本发明属于生物医药技术领域，涉及一种硬乳液纳微球及其制备方法和应用。
背景技术：
当今许多药物(紫杉醇，喜树碱等)，天然萃取产物(色黄酮)，香精，交联剂以及日化品核心成分，虽然被证明具有良好的生物性能，但是往往难溶于水，或者容易在水中或者醇中失活，从而制约其发展与应用。目前主要采用表面活性剂稳定的乳液对难溶成分进行包埋，储存和缓释。这些油乳制剂通常由油水两相组成，包含至少一种表面活性剂。常用的表面活性剂包括聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)、失水山梨糖醇酯(通常称为司盘)、辛苯聚醇-9(曲通x-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)以及卵磷脂等，特别是吐温80(聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(失水山梨糖醇三油酸酯)和曲通x-100的应用较多。表面活性剂在制剂中所起的作用主要是稳定乳液，避免破乳和乳滴聚并。
为实现这一目的，需要使用至少一种表面活性剂，并且为保持乳液稳定，表面活性剂在乳液中的含量需超过乳化所需量，从而导致水相或油相或二者之中存在游离表面活性剂。而这种制剂往往以液体形式4摄氏度储存，加之结构疏松，易染菌变性。需要加入大量的防腐剂。与此同时，由于缺乏刚性，导致其无法被冻干，使得其储存周期大大降低，增加了生产成本。并且，乳滴表面无法进行表面修饰和结构优化，限制了其在环境响应性释放，靶向递送，以及智能缓释体系等诸多领域的应用。
随后，生物相容性高分子纳微米颗粒问世。但是这种颗粒性载体，在成形过程中会发生相分离，致使活性成分于颗粒表面沉积，或与液体相一并分离，导致包埋效率和包埋质量降低(包埋率仅为30％以下)，从而致使大量的原料的浪费。并且，由于药物沉积于表面，随着聚合物的降解，脂溶性活性物质的释放过程中会出现突释，释放速率不稳定等现象。
针对以上问题，我们提出用硬乳液纳微米颗粒对脂溶性活性物质进行可控的包埋与释放。硬乳液颗粒为具备生物相容性壁材，内部包埋可代谢油脂的纳微米尺度的颗粒。与传统的采用表面活性剂稳定剂的乳液制剂不同，该固体乳滴颗粒用可降解油脂(椰子油，蓖麻油，角鲨烯和生育酚等)包埋脂溶性活性成分。与此同时，内核油滴表面致密的聚合物镀层，实现了对其的刚性加强与保护。并且，引入脂质体分子和修饰基团，赋予了颗粒环境响应性。另外，通过静电吸附，化学键合等方式，实现对蛋白，多肽和核酸等亲水性成分的共同装载，递送与释放。与传统的制剂相比，其具备突出的优势：(1)对生物体的毒副作用小；(2)致密壳层赋予更加高效的包埋率和优秀的缓释性能；(3)体系具备环境响应性；(4)多种活性分子共同装载，递送与可控释放；(5)可以冻干；(6)体系稳定性强。然而，目前关于高分子及油脂复合体系鲜有报道，而为数不多的工作也采用了生物相容性不佳的油脂原料，限制其在护肤品，食品以及药品方向的发展，或者储存稳定性不佳，亦或是无法实现高效的多组分装载及递送。例如，有报道一种聚苯乙烯包埋十六烷的微囊体系用于硝基茴香醚的包埋与释放。虽阐明了制备机理，但是所用的十六烷(hexadecane)不仅污染环境还危害人体健康。同时，体系并未考察储存和冻干的稳定性，不具备实际应用价值。另外有研究采用生物降解性丙交酯-共-乙交酯(也可称作乙交酯丙交酯共聚物或聚乳酸-羟基乙酸共聚物或d,l-丙交酯-共-乙交酯聚合物，英文名称poly(lactic-co-glycolicacid)，英文缩写，plg或plga，其丙交酯与乙交酯比例为50:50，粘度0.4dl/g)作为壳层膜材包埋乙二醇二癸酸酯(propyleneglycoldicaprylate)，从而实现对于疏水小分子全反式维甲酸(all-trans-retinoicacid，atra)和消炎药茚甲新(indomethacin，idmc)的装载与释放。虽然其初步抑制了纳米颗粒对于疏水小分子的突释现象，但是缓释效果仍不明显。
cn105311631a公开了一种cap-pla/plga纳微球及其制备方法与应用：(1)将pla或plga溶于有机溶剂中，形成油相o；(2)含有0.1m～1m钙离子的水溶液作为内水相w1，将油相o和w1混合，通过超声或匀质法制备初乳液w1/o；(3)溶解聚乙烯醇(pva)的水溶液作为外水相w2，将初乳液加入到w2中，机械搅拌形成预复乳液w1/o/w2；(4)将预复乳液w1/o/w2转移到快速膜乳化储料罐中，在适当气体压力下反复过膜，得到粒径均一的复乳液w1/o/w2；(5)向复乳液w1/o/w2体系中加入含0.1m～1m磷酸根离子的溶液，混匀，离心过滤除去溶液；去离子水洗涤，干燥得到纳微球，但是此方法没有将纳微球功能化，限制了其进一步应用。
目前现有方法中均没有关于功能化包埋油脂的硬乳液纳微颗粒的系统研究，已知的高分子及油脂复合体系也没有根据化妆品，食品和药品的需求再进行设计与优化。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种硬乳液纳微球及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种硬乳液纳微球，所述硬乳液纳微球包括生物相容性壁材、生物相容性油脂和修饰基团，所述生物相容性油脂形成的内核被包覆于生物相容性壁材形成的外壳内，所述修饰基团连接在所述外壳表面。
本发明提供的硬乳液纳微球(如图1所示)，为固体包埋液体体系，形成的纳米球外壳为坚硬的高分子壁材，而内核为液态的生物相容性油脂，与传统表面活性剂稳定的乳液相比，本发明特有的高分子及脂质体复合壁材壳层赋予体系极佳的储存和冻干稳定性，与此同时，该体系易于表面修饰和结构调控，从而实现多种产物的共同装载，靶向递送和智能型可控释放，在释放时，由于脂质体的存在使得小粒径硬乳液在接近体温区域(皮肤表面，口腔及消化道，皮下或者细胞内)出现聚并现象，减小比表面积，从而大大改善了纳微米递送体系的突释现象，实现长效缓释，在化妆品，食品以及医药领域具有广阔的应用前景。
