的功能，还能借助于纳米材料特有的体内长循环能力和增强渗透滞留(epr)效应将探针高效地递送并富集到癌症部位，发射出多重影像信号，实现对癌症的精确诊断。

荧光(fl)成像以其操作简便、测量快速、灵敏度高、费用低廉等优点被广泛应用于医学研究，但也存在组织穿透力弱、空间分辨率低、荧光染料毒副作用大等缺点。与fl成像相比，光声(pa)成像灵敏度较低，但空间分辨率较高，因此二者联用能起到互补的作用。吲哚菁绿(icg)是目前唯一被美国食品和药品管理局(fda)认证进入临床的荧光染料，在近红外光(nir)照下，icg能发射荧光和光声两种信号。然而游离icg分子存在易被可见光激发导致荧光淬灭以及水溶性较差导致其在体内血液循环过程中快速聚集沉降等缺点，限制了其临床应用范围。

单光子发射计算机断层成像术(spect)是通过收集注入体内的放射性核素发出的γ射线信号形成医学影像。它的特点是射线信号组织穿透力强，但空间分辨率低。¹²⁵i是一种常用的spect成像探针，但其在体循环过程中容易富集到甲状腺，到达癌症部位的量较少，降低了成像质量的同时也增加了对正常组织的毒副作用。

因此，设计一种能同时负载icg和¹²⁵i的荧光/光声/spect多模式成像纳米探针，将其应用于癌症诊断，具有重要的社会意义和潜在的经济价值。

技术实现要素：

针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种荧光/光声/spect多模式成像纳米探针的制备方法及其在癌症诊断中的应用。将能够进行荧光/光声成像的icg和进行spect成像的¹²⁵i融合到同一聚合物上，制备出同时具有高灵敏度、高空间分辨率及低背景信号的荧光/光声/spect多模式成像纳米探针，可获得综合的医学影像，与现有的单模式成像探针相比，能够提高癌症诊断的准确率。

本发明通过如下技术方案实现：

一种荧光/光声/spect多模式成像纳米探针，它是通过将icg键连到以peg为亲水段，ptyr为疏水段的两亲性嵌段共聚物peg-ptyr上，同时采用氯胺t法在tyr残基上标记放射性核素¹²⁵i，得到两亲性嵌段共聚物peg-ptyr(¹²⁵i)-icg，再经过聚合物在水中自组装形成聚合物胶束，即为最终的多模式成像纳米探针。

该多模式成像纳米探针具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且能够克服icg水溶性差和¹²⁵i容易富集于甲状腺的缺点，提高二者的稳定性和生物利用度，并能利用其体内长循环能力和epr效应富集于荷瘤小鼠癌症部位，在近红外光(nir)照射下，发射出fl信号、pa信号及spect信号，实现对癌症的精确诊断。同时，具有原料廉价、制备简单且产率高的优势，使得这种多模式成像纳米探针易于进行临床转化应用。

具体的，一种荧光/光声/spect多模式成像纳米探针的制备方法，包括如下步骤：将peg-ptyr(¹²⁵i)-icg溶解于dmso中，得到聚合物溶液；再将聚合物溶液在电磁搅拌下，缓慢滴加到磷酸盐缓冲液中，在室温下搅拌10-14小时；透析纯化，得到peg-ptyr(¹²⁵i)-icg聚合物胶束，即为多模式成像纳米探针。

在其中一些实施例中，所述peg-ptyr(¹²⁵i)-icg、dmso和磷酸盐缓冲液的添加量之比为(9-11)mg：1ml：(8-10)ml。

在其中一些实施例中，所述磷酸盐缓冲液的ph值为7.2-7.6。

在其中一些实施例中，所述透析纯化具体为采用截留相对分子质量为1000的透析袋透析46-50小时。

在其中一些实施例中，所述peg-ptyr(¹²⁵i)-icg的制备方法包括如下步骤：1)将peg2000-nh2和tyr-nca加入圆底烧瓶中，加入干燥dmf，搅拌反应，得反应液；2)将反应液缓慢滴加到8-10倍量冰乙醚中，析出淡黄色固体，经抽滤洗涤及真空干燥，得到peg-ptyr；3)将peg-ptyr和icg-sulfo-osu加入西林瓶中，加入干燥dmso，搅拌反应，得反应液；4)采用截留相对分子质量为1000的透析袋透析46-50小时，冻干即可得到peg-ptyr-icg；5)将peg-ptyr-icg、na¹²⁵i和磷酸缓冲液加入西林瓶中，混合均匀之后加入氯胺t，25℃下搅拌反应8-12分钟，加入偏重硫酸钠终止反应；6)采用截留相对分子质量为1000的透析袋透析46-50小时，冻干即得peg-ptyr(¹²⁵i)-icg。

