本发明涉及心脏移植模型技术领域，具体地，涉及一种干细胞在心脏移植模型的应用。
背景技术：
心肌梗死和心功能衰竭是中西方国家的人类主要死亡原因之一，且严重增加了社会经济负担。尽管药物开发和介入治疗有了很大发展，却仍然无法降低心肌梗死所致心功能衰竭总的死亡率和发病率，究其原因，一方面是梗死后大量的心肌细胞死亡，容易出现心脏功能严重衰竭或发生恶性心律失常，最终导致患者死亡；而另一方面药物和介入治疗的干预使相当一部分急性心肌梗死患者虽存活下来，但是死亡的细胞没有新生细胞代替其功能，当残存心肌细胞失代偿时，左心室乃至全心功能严重受损。因此寻找合适的途径替代损失的心肌或者促进再生在改变预后方面有着重要的意义。
心脏组织工程和生物材料的应用主要依赖于人工合成材料或天然材料，经过合适的途径重组形成具有舒缩功能的心肌样组织，支撑功能衰竭的心脏。在所有材料中，可注射用生物材料具有非常突出的优点。可注射用生物材料联合干细胞，如骨髓细胞、脂肪源干细胞和骨髓源性诱导心脏细胞被证实能够改善心脏的功能。近年来，随着对cscs认识的不断加深，很多研究认为其具有组织再生的功能，在体内能够分化成为多种类型的成熟细胞，如心肌细胞、血管内皮细胞等，因此引起了普遍关注。
技术实现要素：
本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种干细胞在心脏移植模型的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
目前，对于缺血性心脏病的治疗大都是基于病因的干预性治疗，它们在替代死亡心肌细胞的功能及修复梗死后心肌方面的作用有限。干细胞移植是治疗缺血性心脏病的新方法之一，用于缺血性心脏病治疗的理想种子细胞最好无免疫原性，具有易收获、能在体外大量扩增、能在心脏微环境中很好地成长的特性，并能够促进受损心脏的修复。近年来，大量具有说服力的证据表明，心脏中存在有干细胞池，如果能够从受体自身心脏中获得干细胞，自然不存在免疫原性和不适应心脏微环境的情况，可能具有很好的治疗前景，而心脏肌球细胞(csp)和心脏肌球衍生细胞(cdcs)(心脏中存在的、含有心脏干细胞的混合细胞集团)，其作为缺血性心脏病治疗的选择值得探讨。
一种干细胞在心脏移植模型的应用。
优选地，所述干细胞为心脏肌球衍生细胞。
以上所述的心脏肌球衍生细胞在心脏移植模型中的应用，包括以下步骤：
s1.心脏肌球衍生细胞(cdcs)的培养；
s2.血小板纤维蛋白支架的制备；
s3.血小板纤维蛋白支架的观察；
s4.心脏肌球衍生细胞-血小板纤维蛋白支架联合移植。
优选地，所述步骤s1中的心脏肌球衍生细胞(cdcs)的培养包括以下步骤：取健康的清洁级雌性8周龄wky大鼠心肌组织，利用组织块培养法收获细胞，再通过悬浮培养和(或)贴壁培养方式获得大鼠心脏肌球衍生细胞，在体外观察细胞形态，持续传代观察细胞活性，绘制细胞生长曲线；利用流式细胞术检测不同来源和不同培养代数的的表面标志物vegf、igf-1、sdf-1以及细胞的表达。
优选地，所述步骤s2的血小板纤维蛋白支架的制备，还包括以下步骤：
s1.使用异氟醚深度麻醉大鼠；
s2.切开腹部皮肤，找出腹主静脉，采静脉血；
s3.将收集到的静脉血立即与8％(v/v)枸橼酸钠混匀；
s4.放入离心机中给予8000rpm离心5min，取上清液，按下述方法混合成胶成功，放入2ml离心管-20°保存待用；
s5.dmem放入37°水浴中预热；
s6.dmem和小板血浆上清液按照1-3：2-6比例混合，计时，观察成胶时间，以备体内试验用。
优选地，所述步骤s3中的血小板纤维蛋白支架的观察，还包括以下步骤：
s1.成型的血小板纤维蛋白支架立即用pbs清洗；
s2.用5％戊二醛在0.2m二甲胂酸钠缓冲液(ph7.5)中固定30-60min；
s3.用二甲胂酸钠缓冲液清洗3次，每次5-15min；
s4.用30％、40％、60％、80％、100％乙醇脱水，每一浓度脱水5-10min，再用六甲基二硅氮烷吸干；
s5.用采用离子溅射镀膜机喷镀金属，用扫描电镜拍照。
优选地，所述步骤s4中的心脏肌球衍生细胞-血小板纤维蛋白支架联合移植，还包括以下步骤：
s1.取1×106cdcs与50-100uldmem充分混匀，再与50-100ul富含血小板血浆混；
s2.在24孔板中加入100ul成胶前含有cdcs血小板纤维蛋白支架，每个孔中加入1ml不含fbs的imdm；同时在另一个24孔板中加入不含cdcs的血小板纤维蛋白支架，每个孔中加入1ml不含fbs的imdm；
s3.分别收集第1、5、9、13、17天中各孔中的培养基，同时加入等量的新鲜培养基imdm；
s4.按照大鼠特异性的elisa试剂盒要求，检测培养基中vegf、igf-1、sdf-1。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
