超声辅助复合酶法提取铁皮石斛叶黄酮的方法与流程

本发明属于天然药物有效成分提取
技术领域：
，具体涉及超声波提取、复合酶提取及黄酮化合物分离纯化方法。
背景技术：
：铁皮石斛是一种传统名贵的中药材，为兰科石斛属多年生草本植物，又名“黑节草”，名列“九大仙草”之首，国家重点二级保护植物。2010版《中国药典》记载主要功效为“益胃生津，滋阴清热”，现代研究表明，铁皮石斛也具有提高机体免疫力、抗衰老、抗氧化、抗癌和抗病毒等多种生物活性。但其有限的资源，极大地限制了发展，因此对其利用和开发进行深入的研究具有重要的意义。自古以来，人们大都只取铁皮石斛茎服用，对其药用成分也进行了大量研究，并取得了较多成果，但对其他部位的药用成分研究仍不足。叶属于非药用部分，但采集的药材中叶占有很大比例。多糖和生物碱是铁皮石斛的主要药用成去分，因此大部分研究也都集中于这两个方面。近些年有研究表明，石斛中黄酮类化合物具有明显的抗炎、抗菌和抗氧化活性，对预防动脉粥样硬化和抑制癌细胞增殖、癌变具有一定作用。黄酮化合物是自然界中抗氧化活性最强的一类天然化合物，说明研究开发含有黄酮类化合物的药物具有广阔的前景。铁皮石斛叶的质地、口感和药效虽均不如其茎。但有研究发现，铁皮石斛叶中黄酮化合物含量明显高于茎，且叶对DPPH自由基清除能力优于茎。利用铁皮石斛叶进行黄酮化合物的提取，原材料较充足，且价格低廉，又可获取具有较高药用价值的石斛黄酮类化合物。这对于珍贵药用资源保护，缓解市场对石斛的需求具有重要意义。铁皮石斛叶黄酮类化合物具有内在的稳定性，即相同种源的铁皮石斛叶黄酮类成分群基本一致。这为一定范围内制定铁皮石斛叶黄酮提取工艺标准提供了可能。现如今报道的有关黄酮类成分的提取方法包括加热回流法、酶解法、超声法、微波法等。具体如下：1、彭萍等人采用溶剂加热回流法提取马鞭石斛黄酮，得到了最优化的提取条件为：提取温度87℃，料液比1：34，乙醇浓度73％，实际黄酮平均提取率为4.52±0.02mg/g。2、唐静月等人采用超声辅助提取铁皮石斛花中总黄酮，得到最优提取条件为乙醇体积分数80％，料液比1:50，提取温度55℃，提取次数2次，每次40min。在以上条件下，总黄酮提取率达1.99％。3、张露月等人以离子液体超声微波协同萃取(IL-UMAE)技术应用于金钗石斛总黄酮和石斛碱的联合提取，最佳提取条件为:1.0mol/L[Bmim]BF4为萃取溶剂，微波功率328W，提取时间185s，料液比1:22(W/V)；测得金钗石斛总黄酮得率平均值为0.490％。4、翟富荣等人用加热回流法提取石斛兰花黄酮提取率为1.81％。以上所介绍的石斛黄酮提取试验多以石斛茎和花为原料，迄今为止鲜有利用石斛叶进行石斛黄酮提取的。总结现有的提取技术存在以下不足：1)、选用的材料多为石斛茎和花，提取成本较高，难以进行大规模药用成分提取生产。2)、现有提取技术有的提取时间过长，有的提取率较低，不能满足实际生产的需求。3)、提取时所用溶剂量较多，对能源消耗较大。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种以铁皮石斛叶为原料的超声辅助复合酶法提取铁皮石斛叶黄酮的方法。为了解决上述技术问题，本发明提供一种超声辅助复合酶法提取铁皮石斛叶黄酮的方法，包括将提取母液进行后处理，得铁皮石斛叶黄酮；提取母液的获取方法包括以下步骤：1)、先将铁皮石斛叶(含水率≤5％，质量％)粉碎，加入提取剂后调节pH＝5～7，再加入复合酶于45～60℃提取60～90分钟；所述铁皮石斛叶与提取剂的料液比为1g/10～50ml，所述复合酶与铁皮石斛叶的重量比为0.8～1.2％；2)、在保温条件下(即，保持温度为45～60℃)，将步骤1)所得物于超声作用下反应5～30min；再灭酶活；3)、将步骤2)所得物进行抽滤，收集滤液；所述滤液为提取母液。作为本发明的超声辅助复合酶法提取铁皮石斛叶黄酮的方法的改进：所述步骤3)中，用体积浓度为25～35％的乙醇溶液作为洗涤剂洗涤滤饼，将所得的洗脱液与滤液进行合并后作为提取母液；步骤1)中的铁皮石斛叶与所述洗涤剂的料液比为1g/15～20ml。作为本发明的超声辅助复合酶法提取铁皮石斛叶黄酮的方法的进一步改进：所述提取剂是体积浓度为35～50％的乙醇溶液。作为本发明的超声辅助复合酶法提取铁皮石斛叶黄酮的方法的进一步改进：所述复合酶由酶活≥110u/mg纤维素酶以及酶活≥2000u/mg的木瓜蛋白酶组成；所述纤维素酶：木瓜蛋白酶＝2～1.50:1的重量比。