在其中一些实施例中，步骤1)中所述peg2000-nh2、tyr-nca和dmf的添加量之比为(0.4-0.6)mmol：(3.2-4.8)mmol：(8-11)ml。

在其中一些实施例中，步骤1)中所述搅拌具体为40℃下密闭搅拌反应22-26小时。

在其中一些实施例中，步骤3)中所述peg-ptyr、icg-sulfo-osu和dmso的添加量之比为(0.08-0.12)mmol：(0.1-0.13)mmol：(1.5-2.5)ml。

在其中一些实施例中，步骤3)中所述搅拌具体为25℃下密闭搅拌反应22-26小时。

在其中一些实施例中，步骤5)中所述peg-ptyr-icg、na¹²⁵i和磷酸缓冲液的添加量之比为(0.08-0.12)mmol：(0.8-1.1)mci：(2.5-3.5)ml。

在其中一些实施例中，步骤5)中所述磷酸缓冲液的ph值为7.2-7.6。

在其中一些实施例中，步骤5)中所述偏重硫酸钠与氯胺t的摩尔比为2:1。

本发明还提供了一种荧光/光声/spect多模式成像纳米探针在癌症诊断的应用，所述的癌症诊断指的是对癌症进行早期、快速检测并准确定位。

本发明的有益效果体现在：

本发明利用同时负载icg和¹²⁵i的两亲性嵌段共聚物通过自组装形成的聚合物胶束作为荧光/光声/spect多模式成像纳米探针，用以提高癌症诊断效率，具有如下优势：1)制备方法简单、成本低且产率高；2)原料全部由fda认证的peg、icg以及人体必需的tyr构成，具有良好的生物相容性和生物可降解性，容易向临床转化；3)可以被动靶向癌症部位，显著提高小分子探针的稳定性和生物利用度，降低对正常组织的毒副作用；4)能够将三种成像模式融合于一体，同时发挥荧光成像灵敏度高、光声成像空间分辨率高及spect成像背景干扰信号低的优势，获得综合全面的影像学信息，与单一成像模式相比，具有更高的癌症诊断效率。综上，本发明的荧光/光声/spect多模式成像纳米探针具有很好的临床应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为荧光/光声/spect多模式成像纳米探针的制备及对癌症的诊断示意图。

图2为荧光/光声/spect多模式成像纳米探针的物理化学性质表征(a.纳米探针的粒径分布；b.纳米探针的透射电子显微镜照片；c.纳米探针和icg的紫外-可见吸收光谱；d.纳米探针和icg的荧光光谱)。

图3为荧光/光声/spect多模式成像纳米探针与icg的溶血性比较(a)和细胞毒性比较(b)。

图4为荧光/光声/spect多模式成像纳米探针与icg的荷瘤小鼠活体全身荧光成像比较(a)和离体脏器荧光成像比较(b)。

图5为荧光/光声/spect多模式成像纳米探针与icg的荷瘤小鼠活体腹部横截面光声成像比较。

图6为荧光/光声/spect多模式成像纳米探针与na¹²⁵i的荷瘤小鼠活体全身spect成像比较(a)和离体脏器同位素成像比较(b)。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

本发明所用的原料：单甲氧基聚乙二醇胺(peg2000-nh2)、l-酪氨酸-n-羧基环内酸酐(tyr-nca)、磺酸基吲哚菁绿活化脂(icg-sulfo-osu)、吲哚菁绿(icg)、放射性碘化钠(na¹²⁵i)、氯胺t、偏重硫酸钠、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、二甲基亚砜(dmso)、乙醚均有市售。

实施例1

一种荧光/光声/spect多模式成像纳米探针的制备方法，包括如下步骤：将9.0mgpeg-ptyr(¹²⁵i)-icg溶解于1mldmso中，得到聚合物溶液，再将此聚合物溶液在电磁搅拌下，缓慢滴加到10ml磷酸盐缓冲液(pbs,1mm,ph＝7.2)中，然后将溶液在室温下搅拌14小时使胶束稳定，之后采用截留相对分子质量为1000的透析袋透析50小时以完全除去体系中的dmso溶剂，得到peg-ptyr(¹²⁵i)-icg聚合物胶束，即为最终的多模式成像纳米探针。