进一步地，本发明中的硬乳液纳微球特有的壁材壳层，为体系提供了诸多优势：大大提升了其储存稳定性和应用领域；壳层膜材中加入双十八烷基溴化铵、3β-[n-(n',n'-二甲基胺乙基)]胺基甲酰基、胆固醇，聚醚酰亚胺、壳聚糖等，可以实现对于亲水性生物大分子(如：蛋白、多肽、核算药物或亲水性化合物)的共同装载；在膜材中加入双十八烷基溴化铵、3β-[n-(n',n'-二甲基胺乙基)]胺基甲酰基、胆固醇、卵磷脂、磷脂及其衍生物等物质后，小粒径的纳微米硬乳液在接近体温区域(皮肤表面，口腔及消化道，皮下或者细胞内)会受热出现聚并现象，减小比表面积，实现长效缓释；壳层为硬乳液纳微颗粒提供绝佳的修饰位点，使得体系易于表面修饰与结构调控，从而实现产物的靶向递送和智能型可控释放。
此外，相较于表面活性剂稳定的乳液而言，本发明提供的硬乳液纳微球具有更好的刚性，可以冻干，延长其储存时间，节约成本。
在本发明中，硬乳液纳微球包括：包埋生物相容性油脂的具备生物相容性壁材硬乳液纳微球；包埋疏水性药物与生物相容性油脂的聚合物硬乳液纳微球；包埋疏水性化合物与生物相容性油脂的硬乳液并修饰有基团的纳微球；包埋生物相容性油脂的聚合物硬乳液并修饰有基团的纳微球；包埋生物相容性油脂的聚合物硬乳液并修饰有基团同时装载了亲水性化合物的纳微球。
优选地，所述生物相容性壁材包括生物相容性高分子材料和任选地脂质体。
优选地，当生物相容性壁材中包括脂质体时，所述脂质体在生物相容性壁材中的质量百分比小于或等于80％。
在本发明中，所述生物相容性壁材具有生物相容性，优选壁材由生物相容性高分子材料和脂质体混合而成。由于脂质体分子在壁材中的引入，高分子及脂质体分子复合壁材，兼具两种膜材的优势，可以大大提升对疏水性化合物的包埋率，稳定可代谢油脂，并且添加更多的修饰基团，利于后期对于壁材的改性，生物相容性高分子材料和脂质体分子材料以(1-9):1为更佳的重量比，并且，生物相容性高分子聚合物优选可以溶解于有机溶剂中的高分子材料。
优选地，所述生物相容性高分子材料包括聚α-羟基酸及其衍生物、聚羟基丁酸及其衍生物、聚己酸内酯及其衍生物、聚原酸酯及其衍生物、聚酸酐及其衍生物或聚氰基丙烯酸酯及其衍生物中的任意一种或至少两种的组。
优选地，所述生物相容性高分子材料为聚α-羟基酸及其共聚物，优选自聚(l-丙交酯)、聚(d,l-丙交酯)或聚(丙交酯-共-乙交酯)，进一步优选为聚(丙交酯-共-乙交酯)，应为缩写(plg或plga)。
优选地，在聚(丙交酯-共-乙交酯)中，丙交酯与乙交酯的链段摩尔比为(1-9):(9-1)，例如可以是1:9、1:4、1:1、2:3、5:8、6:1或9:1。
在本发明中，不同的链段摩尔比会影响材料的亲疏水性以及降解速度，例如含有50％d,l-丙交酯和50％乙交酯的50:50plga聚合物的降解较快，而因为丙交酯分量增加，75:25plga降解较慢。
在本发明中，可以采用已知工艺制备得到各种分子量的上述聚合物，可以根据所需的释放速率以及应用领域等影响因素确定合适分子量。对于聚(l-丙交酯)和聚(d,l-丙交酯)，例如合适的分子量是约2000-5000道尔顿级别的。对于plga，合适的分子量通常是约10000到约200000道尔顿，优选约13000到约150000道尔顿。
优选地，所述脂质体包括阳离子脂质体、阴离子脂质体或辅助脂质体中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述阳离子脂质体包括氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化三甲基十六烷基铵、溴化二甲基双十八烷基铵、1,2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯、脂质多聚-l-赖氨酸、3β-[n-(n',n'-二甲基胺乙基)胺基甲酰基或硬脂酸中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述阴离子脂质体包括磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸或磷脂酸衍生物中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述辅助脂质体包括天然卵磷脂、合成卵磷脂、磷脂酰胆碱或磷脂酰胆碱类似物中的任意一种或者至少两种的组合。
优选地，所述生物相容性油脂在硬乳液纳微球中的质量百分比为5％-80％，例如可以是5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。
优选地，所述生物相容性油脂包括生育酚及其类似物、大豆油、米格列醇、中链油、鱼油、维生素e、维生素e琥珀酸酯、维生素e醋酸酯、红花油、玉米油、沙棘油、亚麻子油、花生油、茶油、葵花籽油、杏仁油、薏仁油、月见草油、芝麻油、棉籽油、蓖麻油、低芥酸菜子油、油酸乙酯、油酸、亚油酸乙酯、月桂酸异丙酯、内豆蔻酸异丙酯、椰子油、丁酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯、甘油三硬脂酸酯、饱和脂肪酸甘油酯、棕榈酸甘油酯、肉桂酸甘油酯、鲸蜡酸十六酸酯中的任意一种或者至少两种的组合；
优选地，所述生物相容性油脂为角鲨烯、生育酚、蓖麻油或蓖麻油类似物中的任意一种或者至少两种的组合。