在血小板纤维蛋白支架中cdcs可以形成血管网络结构，且能够表达心肌细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞的标志物；当与nrcms共培养，在含有cdcs的血小板纤维蛋白支架中的nrcms伸展，而细胞伸展是其发挥作用的歩骤之一，并且更多的nrcms具有舒缩功能，这说明血小板纤维蛋白支架除了作为载体外，还能够提供良好的干细胞微环境，维持干细胞活性，促进干细胞增殖，促进心脏干细胞向其他细胞类型分化，为再生提供了有利条件，并且两者混合后不仅不会束缚细胞的生长，还能够促进受体心脏心肌细胞的活性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
一种干细胞在心脏移植模型的应用。
优选地，所述干细胞为心脏肌球衍生细胞。
以上所述的心脏肌球衍生细胞在心脏移植模型中的应用，包括以下步骤：
s1.心脏肌球衍生细胞(cdcs)的培养；
s2.血小板纤维蛋白支架的制备；
s3.血小板纤维蛋白支架的观察；
s4.心脏肌球衍生细胞-血小板纤维蛋白支架联合移植。
优选地，所述步骤s1中的心脏肌球衍生细胞(cdcs)的培养包括以下步骤：取健康的清洁级雌性8周龄wky大鼠心肌组织，利用组织块培养法收获细胞，再通过悬浮培养和(或)贴壁培养方式获得大鼠心脏肌球衍生细胞，在体外观察细胞形态，持续传代观察细胞活性，绘制细胞生长曲线；利用流式细胞术检测不同来源和不同培养代数的的表面标志物vegf、igf-1、sdf-1以及细胞的表达。
优选地，所述步骤s2的血小板纤维蛋白支架的制备，还包括以下步骤：
s1.使用异氟醚深度麻醉大鼠；
s2.切开腹部皮肤，找出腹主静脉，采静脉血；
s3.将收集到的静脉血立即与8％(v/v)枸橼酸钠混匀；
s4.放入离心机中给予8000rpm离心5min，取上清液，按下述方法混合成胶成功，放入2ml离心管-20°保存待用；
s5.dmem放入37°水浴中预热；
s6.dmem和小板血浆上清液按照1-3：2-6比例混合，计时，观察成胶时间，以备体内试验用。
优选地，所述步骤s3中的血小板纤维蛋白支架的观察，还包括以下步骤：
s1.成型的血小板纤维蛋白支架立即用pbs清洗；
s2.用5％戊二醛在0.2m二甲胂酸钠缓冲液(ph7.5)中固定30-60min；
s3.用二甲胂酸钠缓冲液清洗3次，每次5-15min；
s4.用30％、40％、60％、80％、100％乙醇脱水，每一浓度脱水5-10min，再用六甲基二硅氮烷吸干；
s5.用采用离子溅射镀膜机喷镀金属，用扫描电镜拍照。
优选地，所述步骤s4中的心脏肌球衍生细胞-血小板纤维蛋白支架联合移植，还包括以下步骤：
s1.取1×106cdcs与50-100uldmem充分混匀，再与50-100ul富含血小板血浆混；
s2.在24孔板中加入100ul成胶前含有cdcs血小板纤维蛋白支架，每个孔中加入1ml不含fbs的imdm；同时在另一个24孔板中加入不含cdcs的血小板纤维蛋白支架，每个孔中加入1ml不含fbs的imdm；
s3.分别收集第1、5、9、13、17天中各孔中的培养基，同时加入等量的新鲜培养基imdm；
s4.按照大鼠特异性的elisa试剂盒要求，检测培养基中vegf、igf-1、sdf-1。
实验例1体内实验
(1)实验分组及取样时间设计
第一组(dmem租，即常规培养基组)在急性心肌梗死大鼠梗死心肌周边的3点、6点、9点和12点位置注射100uldmem，共15只；
第二组(血小板纤维蛋白支架组)在急性心肌梗死大鼠梗死心肌周边的3点、6点、9点和12点位置注射100ul经染色的血小板纤维蛋白支架，共15只；
第三组(血小板纤维蛋白支架+cdcs组)在急性心肌梗死大鼠梗死心肌周边的3点、6点、9点和12点位置注射未经染色含有cdcs的血小板纤维蛋白支架100ul共15只。
实验取样时间点为第12小时，第3天、第7天和第14天。
(2)血小板纤维蛋白支架中cdcs的扩增
将cdcs培养在血小板纤维蛋白支架中和常规组织培养盘中，14天后，相对于培养在普通培养盘中的cdcs，血小板纤维蛋白支架组中的cdcs伸长并形成血管样网络结构。在血小板纤维蛋白支架组中的cdcs数量和在常规条件下的cdcs(相对于12h的细胞数)在第12小时，第3天、第7天和第14天的细胞数分别为1.86±0.42、3.17±0.38、4.04±0.46和1.96±0.54、2.37±0.40、3.21±0.65，两组各对应值(p＜0.5)，前者的数量增加更加明显。
(3)血小板纤维蛋白支架中cdcs的活性
14d时分析在血小板纤维蛋白支架中和在常规条件下的cdcs长短轴之比为1.57±0.42和0.73±0.97，两者差异有统计学意义(p＜0.5)。14d时用细胞活性/毒性试剂盒染色在血小板纤维蛋白支架中和在常规条件cdcs的死亡百分比分别为(0.73±0.97)％和(1.57±0.42)％。
表明血小板纤维蛋白支架中联合cdcs能够更好地纠正心肌梗死后心脏功能；同时血小板纤维蛋白支架与cdcs之间能够相互促进，联合移植后能够再生更多的血管内皮细胞、心肌细胞，增加梗死部位血管密度，募集更多的干细胞进入梗死区域发挥再生功能，从而逆转负性心肌重塑，改善心脏功能。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。