其中，所述的peg-ptyr(¹²⁵i)-icg制备方法，包括如下步骤：

1)称取0.6mmolpeg2000-nh2和4.8mmoltyr-nca于50ml圆底烧瓶中，加入11ml干燥dmf，40℃下密闭搅拌反应22小时，得反应液；

2)将反应液缓慢滴加到90ml冰乙醚中，析出淡黄色固体，经抽滤洗涤及真空干燥，便可得到peg-ptyr；

3)称取0.1mmolpeg-ptyr和0.12mmolicg-sulfo-osu于10ml西林瓶中，加入1.5ml干燥dmso，25℃下密闭搅拌反应26小时；

4)采用截留相对分子质量为1000的透析袋对反应液透析48小时以完全除去体系中过量的icg-sulfo-osu和dmso溶剂，冻干便可得到peg-ptyr-icg；

5)称取0.08mmolpeg-ptyr-icg、1.1mcina¹²⁵i和3.5ml磷酸缓冲液(pb,1mm,ph＝7.6)于西林瓶中，混合均匀之后加入过量的氯胺t，25℃下搅拌反应8分钟，加入与氯胺t摩尔比为2:1的偏重硫酸钠终止反应；

6)采用截留相对分子质量为1000的透析袋对反应液透析48小时以完全除去体系中的各种小分子杂质，冻干便可得到peg-ptyr(¹²⁵i)-icg。

实施例2

一种荧光/光声/spect多模式成像纳米探针的制备方法，包括如下步骤：将11.0mgpeg-ptyr(¹²⁵i)-icg溶解于1mldmso中，得到聚合物溶液，再将此聚合物溶液在电磁搅拌下，缓慢滴加到8ml磷酸盐缓冲液(pbs,1mm,ph＝7.6)中，然后将溶液在室温下搅拌10小时使胶束稳定，之后采用截留相对分子质量为1000的透析袋透析46小时以完全除去体系中的dmso溶剂，得到peg-ptyr(¹²⁵i)-icg聚合物胶束，即为最终的多模式成像纳米探针。

其中，所述的peg-ptyr(¹²⁵i)-icg制备方法，包括如下步骤：

1)称取0.4mmolpeg2000-nh2和3.2mmoltyr-nca于50ml圆底烧瓶中，加入8ml干燥dmf，40℃下密闭搅拌反应26小时，得反应液；

2)将反应液缓慢滴加到80ml冰乙醚中，析出淡黄色固体，经抽滤洗涤及真空干燥，便可得到peg-ptyr；

3)称取0.08mmolpeg-ptyr和0.13mmolicg-sulfo-osu于10ml西林瓶中，加入2.5ml干燥dmso，25℃下密闭搅拌反应22小时；

4)采用截留相对分子质量为1000的透析袋对反应液透析48小时以完全除去体系中过量的icg-sulfo-osu和dmso溶剂，冻干便可得到peg-ptyr-icg；

5)称取0.12mmolpeg-ptyr-icg、0.8mcina¹²⁵i和2.5ml磷酸缓冲液(pb,1mm,ph＝7.2)于西林瓶中，混合均匀之后加入过量的氯胺t，25℃下搅拌反应12分钟，加入与氯胺t摩尔比为2:1的偏重硫酸钠终止反应；

6)采用截留相对分子质量为1000的透析袋对反应液透析48小时以完全除去体系中的各种小分子杂质，冻干便可得到peg-ptyr(¹²⁵i)-icg。

实施例3

一种荧光/光声/spect多模式成像纳米探针的制备方法，包括如下步骤：将10.0mgpeg-ptyr(¹²⁵i)-icg溶解于1mldmso中，得到聚合物溶液，再将此聚合物溶液在电磁搅拌下，缓慢滴加到9ml磷酸盐缓冲液(pbs,1mm,ph＝7.4)中，然后将溶液在室温下搅拌12小时使胶束稳定，之后采用截留相对分子质量为1000的透析袋透析48小时以完全除去体系中的dmso溶剂，得到peg-ptyr(¹²⁵i)-icg聚合物胶束，即为最终的多模式成像纳米探针。

其中，所述的peg-ptyr(¹²⁵i)-icg制备方法，包括如下步骤：

1)称取0.5mmolpeg2000-nh2和4mmoltyr-nca于50ml圆底烧瓶中，加入10ml干燥dmf，40℃下密闭搅拌反应24小时，得反应液；

2)将反应液缓慢滴加到100ml冰乙醚中，析出淡黄色固体，经抽滤洗涤及真空干燥，便可得到peg-ptyr；

3)称取0.1mmolpeg-ptyr和0.12mmolicg-sulfo-osu于10ml西林瓶中，加入2ml干燥dmso，25℃下密闭搅拌反应24小时；

4)采用截留相对分子质量为1000的透析袋对反应液透析48小时以完全除去体系中过量的icg-sulfo-osu和dmso溶剂，冻干便可得到peg-ptyr-icg；