在本发明中，所述角鲨烯是一种三萜类化合物，其英文名称是squalene，分子结构为三十碳五十氢的异戊二烯，分子式为：2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯，分子质量：410.72，可来源于动物、植物提取或化学合成。角鲨烯是一种可代谢的油，因为它是胆固醇的生物合成的中间产物。这是一种所有高等生物，包括在人类身上(皮脂中可以找到)自然分泌的油脂。含有角鲨烯的乳液(含表面活性剂)在动物实验和临床实验上表现出优异的免疫增强作用。
所述母育酚是α-生育酚或其衍生物如α-生育酚琥珀酸酯(也称作维生素e琥珀酸酯)。α-生育酚在针对老年患者(如年龄大于60岁或更大的患者)的疫苗中，可以起到增强免疫应答的作用。存在的母育酚包括α、β、γ、δ、ε、ζ等多种生育酚，优选α-生育酚，尤其是dl-α-生育酚。
优选地，所述生物相容性油脂中还包括疏水性药物。
在本发明中，疏水性药物具有强疏水性，不易储存和释放的特点。
优选地，所述疏水性药物选自抗肿瘤广谱药物、免疫激活佐剂物质或抗肿瘤靶向药物中的任意一种。
优选地，所述抗肿瘤广谱药物包括喜树碱类药物、阿霉素类药物、紫杉醇类药物或顺铂类药物中的任意一种或者至少两种的组合。
优选地，所述免疫激活佐剂物质包括单磷酰脂质(monphosphoryllipid,mpla)、咪喹莫特(imiquimod)或聚肌苷酸胞苷酸(poly(i:c))的任意一种或者至少两种的组合。
优选地，所述抗肿瘤靶向药物包括依维莫司、依鲁替尼、伊马替尼、维莫德吉、维罗非尼、替西罗莫司、索尼德吉、索拉非尼、舒尼替尼、赛立替尼、瑞格非尼、曲美替尼、普钠替尼、硼替佐米、帕唑帕尼、帕博西尼、帕比司他、尼罗替尼、罗米地辛、乐伐替尼、拉帕替尼、克唑替尼、卡非佐米、卡博替尼、卡比替尼、吉非替尼、伏立诺他、凡德他尼、厄洛替尼、狄诺塞麦、达沙替尼、达拉菲尼、博舒替尼、贝利司他、奥斯替尼、奥拉帕尼、艾乐替尼、阿西替尼、阿法替尼或阿柏西普中的任意一种或者至少两种的组合。
优选地，所述修饰基团的供体包括亲水性生物大分子、偶联靶向物质、荧光标记物、同位素标记物、环境响应物质、免疫调节剂、模式识别受体、免疫增强剂、细胞因子或趋化因子中的任意一种或至少两种的组合。
在本发明中，所述修饰基团通过亲水修饰、疏水修饰、覆层或接枝改性等方式连接于壁材表面。
优选地，所述亲水性生物大分子包括蛋白类物质、多肽类物质、短肽和氨基酸衍生物或核酸类物质的任意一种或者至少两种的组合。
优选地，所述生物相容性油脂中还包括亲水性生物大分子。
优选地，所述蛋白类物质包括抗原(包括不限于鸡胚培养、细胞培养、携带者体液、器官或组织中纯化分离所得、重组基因表达或化学合成所得)、药用性蛋白(包括不限于天然提取产物和重组蛋白的组合)或抗体类物质中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述抗体类物质包括雷莫芦单抗、耐昔妥珠单抗、纳武单抗、派姆单抗、曲妥珠单抗、帕尼单抗、西妥昔单抗、奥法木单抗、奥宾尤妥珠单抗、本妥昔单抗、利妥昔单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗、派姆单抗、贝伐珠单抗、曲妥珠单抗、达雷木单抗、埃罗妥珠单抗、博纳吐单抗或地努图希单抗中的任意一种或者至少两种的组合。
优选地，所述环境响应物质选自带有ph敏感、热敏感或生物活性物质敏感的基团的物质。
优选地，所述环境响应物质包括聚n-异丙基丙烯酰胺、二茂铁、石墨烯、马来酰亚胺中的任意一种或者至少两种的组合。
优选地，所述模式识别受体包括toll样受体的刺激剂、rig-1受体的刺激剂、nod样受体的刺激剂、矿物盐、皂苷、脂质体、脂质体配制品、合成的微颗粒、合成的微载体、沙眼衣原体、细菌的外膜泡、多糖、特异性修饰的肽、制备的肽、蛋白质、病原相关分子模式或氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯中的任意一种或至少两种的组合。
在本发明中，rig-1和nod样受体的刺激剂可以是含cpg基序的寡核苷酸或双链rna或含回文系列的寡核苷酸或含聚(dg)序列的寡核苷酸；矿物盐可以是明矾，与肠细菌(例如大肠杆菌、明尼苏达沙门菌、鼠伤寒沙门菌或弗氏志贺菌)单磷酰脂质(monphosphoryllipid，mpla)结合的明矾或分别与
优选地，所述细胞因子包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、干扰素、白细胞介素、酪氨酸激酶3配体或肿瘤坏死因子-α中的任意一种或至少两种的组合。
在本发明中，干扰素可以是干扰素-α(ifn-α)、干扰素-β(ifn-β)、干扰素-γ(ifn-γ)等；白细胞介素可以是白细胞介素-1α(il-1α)、白细胞介素-1β(il-1β)、白细胞介素-2(il-2)、白细胞介素-4(il-4)、白细胞介素-7(il-7)、白细胞介素-12(il-12)、白细胞介素-15(il-15)、白细胞介素-18(il-18)等。
优选地，所述硬乳液纳微球还包括药用添加剂。
优选地，所述药用添加剂在硬乳液纳微球中的质量分数为0-20％，例如可以是0、1％、5％、10％、12％、15％、18％或20％。
优选地，所述药用添加剂包括稀释剂、稳定剂或防腐剂中的任意一种或者至少两种的组合。
在本发明中，硬乳液微球可以分别以液体悬液的形式或者冻干品的方式进行包装储存。为保证本发明液体悬液和冻干稳定性和储存稳定性，本发明中还包括药用辅助物质，如ph调节剂或及和缓冲剂等，优选乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、人血清清蛋白、必需氨基酸、非必需氨基酸、l-精氨酸盐酸盐、蔗糖、无水d-海藻糖、甘露醇、甘露糖、淀粉或明胶中的任意一种或者至少两种的组合。其中典型但非限制性的组合为：乙酸钠和乳酸钠的组合；氯化钠和氯化钾的组合；氯化钙、人血清清蛋白和必需氨基酸的组合；非必需氨基酸、l-精氨酸盐酸盐、蔗糖和无水d-海藻糖的组合；甘露醇、甘露糖、淀粉和明胶的组合，乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和人血清清蛋白的组合；必需氨基酸、非必需氨基酸、l-精氨酸盐酸盐、蔗糖、无水d-海藻糖、甘露醇、甘露糖、淀粉和明胶的组合。