作为本发明的超声辅助复合酶法提取铁皮石斛叶黄酮的方法的进一步改进，所述步骤1)为：调节pH＝6；铁皮石斛叶与提取剂的料液比为1g/30ml，提取剂是体积浓度为45％的乙醇溶液，复合酶与铁皮石斛叶的重量比为1％，纤维素酶：木瓜蛋白酶＝1.5:1的重量比；于55℃提取60min。作为本发明的超声辅助复合酶法提取铁皮石斛叶黄酮的方法的进一步改进，所述步骤2)中的灭酶活为：将超声反应所得物(即，酶解处理后的铁皮石斛叶浆液)加热至80～100℃，保温10分钟～2h。作为本发明的超声辅助复合酶法提取铁皮石斛叶黄酮的方法的进一步改进，将提取母液进行后处理的方法为：将提取母液先进行乙醇的回收(直至不含乙醇)，再调pH至4.5～5.0，静置(静置过夜)后，过滤，重结晶，得铁皮石斛叶黄酮(黄酮化合物，纯品，纯度>92％)。作为本发明的超声辅助复合酶法提取铁皮石斛叶黄酮的方法的进一步改进：所述溶剂回收采用冷凝回流法。在发明过程中，发明人曾进行过如下的实验：通过单因素试验研究酶解温度、pH、酶解时间、酶制剂配比、加酶量、乙醇浓度、料液比、超声功率和超声时间对铁皮石斛叶黄酮类化合物提取率的影响，然后根据单因素试验结果筛选出对铁皮石斛叶黄酮类化合物提取率影响最较大的，且存在相互作用的四个因素：料液比、酶制剂比、加酶量和超声功率，运用响应面法进行进一步条件优化，得到最佳铁皮石斛黄酮化合物提取条件。将提取得到的黄酮化合物母液先进行溶剂回收，再通过调pH，静置过夜，过滤，重结晶等一系列步骤得到黄酮化合物纯品。此技术所用原料价格低廉，整个操作流程简单可行，可以高效的提取铁皮石斛黄酮类化合物，在中药精细化发展的未来，具有较好的工业化生产前景。本发明的提取方法采用铁皮石斛叶作为原材料；这无疑极大地降低了成本，方便了大规模生产。浙江是全国最大铁皮石斛产销区，人工栽培总产量占全国90％以上。每年铁皮石斛采收期，会产生大量非药用部分铁皮石斛叶，如果把它们都能利用起来，无疑会产生较大地经济效益，也将会对石斛产业产生较大的影响。本发明运用超声辅助复合酶提取技术，完美地解决了提取时间长，提取率低和所需溶剂多的问题。本发明的最佳方案为：所需提取时间为60min，料液比为1：30，提取剂为45％乙醇，提取率为1.94％，相比于其它提取法有明显的提高。本发明提取所用的溶剂为45％乙醇，极大地降低了对有机溶剂的消耗量。且提取剂最后能得到回收，这又进一步降低了消耗量和投入。综上所述，采用本方法提取铁皮石斛叶黄酮类化合物，不仅材料易得，而且操作过程简单易行，所用时间相对较短，耗能较少，提取率较高，方法环保。采用本发明能进一步扩大铁皮石斛的药用部位，增加药用价值，提高对现有资源的利用率，对石斛黄酮类药物的精制开发和研制奠定了基础。附图说明下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。图1为料液比对黄酮提取率的影响图；图2为溶剂浓度对黄酮提取率的影响图；图3为温度对黄酮提取率的影响图；图4为pH值对黄酮提取率的影响图；图5为酶制剂比对黄酮提取率的影响图；图6为加酶量对黄酮提取率的影响图；图7为酶解时间对黄酮提出率的影响图；图8为超声功率对黄酮提取率的影响图；图9为超声时间对黄酮提取率的影响图。备注：上述提取率均指粗品提取率。具体实施方式下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施的，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。实施例1、一、原材料的准备和处理本发明以浙江德清铁皮石斛种植基地出售的石斛叶为原材料，将购买的铁皮石斛叶片分批放入水槽中用清水进行清洗2-3次，时间在30min为宜。将液面上的灰尘和一些杂质清除干净。将清洗后的叶片自然晾干(或者运用烘箱60℃，烘干)至含水率≤5.0％，然后用粉碎机粉碎，过60目筛，储存在干燥通风处备用。二、酶解和超声联合提取取铁皮石斛叶粉10g置于500ml锥形瓶中，按料液比1g：30ml的比例，加入45％乙醇，用1mol/L盐酸调节pH＝6。按加酶量1.0％(即，复合酶与铁皮石斛叶粉的重量比为1％)，酶制剂配比1.5：1(纤维素酶：木瓜蛋白酶＝1.5:1的重量比)，加入纤维素酶(≥110u/mg)和木瓜蛋白酶(≥2000u/mg)，然后放入到数控超声波清洗仪中。预先将数控超声波清洗仪调至55℃，超声功率0W，待酶解反应60min后，保持温度不变，将超声功率调至125W，然后再反应10min。