5)称取0.1mmolpeg-ptyr-icg、1mcina¹²⁵i和3ml磷酸缓冲液(pb,1mm,ph＝7.4)于西林瓶中，混合均匀之后加入过量的氯胺t，25℃下搅拌反应10分钟，加入与氯胺t摩尔比为2:1的偏重硫酸钠终止反应；

6)采用截留相对分子质量为1000的透析袋对反应液透析48小时以完全除去体系中的各种小分子杂质，冻干便可得到peg-ptyr(¹²⁵i)-icg。

下面结合附图，对荧光/光声/spect多模式成像纳米探针进行测试，结果如下：

参见附图2，给出了制备的多模式成像纳米探针的物理化学性质表征结果，步骤如下：

1)将1ml纳米探针溶液经0.45μm的亲水性millipore滤膜过滤至无尘光散射样品瓶中，然后利用动态光散射测定其粒径及粒径分布，如图2a所示，纳米探针的流体力学粒径为58.4±2.8nm，粒径分布指数为0.26±0.08；

2)将10μl纳米探针溶液滴于300目铜网上，静置10分钟，用滤纸吸除多余样品后，真空干燥12小时，用透射电子显微镜(加速电压为100kv)检测，如图2b所示，纳米探针的微观形貌为粒径约23nm的球形结构；

3)用紫外-可见分光光度计测量纳米胶束和icg在400-1000nm波长范围内的紫外-可见吸收光谱，如图2c所示，纳米探针的光谱与icg的光谱几乎一样，只是最大吸收峰波长略有红移(原因可能是icg分子聚集所引起的)，由此证明icg成功键连到了聚合物peg-ptyr上；

4)用荧光分光光度计在760nm的激发波长下测量纳米胶束和icg的荧光光谱，如图2d所示，纳米探针与icg的最大发射波长均在810nm附近，但纳米探针的荧光强度明显降低，原因是icg分子聚集，导致其荧光有一定程度的淬灭，由此进一步证明icg成功键连到了聚合物peg-ptyr上。

参见附图3a，给出了不同浓度的多模式成像纳米探针和icg对红细胞的破坏作用结果，步骤如下：

1)取大鼠血液置于肝素化ep管中，用毛细管在血液里轻轻搅动，除去纤维蛋白原，制成脱纤维血液；

2)加入血液量10倍的0.9％氯化钠溶液，轻轻摇动，离心(3000转/分钟)10分钟，除去上清液，向沉淀在下方的红细胞中再加入10倍量的0.9％氯化钠溶液，重复上述离心步骤，直至离心上清液澄清为止；

3)向沉淀在下方的红细胞中加入9倍量的0.9％氯化钠溶液，制成2％红细胞悬液。取一定体积的2％红细胞悬液，加入等体积不同浓度(icg浓度1、2.5、5、10、20、50、100μg/ml)的纳米探针或icg溶液，37℃下孵育3小时。加入pbs的红细胞悬液作为阴性对照组。加入triton-100的红细胞悬液作为阳性对照组；

4)将混合物离心(1000转/分钟)3分钟，取上清液测量570nm条件下的紫外-可见吸收光谱。溶血率＝(样品吸收值-阴性对照吸收值)/(阳性对照吸收值-阴性对照吸收值)；

5)图3a即为实验重复三次后得到的不同浓度的纳米探针和icg与红细胞共孵育后的溶血率和数码照片。对于icg，当浓度为50μg/ml时，便发生溶血现象，浓度为100μg/ml时，溶血现象非常明显，溶血率可达40％左右。而对于纳米探针，浓度为100μg/ml时，才会发生溶血，溶血率不足15％，明显低于icg，证明纳米探针的生物相容性好于icg。

参见附图3b，给出了不同浓度的多模式成像纳米探针和icg对细胞的增值抑制效果，步骤如下：

1)将小鼠胚胎成纤维细胞(nih3t3细胞)以每孔10⁵个的密度接种于96孔板，加入细胞培养液，置于37℃细胞培养箱中培养12小时；

2)弃去培养液，每孔加入100μl含不同浓度(icg浓度0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1mg/ml)的纳米探针或icg的新培养液，置于37℃细胞培养箱中孵育24小时；

3)每孔中加入10μlmtt溶液，置于37℃细胞培养箱中继续孵育4小时；

4)弃去培养液，每孔加入100μldmso以溶解活细胞产生的蓝色结晶物质，在微型摇床上快速振荡5分钟，用酶标仪读取570nm波长下的光吸收值，计算细胞相对增值百分率；