优选地，所述硬乳液纳微球的平均粒径为10nm-50μm，例如可以是10nm、100nm、400nm、700nm、1μm、10μm、20μm、30μm、40μm或50μm，优选50nm-20μm。
在本发明中，在优选范围内的硬乳液颗粒具备更好的粒径分布，储存稳定性，以及更好的生物活性，平均粒径高于或者低于上述范围，都会使颗粒佐剂的稳定性、包埋率和免疫效果均出现明显降低的趋势。
第二方面，本发明提供了如第一方面所述的硬乳液纳微球的制备方法，所述方法包括以下步骤：将生物相容性壁材溶解于包含有生物相容性油脂的溶剂中，经过分散、固化、修饰基团的修饰后分离得到所述硬乳液纳微球。
本发明提供的制备方法首先配制油相，将目标包埋生物相容性油脂和生物相容性壁材以及如上所述的的可根据目的需求加入的难溶物等物质和修饰基团溶解在油相溶剂中。
优选地，所述溶剂为油相溶剂和水相溶剂组成的混合溶剂。
优选地，所述油相溶剂和水相溶剂的质量比为1:2-499，例如可以是1:2、1:10、1:100、1:200、1:300、1:400或1:499。
优选地，所述油相溶剂包括良溶剂和不良溶剂，所述良溶剂在油相溶剂中的体积分数为40％-100％，例如可以是40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，所述不良溶剂在油相溶剂中的体积分数为0-60％，例如可以是0、10％、20％、30％、40％、50％或60％。
在本发明中，没有不良溶剂也可以形成纳米球，不良溶剂体积为0时也可以存在生物相容性油脂。
优选地，所述良溶剂和不良溶剂的体积比为9:1或8:2。
在本发明中，混合溶剂有利于油脂与壁材在乳液内部发生相分离。通过调节良溶剂和不良溶剂的配比，相分离的速率可以得以调控，从而优化所形成的硬乳液纳微球的内部结构，达到提升包埋率的目的，但是如果不良溶剂在体系中过多可能会使有效成分无法溶解于油相中，导致体系不稳定。
优选地，所述良溶剂包括异戊烷、正戊烷、己烷、环己烷、异辛烷、三氟乙酸、三甲基戊烷、环戊烷、庚烷、三氯乙烯、四氯化碳、三氯三氟代乙烷、丙基醚、甲苯、对二甲苯、氯异丁醇、二乙醚、四氢呋喃、石油醚、二氯甲烷、三氯甲烷、异丙醇、二甲基亚砜、丙酮、乙酸乙酯或乙腈中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述不良溶剂包括甲醇、乙醇、丙醇、乙二醇、甲酰胺、三氟乙酸、水中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述水相溶剂包括乳化剂和/或盐溶液。
优选地，所述乳化剂和/或盐溶液在水相溶剂中的质量分数为0-40％，例如可以是0、10％、20％、25％、30％、35％或40％。
优选地，所述乳化剂包括聚乙烯醇pva、聚醚酰亚胺pei、聚乳酸-甲氧基聚乙二醇pla-peg、聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性剂(吐温)、失水山梨糖醇酯(司盘)、辛苯聚醇-9(曲通x-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、油酸钠、泊洛沙姆、卵磷脂、双十二烷基二甲基溴化胺或十六烷基三甲基溴化铵中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述盐溶液包括磷酸盐缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、氯化钠溶液、氯化钾溶液、硝酸钾溶液、硫酸钠溶液或tris-hcl缓冲液中的任意一种或者至少两种的组合。
优选地，所述分散的方式包括超声、微流控、均质、超声、注射器双推乳化、喷雾、微射流、微通道、膜乳化、搅拌、振荡、倒转或手摇中的任意一种。
在本发明中，分散的方式只要能通过功率、时间、次数等参数到达目标颗粒粒径均可，所采用的分散方式不会对生物相容性壁材和生物相容性油脂造成明显影响，可根据所用水相及固体颗粒性质及自身的实验设备条件选择合适的分散方式及具体操作参数。
根据不同的需求，分散中混合方式可以优选微流控、微通道或膜乳化等可以获得均一粒径分布乳液的方式，也可以优选微射流、注射器双推乳化、搅拌或振荡等便于规模化制备的混合方式。应该明确的是，不同的分散方式、制备功率、时间、次数等必然影响所得颗粒的粒径大小、分散性和稳定性等，也将影响到最终的包埋效率、释放、靶向递送等效果。因此，应根据所用油水相及固体颗粒性质、所需制备的乳滴粒径范围等影响因素确定合适的混合方式及具体操作参数。
优选地，span低于1.0的硬乳液纳微球具备更高的包埋率和稳定性，并且具备更好的缓释性能。
优选地，所述固化的方法包括溶剂挥发法、物理交联法、化学交联法、氧化还原法、高温煅烧法、调节ph法、调节盐浓度法、萃取法或沉淀法中的任意一种。
在高分子纳微球包埋疏水性化合物的工作中，由于疏水分子在相分离过程中(油相及水相)倾向于在界面沉积，使得疏水化合物在固化时与液体相一并分离，致使包埋率和生物利用度的降低。而本发明通过一步乳液法，利用内部相转换原理(如图2所示)，引入了与壁材不溶的油脂作为第三相。通过调节溶剂的比例，内部相分离(油脂及含壳层膜材的油相)先于外部相分离(含壳层膜材的油相及外水相)，致使疏水性分子于内部脂滴界面沉积。本发明提供的方法避免了疏水性化合物在纳微颗粒外部沉积或与水相一并分离，从而大大提升包埋和装载的效率。并且，此方法操作简单，大大节约了实际生产中的生产成本和灭菌成本，利于广泛推广。