待反应结束后将锥形瓶放至100℃水浴锅中，保持10min，使酶灭活。将反应后提取液抽滤，用30％乙醇适量(约200ml)清洗滤饼2-3次，将所得的洗脱液与滤液进行合并后作为提取母液。三、提取液中黄酮化合物的纯化将提取母液80℃蒸发回收乙醇(冷凝回流法)，剩余滤液(不含乙醇)用浓盐酸调至pH＝5，放置过夜；将静置液抽滤。用蒸馏水将沉淀洗至中性，60℃干燥40分钟得黄酮化合物粗品(黄酮化合物粗提物)，紫外检测只在310-350及250-280两处有吸收峰，从而证明确为黄酮化合物。用10倍体积的沸水重结晶，过滤结晶，在70-80℃干燥30分钟后，得黄酮化合物纯品(纯度>92％)。相同处理进行三次重复试验，试验提取结果如下表1：(原料10g)表1123平均值粗品/mg194.51193.14194.65194.10纯品/mg180.43182.21181.52181.39粗品提取率1.9451％1.9314％1.9465％1.9410％纯品回收率92.76％94.34％93.25％93.45％对比实验1：为了体现本发明提取方法的优势，特与以下两种提取方法进行对比：1、超声波提取：乙醇浓度45％、料液比1：30、超声功率125W和超声时间30min、pH＝6；即，相对于实施例1的步骤二而言，仅仅按照上述参数进行超声波提取。2、复合酶提取：酶解温度55℃、酶解时间60min、加酶量1.0％、酶制剂配比1.5:1、pH＝6、乙醇浓度45％、料液比1：30；即，相对于实施例1的步骤二而言，仅仅按照上述参数进行复合酶提取。二种提取方法粗品提取结果如下表2所述：(原料10g)表2、粗品提取结果将三种方法的提取率进行对比，可以发现本发明的超声辅助复合酶法粗品提取率分别比超声波提取法、复合酶提取法提高了34.77％和27.60％。据调查近些年浙江省人工种植铁皮石斛干条价格一斤1000-2000元，而铁皮石斛叶价格一斤不足100元。一公斤铁皮石斛叶可提取黄酮类化合物18g左右，而一公斤铁皮石斛干条可提取黄酮类化合物5g左右。对比实验2：固定试验条件为酶解温度55℃、酶解时间60min、加酶量1.0％、酶制剂配比1.5:1、pH＝6、乙醇浓度45％、料液比1：30、超声功率125W和超声时间10min。单因素试验研究：1、料液比(g/ml)对铁皮石斛叶黄酮提取率的影响：分别设定为1：10、1：20、1：30、1：40、1：50；所得结果如图1所述。2、乙醇浓度对铁皮石斛叶黄酮提取率的影响：分别设定为30％、35％、40％、45％、50％、55％；所得结果如图2所述。3、酶解温度对铁皮石斛叶黄酮提取率的影响：分别设定为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃；所得结果如图3所述。4、pH对铁皮石斛叶黄酮提取率的影响：分别设定为4、5、6、7、8；所得结果如图4所述。5、酶制剂配比对铁皮石斛叶黄酮提取率的影响；分别设定纤维素酶：木瓜蛋白酶的重量比为3：1、2：1、1.5：1、1：2、1：3、1：4；所得结果如图5所述。6、加酶量(酶/底物g)对铁皮石斛叶黄酮提取率的影响；分别设定0.5％、1.0％、1.5％、2％、2.5％；所得结果如图6所述。7、酶解时间对铁皮石斛叶黄酮提取率的影响；分别设定30min、60min、90min、120min、150min；所得结果如图7所述。8、超声功率对铁皮石斛叶黄酮提取率的影响；分别设定100W、125w、150W、175W、200W、225W；所得结果如图8所述。9、超声时间对铁皮石斛叶黄酮提取率的影响；分别设定5min、10min、20min、30min、40min；所得结果如图9所述。对比例1、将实施例1的“预先将数控超声波清洗仪调至55℃，超声功率0W，待酶解反应60min后，保持温度不变，将超声功率调至125W，然后再反应10min”改成“预先将数控超声波清洗仪调至55℃，超声功率125W，酶解反应70min”，其余等同于实施例1。粗品提取率为1.45％。对比例2、将实施例1的“预先将数控超声波清洗仪调至55℃，超声功率0W，待酶解反应60min后，保持温度不变，将超声功率调至125W，然后再反应10min”改成“预先将数控超声波清洗仪调至55℃，超声功率0W，酶解反应70min”，其余等同于实施例1。粗品提取率为1.55％。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。当前第1页1 2 3