5)图3b即为实验重复三次后得到的不同浓度的纳米探针和icg与细胞共孵育后的细胞生存率。对于icg，当浓度为0.05mg/ml时，便对细胞产生了明显的毒性，细胞生存率降到80％以下。而对于纳米探针，当浓度为0.2mg/ml时，细胞生存率仍然高于95％，再次证明纳米探针的生物相容性好于icg。

参见附图4，给出了多模式成像纳米探针和icg的荷瘤小鼠活体全身荧光成像和离体脏器荧光成像照片，步骤如下：

1)将人肝癌细胞(bel-7402细胞)以10⁷个的密度接种于6-8周健康的balb/c裸鼠右侧腹部，待肿瘤体积长到约100mm³时，将荷瘤小鼠随机分成三组：icg组、纳米探针组及pbs对照组，每组五只小鼠；

2)通过尾静脉向第一组小鼠注射100μg/ml的icg溶液200μl，第二组注射100μg/ml(icg浓度)的纳米探针溶液200μl，第三组注射200μl的pbs；

3)注射后0.5、4、10、24小时将小鼠麻醉，通过小动物活体成像系统对其进行全身荧光成像；

4)24小时后处死小鼠，解剖获得心、肝、脾、肺、肾、肿瘤，通过小动物活体成像系统对离体脏器进行荧光成像；

5)图4a即为得到的纳米探针和icg的荷瘤小鼠活体全身荧光成像照片。icg很快被排出体外，难以定位肿瘤，而纳米探针则可长时间停留在体内，并随着时间的延长，不断富集到肿瘤部位。图4b即为得到的纳米探针和icg的荷瘤小鼠离体脏器荧光成像照片。icg组小鼠的脏器中均无荧光信号，再次证明其已被完全排出体外，而纳米探针主要分布在肝、脾和肿瘤，证明纳米探针的癌症诊断效果明显好于icg。

参见附图5，给出了多模式成像纳米探针和icg的荷瘤小鼠活体腹部横截面光声成像照片，步骤如下：

1)将人肝癌细胞(bel-7402细胞)以10⁷个的密度接种于6-8周健康的balb/c裸鼠右侧腹部，待肿瘤体积长到约100mm³时，将荷瘤小鼠随机分成两组：icg组及纳米探针组，每组五只小鼠；

2)通过尾静脉向第一组小鼠注射100μg/ml的icg溶液200μl，第二组注射100μg/ml(icg浓度)的纳米探针溶液200μl；

3)注射后0.5、4、10、24小时将小鼠麻醉，通过小动物光声成像系统对其进行腹部横截面光声成像；

4)图5即为得到的纳米探针和icg的荷瘤小鼠活体腹部横截面光声成像照片。icg很快被排出体外，难以定位肿瘤，而纳米探针则可长时间停留在体内，并随着时间的延长，不断富集到肿瘤部位，再次证明纳米探针的癌症诊断效果明显好于icg。

参见附图6，给出了多模式成像纳米探针和na¹²⁵i的荷瘤小鼠活体全身spect成像和离体脏器同位素成像照片，步骤如下：

1)将人肝癌细胞(bel-7402细胞)以10⁷个的密度接种于6-8周健康的balb/c裸鼠右侧腹部，待肿瘤体积长到约100mm³时，将荷瘤小鼠随机分成两组：na¹²⁵i组及纳米探针组，每组五只小鼠；

2)通过尾静脉向第一组小鼠注射100μg/ml的纳米探针溶液200μl，第二组注射相同放射性剂量的na¹²⁵i溶液200μl；

3)注射后0.5、4、10、24小时将小鼠麻醉，通过小动物spect-ct成像系统对其进行全身spect成像；

4)24小时后处死小鼠，解剖获得心、肝、脾、肺、肾、肿瘤，通过小动物活体成像系统对离体脏器进行同位素成像；

5)图6a即为得到的纳米探针和na¹²⁵i的荷瘤小鼠活体全身spect成像照片。多数na¹²⁵i很快被排出体外，另有少量富集在甲状腺，难以定位肿瘤，而纳米探针则可长时间停留在体内，并随着时间的延长，不断富集到肿瘤部位。图6b即为得到的纳米探针和na¹²⁵i的荷瘤小鼠离体脏器同位素成像照片。na¹²⁵i组小鼠的脏器中均无同位素信号，再次证明其已被完全排出体外，而纳米探针主要分布在肝、脾和肿瘤，证明纳米探针的癌症诊断效果明显好于na¹²⁵i。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。