第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的硬乳液纳微球在制备疫苗佐剂或药物递送载体中的应用。
本发明提供的硬乳液纳微球可以使得疏水性香料、交联剂、药物、免疫激活物质以及其他成分将实现更加高效的包埋、储存保护与缓释。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的硬乳液纳微球，与传统表面活性剂稳定的乳液相比，本发明特有的高分子及脂质体复合壁材壳层赋予体系极佳的储存和冻干稳定性，与此同时，该体系易于表面修饰和结构调控，从而实现多种产物的共同装载，靶向递送和智能型可控释放，在释放时，由于脂质体的存在使得小粒径硬乳液在接近体温区域(皮肤表面，口腔及消化道，皮下或者细胞内)出现聚并现象，减小比表面积，从而大大改善了纳微米递送体系的突释现象，实现长效缓释，在化妆品，食品以及医药领域具有广阔的应用前景。
(2)发明通过一步乳液法，利用内部相转换原理，引入了与壁材不溶的油脂作为第三相，通过调节溶剂的比例，内部相分离(油脂及含壳层膜材的油相)先于外部相分离(含壳层膜材的油相及外水相)，致使疏水性分子于内部脂滴界面沉积；本发明提供的方法避免了疏水性化合物在纳微颗粒外部沉积或与水相一并分离，从而大大提升包埋和装载的效率，并且，此方法操作简单，大大节约了实际生产中的生产成本和灭菌成本，利于广泛推广。
附图说明
图1是本发明的硬乳液纳微球的结构示意图。
图2是本发明的制备方法中一步乳化法内部相转换原理示意图。
图3是本发明实施例1中制备的油脂聚合物硬乳液纳微球的粒径分布图。
图4是本发明实施例1中制备的油脂聚合物硬乳液纳微球的扫描电镜图。
图5是本发明实施例3中修饰基团修饰的包埋生物相容性油脂的聚合物硬乳液纳微球的粒径分布图。
图6是本发明实施例3中修饰基团修饰的包埋生物相容性油脂的聚合物硬乳液纳微球的扫描电镜图。
图7a是本发明实施例7中油脂聚合物硬乳液纳微球冻干前扫描电镜图。
图7b是本发明实施例7中油脂聚合物硬乳液纳微球冻干后扫描电镜图。
图8是本发明实施例8中油脂聚合物硬乳液纳微球对被包埋化合物的保护储存稳定性荧光图谱。
图9是本发明实施例9中油脂聚合物硬乳液纳微球随时间变化的缓释曲线图。
图10是本发明实施例12中油脂聚合物硬乳液纳微球体内分布图表征靶向性评价图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本发明实施例中使用的原料如下表1所示：
表1
本发明实施例中用到的仪器如下表2所示：
表2
以下实施例中颗粒中油脂包埋率及载量的测定方法如下：
快速检测包埋油脂简单方法：取载药颗粒冻干粉，置于高温下使微球降解，若出现油滴，表示包埋成功。
精确检测方法：准确称量10mg载药颗粒冻干粉，采用适当的方法使微球完全降解(例如，对于聚乳酸类微球，可采用加入色谱级乙腈或者丙酮；对于壳聚糖类微球，可采用加入色谱级二甲基亚砜，等同时溶解壳层膜材和油脂的溶剂或者混合溶剂使微球降解)。待颗粒完全降解后，采用高效液相色谱(hplc)或者高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)或气相色谱或其他适宜的检测方法测定。
颗粒中抗原或药物包埋率及载量的测定：
准确称量10mg载药颗粒冻干粉，采用适当的方法使微球完全降解(例如，对于聚乳酸类微球，可采用加入naoh溶液或乙腈的方法使微球降解；对于壳聚糖类微球，可采用加入稀盐酸的方法使微球降解)。待颗粒完全降解后，用naoh或盐酸中和降解液，使其ph＝7，再定容至2ml。亲水性化合物含量采用bca试剂盒或micro-bca试剂盒或elisa试剂盒或其他适宜的检测方法测定。疏水性化合物采用高效液相色谱(hplc)或者高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)或其他适宜的检测方法测定。抗原或药物包埋率按以下公式计算：包埋率＝(实测颗粒中抗原或药物量/实际制备时抗原或药物加入量)×100％。
抗原或药物在颗粒上的载量按以下公式计算：载量＝(实测颗粒中抗原或药物量/所测颗粒的质量)。
颗粒上吸附抗原或药物的吸附率及载量的测定：
取出吸附抗原或药物后的颗粒悬浮液，离心取上清(根据颗粒的大小和密度选择合适的离心条件)，测量上清中抗原或药物浓度，从而间接计算出吸附到颗粒表面的抗原或药物的量。亲水性化合物含量采用bca试剂盒或micro-bca试剂盒或elisa试剂盒或其他适宜的检测方法测定。疏水性化合物采用高效液相色谱(hplc)或者高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)或其他适宜的检测方法测定。抗原或药物吸附率按以下公式计算：吸附率＝(吸附前抗原或药物浓度—吸附后上清中抗原或药物浓度)/吸附前抗原或药物浓度×100％。
抗原或药物在颗粒上的载量按以下公式计算：载量＝(实测颗粒上抗原或药物量/所测颗粒的质量)。
实施例1
本实施例通过以下方法制备包埋生物相容性油脂的plga聚合物硬乳液纳微球
采用电子天平准确称取0.30g的plga(la:ga为50:50，分子量为11万道尔顿)，0.30g角鲨烯，溶于1ml的乙醇与二氯甲烷的混合溶液中，将溶液迅速倒入20ml水溶液(含有1wt.％的pva，pva的醇解度为99％，粘度为5.0mpa·s)，在超声条件下分散(50w，2min，间隔时间4s)。25℃下搅拌过夜(磁力搅拌，转速为500rpm)，在常温下，利用溶剂挥发法，去除体系中的乙醇和二氯甲烷溶剂，固化硬乳液纳微颗粒。固化完成后，于20000g下离心20min，弃去上清，向沉淀中加入10ml去离子水，超声分散，20000g下离心5min，弃去上清后，将沉淀冻干得到制备包埋生物相容性油脂的plga聚合物硬乳液纳微球，置于冰箱中4℃保存。
将制备得到plga聚合物硬乳液纳微球进行粒径分布测定：
微米级颗粒或乳滴的粒径分布采用激光粒度仪进行测定，具体测定步骤为：将5mg微米级颗粒加入到50ml的去离子水中，超声5min使其均匀分散，或取50ml乳液，将颗粒悬浮液或乳液加入到样品池中，采用激光粒度仪(malverninstruments,unitedkingdomcoulterco.,usa)进行测定。
纳米级颗粒或乳滴的粒径分布采用zeta电位及粒度分析仪进行测定，具体测定步骤为：将1mg纳米级颗粒，加入10ml去离子水中，超声5min使其均匀分散，或取2ml乳液，将颗粒悬浮液或乳液加入到样品池中，放入zeta电位仪(zetapotentialanalyzer,brookhaveninstrumentscorporation)中进行测定。
颗粒或乳滴的均一性由粒径分布系数(span)值表示。span计算公式为：span＝(d90-d10)/d50，其值越小表明颗粒粒径越均一，其中d10，d50和d90分别为颗粒累计体积为10％，50％，90％时的粒径。
颗粒的形貌观察采用扫描电镜观察：称量1mg颗粒，加入10ml去离子水中，超声5min使其均匀分散。吸取1ml悬浮液，将其滴在铝箔上，使其在铝箔上均匀摊开，自然晾干。将铝箔用导电胶贴于样品台上，在真空条件下喷金(根据样品性质选取合适的喷金条件)后，用扫描电子显微镜进行观察。
由上述测试得到plga颗粒的平均粒径为257nm，span为0.335。
进行扫描电镜观察，表面光滑，球形规整。颗粒的粒径分布图如图3所示，可以看出平均粒径为10nm-50μm；形貌如图4所示，可以看出颗粒粒径越均一。
本实施例还可采用其他pla类高分子制备包埋生物相容性油脂的硬乳液纳微球，其制备步骤与实施例1相似，具体参数及结果如表3所示。
表3
实施例2
本实施例通过以下步骤制备包埋疏水性药物的硬乳液纳微球
采用电子天平准确称取2mg全反式维甲酸溶解于0.30g角鲨烯，称取0.30gpla，并溶于1ml的乙醇与二氯甲烷的混合溶液中，将溶液迅速倒入20ml水溶液(含有1wt.％的pva，pva的醇解度为99％，粘度为5.0mpa·s)，在超声条件下分散(50w，2min，间隔时间4s)。25℃下搅拌过夜(磁力搅拌，转速为500rpm)，在常温下，利用溶剂挥发法，去除体系中的乙醇和二氯甲烷溶剂，固化硬乳液纳微颗粒。固化完成后，于20000g下离心20min，弃去上清，向沉淀中加入10ml去离子水，超声分散，20000g下离心5min，弃去上清后，离心分离，并且冻干，得到硬乳液纳微球。
本实施例还可以采用硬乳液纳微球包埋多种疏水性药物，得到的纳微球均具备高效的包埋率，其制备步骤与实施例2类似，具体工艺参数及结果如表4所示。
表4
实施例3
本实施例通过以下步骤制备修饰基团修饰的包埋生物相容性油脂的聚合物硬乳液纳微球
采用电子天平准确称取1.0g的plga(分子量为15万道尔顿)，0.50g角鲨烯，0.2g溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵，溶于10ml的乙醇与二氯甲烷(1:9)的混合溶液中，将溶液迅速倒入200ml水溶液(含有0.5wt.％的pva，其中pva的醇解度为99％，粘度为3.0mpa·s)，在超声条件下分散(40w，2min，间隔时间4s)。25℃下搅拌过夜(磁力搅拌，转速为500rpm)，在室温下去除溶剂中的有机溶剂，从而固化硬乳液颗粒。5000g下离心20min，弃去上清，向沉淀中加入5ml去离子水，超声分散，5000g下离心5min，弃去上清后，将沉淀冻干得修饰有阳离子脂质体基团的包埋油脂的plga聚合物硬乳液纳微球，置于冰箱中4℃保存。
通过扫描电镜观察所制备颗粒的表面光滑，球形规整。颗粒的粒径分布图如图5所示，平均粒径为2689nm，span为0.405；形貌如图6所示，可以看出形貌变大，形状均一。
本实施例还可采用其他修饰基团(脂质体，靶向分子，环境响应性物质等)来制备修饰有基团的包埋油脂的聚合物硬乳液纳微球，其制备步骤与实施例3类似，具体工艺参数及结果如表5所示(配基修饰率＝单位质量纳微球中配基含量(mg)/纳微球质量*100％)。
表5
实施例4
本实施例通过以下步骤制备包埋疏水性药物的带有修饰基团的油脂聚合物硬乳液纳微球
采用电子天平准确称取2.0g的plga(分子量为43万道尔顿)，1.0g角鲨烯，0.3g溴化二甲基双十八烷基铵和10mg全反式维甲酸，溶于30ml的乙醇、丙酮与二氯甲烷(1/1/9)的混合溶液中，将溶液迅速倒入400ml水溶液(含有1wt.％的pva(醇解度为99％，粘度为5.0mpa·s)，在超声条件下分散(100w，3min，间隔时间4s)。25℃下搅拌过夜(磁力搅拌，转速为500rpm)，来去除有机溶剂，实现体系的固化。15000g下离心20min，弃去上清，向沉淀中加入10ml去离子水，超声分散，15000g下离心20min，弃去上清后，将沉淀冻干，置于冰箱中4℃保存。所制备颗粒的平均粒径为302nm，span为0.501，包埋率为85.2％，修饰率为9.2％。
本实施例还可通过带有修饰基团的油脂聚合物硬乳液纳微球包埋多种疏水性药物，选自抗肿瘤广谱药物，免疫激活佐剂物质，抗肿瘤靶向药物，荧光类物质等，得到的纳微球均具备高效的包埋率。
实施例5
本实施例通过以下步骤制备包埋亲水性化合物的油脂聚合物硬乳液纳微球
采用电子天平准确称取模式蛋白ova10mg，溶解于1ml去离子水中，称取0.2g的plga(分子量为43万道尔顿)，0.1g角鲨烯，0.04g溴化二甲基双十八烷基铵和10mg全反式维甲酸，溶于30ml的丙酮与二氯甲烷(1:9)的混合溶液中。将含有ova的水溶液迅速倒入此混合溶液中形成初乳，磁力搅拌2min(500rpm)。再将初乳迅速倒入50ml水溶液(含有1wt.％的pva，其中醇解度为99％，粘度为5.0mpa·s)，在超声条件下分散(200w，2min，间隔时间4s)。25℃下搅拌过夜(磁力搅拌，转速为500rpm)，10000g下离心20min，弃去上清，向沉淀中加入10ml去离子水，超声分散，10000g下离心20min，弃去上清后，将沉淀冻干，置于冰箱中4℃保存。
制备颗粒的平均粒径为451nm，span为0.567，atra包埋率为85.2％，蛋白包埋率为61.7％，修饰率为9.2％。
实施例6
本实施例通过以下方法制备吸附亲水性化合物的油脂聚合物硬乳液纳微球
采用实施例3-5中方法制备油脂聚合物硬乳液纳微球，并冻干得到产品。称取2mg制得的纳微球与ova蛋白以2000:1，1000:1，500:1，200:1，100:1，50:1和10:1的比例混合，在4℃垂直混悬过夜后，测试其吸附率，其结果总结如下表6所示：
表6
结果显示，硬乳液纳微颗粒具备高ova负载率。本实施例还可用此方法通过油脂聚合物硬乳液纳微球吸附多种亲水性化合物，其中亲水性化合物选自蛋白类物质，多肽类物质，短肽和氨基酸衍生物，核酸类物质的任意一种或者至少两种的组合，得到的纳微球均具备高效的吸附率。
实施例7
测定油脂聚合物硬乳液纳微球的冻干稳定性
采用实施例1-6中方法制备油脂聚合物硬乳液纳微球，并将其冻干，将冻干前和冻干后的纳微球制样，喷金，并用扫描电镜观察其形态。结果如图7a和图7b所示，与冻干前(图7a所示)相比，在冻干后(图7b所示)纳微球的粒径和结构并未出现明显变化，证明制备的油脂聚合物硬乳液纳微球具备良好的冻干稳定性，适用于内容油脂或者疏水性分子的长久保存。
为进一步保证纳微球在冻干过程中加入冻干保护剂，如可以是氨基酸、l-精氨酸盐酸盐、蔗糖、无水d-海藻糖、甘露醇、甘露糖、淀粉或明胶的任意一种或至少两种的组合。
实施例8
测试油脂聚合物硬乳液纳微球对于目标包埋物的长期储存性
准确称取20mgatra(热不稳定性，光不稳定性疏水化合物)，并采用实施例2、4、5和6中方法，将其包埋于油脂聚合物硬乳液纳微球，将2.0g冻干后的包埋有atra纳微球和相同目标质量的atra粉末分别储存于25℃储存14天。将储存前的atra，储存后的纳微球和atra用10微升氯仿溶解，并利用荧光光谱仪(hitachi,f-4600)进行全波谱扫描，结果如图8所示，储存在纳微球的atra(绿色)和未储存的atra(红色)的荧光光谱并未出现明显的荧光偏离，而未被保护的atra(蓝色)出现明显偏移，表明长期储存使得atra的构型出现变化，而储存在硬乳液颗粒中大大提升了其稳定性，证明油脂聚合物硬乳液纳微球可以有效保护疏水性小分子，提高其储存稳定性。
实施例9
测试油脂聚合物硬乳液纳微球的缓释效果
采用实施例1-6中制备方法，利用油脂聚合物硬乳液纳微球包埋伊马替尼，冻干。利用电子天平准确称取100mg包埋有伊马替尼的纳微球，将其溶解于0.5ml透析管中，置于25mlpbs，于37度进行缓释实验。每8小时吸取1ml外水相，并补加1mlpbs。缓释实验终止后，利用高效液相色谱(hplc)对伊马替尼进行检测，得出缓释曲线。如图9所示，油脂聚合物硬乳液纳微球有效缓解了高分子聚合物微球突释的现象，实现了对目标药物的长效缓释。
实施例10
高分子壁材硬乳液纳微颗粒与高分子/脂质体复合型壁材硬乳液纳微颗粒的对比
采用实施例1-5中方法制备包埋有伊马替尼的高分子壁材硬乳液纳微颗粒和高分子/脂质体复合壁材纳微颗粒，并冻干得到产品。称取10mg两种纳微球，采用色谱级乙腈溶解，利用高效液相色谱测得其对于伊马替尼的包埋率，总结如下表7。另外，如实施例9所述，称取100mg制得的两种纳微球，将其溶解于0.5ml透析管中，置于25mlpbs，于37℃进行缓释实验。每8小时吸取1ml外水相，并补加1mlpbs。缓释实验终止后，利用高效液相色谱(hplc)对伊马替尼进行检测，得出缓释曲线，结果与图9相近。采用半数释放率为检测缓释效果的评价(50％的包埋的伊马替尼被释放出来所需要的时间，r50)，r50其结果总结如下表7所示。结果显示，复合型壁材具备更高的包埋率和更佳的缓释效果。
表7
实施例11
测试修饰后油脂聚合物硬乳液纳微球温度敏感性
采用电子天平准确称取0.5g的pla-peg(分子量为23万道尔顿)，蓝莓香精10mg，0.5g角鲨烯，0.2g溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵，溶于10ml的乙醇与二氯甲烷(2/8)的混合溶液中，将溶液迅速倒入50ml水溶液(含有0.5wt.％的pva(醇解度为99％，粘度为3.0mpa·s)，在超声条件下分散(200w，2min，间隔时间4s)。25℃下搅拌过夜(磁力搅拌，转速为500rpm)，20000g下离心20min，弃去上清，向沉淀中加入5ml去离子水，超声分散，20000g下离心5min，弃去上清后，将沉淀冻干得温度敏感性油脂聚合物硬乳液纳微球，其平均粒径为312nm，span为0.581，置于4℃保存。
将4℃放置的包埋有蓝莓香精的纳微球取出，于受试者皮肤涂抹，并揉搓5min，受试者于1min闻到浓烈的蓝莓香精味道，证明形成的纳微球在体表温度下发生一定程度的解聚，致使其释放出包埋蓝莓香精的角鲨烯油滴，使得活性成分环境响应性释放。
实施例12
测试修饰后油脂聚合物硬乳液纳微球靶向性
按照实施例3-6中方法制备硬乳液纳微球，采用电子天平准确称取2.0g的plga(分子量为13万道尔顿)，0.5mgcy7(荧光标记物)，1.0g角鲨烯，0.2g溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵，溶于10ml的乙醇与二氯甲烷(2/8)的混合溶液中，将溶液迅速倒入50ml水溶液(含有0.5wt.％的pva(醇解度为99％，粘度为3.0mpa·s)，在超声条件下分散(200w，2min，间隔时间4s)。25℃下搅拌过夜(磁力搅拌，转速为500rpm)，20000g下离心20min，弃去上清，向沉淀中加入5ml去离子水，超声分散，20000g下离心5min，弃去上清后，将沉淀加入5ml含有0.5wt.％氨基修饰的rgd短肽溶液(靶向基团)，室温反应过夜，20000g下离心20min，分离产物，冻干得靶向基团修饰的油脂聚合物硬乳液纳微球，其平均粒径为97.2nm，span为0.281，置于4摄氏度保存。
将上述纳微颗粒复溶，采用pbs配置成1mg/ml的注射液。选择6-8周龄雌性balb/c小鼠，进行尾静脉注射。在注射6小时后，采用小动物成像仪(invivoimagesystem.kodak)观察注射cy7标记的纳微球的体内荧光分布，如图10所示，除了部分肝聚集之外，大部分油脂聚合物硬乳液纳微球都靶向到肿瘤部位，证明高效的肿瘤靶向性。
实施例13
修饰后油脂聚合物硬乳液纳微球作为疫苗佐剂评价测试
采用实施例1-6中方法制备油脂聚合物硬乳液纳微球，用电子天平准确称取2.0gplga(分子量为13万道尔顿)，2.0g角鲨烯，0.4g溴化二甲基双十八烷基铵，溶于10ml的乙醇与二氯甲烷(1/9)的混合溶液中，将溶液迅速倒入100ml水溶液(含有1.0wt.％的pva(醇解度为99％，粘度为5.0mpa·s)，在超声条件下分散(200w，3min，间隔时间5s)。25℃下搅拌过夜(磁力搅拌，转速为500rpm)，15000g下离心20min，弃去上清，向沉淀中加入5ml去离子水，超声分散，15000g下离心5min，弃去上清后，将沉淀冻干，保存于4℃。
将上述制得的油脂聚合物硬乳液纳微球复溶制得1mg/ml的溶液，分别与h1n1全病毒疫苗(全蛋白浓度为20μg/100μl)(序号1)，h5n1禽流感裂解疫苗(血凝素(ha)含量均为4.5μg/100μl)(序号3)，手足口病毒(ev71)重组疫苗(全蛋白浓度为10μg/100μl)(序号5)，人乳头病毒(hpv)亚单位疫苗(序号7)，抗黑色素瘤个性化短肽(muc1，序号9)以及抗艾滋病dna疫苗(序号11)和混合(纳微球与疫苗的混合体积比为1:1，室温混合1小时)，另取同样含量的疫苗作为对照(序号2,4,6,8,10,12)。对balb/c小鼠左腿肌肉注射后，两周后进行二次免疫，于28天眼眶取血，分离血清，并对血清中抗原特异性抗体igg水平进行间接式elisa检测，得到抗体滴度。35天处死小鼠，分离各小鼠脾细胞，将脾细胞于37摄氏度，5％二氧化碳无菌环境下培养24小时，离心脾细胞，取上清，利用elisa试剂盒对ifn-γ分泌水平进行检测。
结果如表8所示，与单纯抗原组相比，油脂聚合物硬乳液纳微球显著提升了h1n1全病毒疫苗，h5n1禽流感裂解疫苗，手足口病毒(ev71)重组疫苗，人乳头病毒(hpv)亚单位疫苗，以及抗艾滋病dna疫苗的抗原特异性抗体水平和ifn-γ分泌水平，并存在着显著性差异。证明了油脂聚合物硬乳液纳微球可以同时显著提升抗原的体液免疫和细胞免疫应答，在疫苗佐剂领域有着广阔的应用前景。
表8
实施例14
安全性评价实验：
1.血管刺激性试验
将实施例1-4制备的硬乳液纳微球分别于家兔耳静脉注射给药，每日一次，连续给药3天。结果:家兔耳静脉给药部位肉眼观察无明显变化；组织病理切片显微镜检显示距注射部位1cm处血管、5cm处血管内皮连续、完整，未见增生、肿胀；血管周围组织未见炎性细胞浸润及坏死；管腔内无血栓形成。显示本品对家兔耳静脉血管未见明显刺激作用。
2.溶血与凝聚试验
采用常规体外试管法(肉眼观察法)，将实施例1-4制备的硬乳液纳微球分别与2％红细胞混悬液混合，3小时内未见溶血与红细胞凝聚现象。
3.肌肉刺激性试验
将实施例1-4制备的硬乳液纳微球分别用于家兔股四头肌注射给药，每侧给药lml。48小时后取给药部位肉眼观察并作病理组织学检查。结果表明，本品对家兔股四头肌无刺激性。
对比例1
采用相同的膜材，相同生物相容性油脂与生物相容性壁材质量比，相同的atra装载率以不同的超声功率制备粒径分别为：8nm，20nm，0.8μm，和55μm的颗粒佐剂(如表9所示)。对比不同粒径对于颗粒佐剂在zeta电位(储存稳定性的度量)/atra包埋率/注射28天后血清igg抗体滴度以及注射28天后肠粘膜iga抗体滴度的影响。当颗粒佐剂粒径低于10nm-50μm时(表9中第二行粒径为8nm)，所得到的颗粒佐剂zeta电位较低，说明其更容易聚集，并且其atra包埋率、血清中igg滴度、肠粘膜iga滴度都出现明显降低。而当颗粒佐剂粒径高于优选的粒径范围10nm-50μm时(表9中最后一行粒径为55μm)，所得到的颗粒佐剂zeta电位下降，证明其储存稳定性不佳。与此同时，其atra包埋率、血清中igg滴度、肠粘膜iga滴度都有明显的减少现象。此对比例说明，优选的粒径范围为10nm-50μm，高于或者低于这个范围，都会使颗粒佐剂的zeta电位(稳定性)、atra包埋率和免疫效果均出现明显降低的趋势。
表9
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的硬乳液纳微球及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。