本发明涉及一种载双药纳米制剂，特别涉及一种改善肿瘤乏氧增强光动力治疗的载双药纳米制剂及其制备和应用。
背景技术：
癌症是威胁人类健康的首要原因之一，据国家癌症中心在《2017中国肿瘤登记年报》中发布了中国最新癌症数据，新发生癌症病例429万例，肿瘤相关死亡281万例，癌症防治不容乐观，未来一、二十年，癌症发病率还会持续走高。目前治疗癌症的方式包括手术治疗（针对早期肿瘤，具有较大复发风险）、化疗（细胞毒药物）、放疗（电离辐射）、光动力治疗（光敏剂）、生物疗法（单克隆抗体等）。在现有的治疗方式中，光动力疗法（photodynamictherapy,pdt）是上世纪七十年代末开始形成的一项肿瘤治疗新技术，已成为肿瘤治疗的一项常规手段。其具备巨大的应用潜力，受到了研究者的广泛关注。pdt的治疗基础是光动力作用，其发挥作用需要具同时备三个基本要素：光敏剂（photosensitizer）、激发光（light）与分子氧（oxygen）。pdt治疗肿瘤的基本原理是系统或局部给予的光敏剂通过一定的生物过程或制剂辅助使光敏剂在肿瘤组织的选择性滞留，在特定波长激发光的作用下，同时在分子氧存在的情况下，产生单线态氧（singletoxygen）及其它活性氧类物质（reactiveoxygenspecies，ros），由于肿瘤缺乏活性氧消耗系统，因此细胞中的dna、脂质、蛋白质等重要物质被氧化，造成细胞损伤，进一步导致肿瘤细胞坏死和凋亡；其次，pdt还能破坏肿瘤组织中的微血管，造成局部缺血缺氧进而导致细胞死亡；最后，pdt可诱导多种免疫细胞快速浸润至肿瘤局部、活化补体系统以及促使多种细胞因子/化学因子的产生和释放，最终启动机体免疫应答反应来杀伤肿瘤。正是由于光动力治疗需要光的激发，因此其具备极强的选择性、可控性。除此以外，还具有较好地重复性，创伤小，毒副作用小，可保护容貌及重要器官的优势，日渐成为一种颇具前景的肿瘤治疗手段。对于年龄大、体质差、合并其它器质性疾病等不能耐受或不愿接受手术、放疗、化疗的患者，pdt也是一种很好的替代治疗手段。
然而，在肿瘤微环境中，肿瘤细胞的疯狂增殖使细胞与间质血管的距离增加，导致其内部环境缺氧以及肿瘤间质内液压增大。这种含氧量的下降会导致光动力治疗效果显著降低，无法达到预期的治疗效果；而间质内压的增大会导致纳米载体扩散能力和渗透性降低，使得药物只滞留在肿瘤组织表面，杀伤肿瘤组织的能力大打折扣。因此，以改善肿瘤微环境缺氧为目的，以弥补研究者们已提出的解决方案的弊端，如直接递送氧气，但氧气运输至靶部位的效率较低；所制备的纳米粒尺寸较大致使其渗透性受限；递送催化剂产生氧气，但氧气产生效率有限、无机材料难降解等弊端。本发明上述问题构建了一种在肿瘤组织渗透性强且可效改善瘤内缺氧的新型纳米递送系统。
细胞耗氧率（oxygenconsumptionrate,ocr）是指细胞对氧气消耗的速率。降低细胞耗氧率可间接提高氧气含量。首先该方法可以更有效地改善肿瘤微环境缺氧状况；其次，由于降低了细胞耗氧水平，细胞处于类似“休眠模式”，降低了对于放疗的抵抗，可提高放疗的效果。阿托伐醌（atovaquone,ato）为fda批准的抗疟疾药物。已有研究表明其具有降低细胞耗氧率的作用，一定浓度下可完全消除肿瘤的缺氧区域。该药物主要通过作用于线粒体复合物ⅲ，切断细胞正常的呼吸链，即中断细胞的呼吸作用，从而达到降低细胞耗氧率的效果。维替泊芬（verteporfin,ver）为已经上市的光敏剂，目前用于眼部疾病如黄斑病的光动力治疗。肿瘤在生长增殖过程中，由于需要大量的营养物质，因此会自发形成新血管以达到满足自身需要的目的。而维替泊芬在血液中主要通过脂蛋白运输，新生血管富含脂蛋白受体，因此维替泊芬对于肿瘤组织内的新生血管具备一定的靶向性。联合降低细胞耗氧率药物阿托伐醌及光敏剂维替泊芬，可产生协同效应增强光动力治疗效果。
技术实现要素：
目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种改善肿瘤乏氧增强光动力治疗的载双药纳米制剂。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种载双药纳米制剂，其特征在于：所述纳米制剂的载体为两亲性聚合物，通过两亲性聚合物同时装载有耗氧抑制剂和光敏剂。
所述两亲性聚合物选自聚（乳酸-聚羟基乙酸）-聚乙二醇（plga-peg），聚乳酸-聚乙二醇（pla-peg），聚乙交酯-聚乙二醇（pga-peg），聚己内酯-聚乙二醇（pcl-peg），聚苯乙烯-b-聚甲基丙烯酸叔丁酯(ps-b-ptbma)，聚(乙烯基吡咯烷酮-b-甲基丙烯酸特丁酯)（p(nvp-b-tbma)），聚谷氨酸苄酯-聚氧化乙烯（pblg-peo），聚天冬氨酸苄酯-聚氧化乙烯（pbla-peo）、磷脂。此处的peg与peo为同一物质的不同形式，可替换。
作为优选方案，所述的载双药纳米制剂，其特征在于：两亲性聚合物中疏水片段的分子量范围为2000-50000，亲水片段的分子量范围为400-10000。
进一步的，所述耗氧抑制剂为双胍类药物或呼吸链抑制剂药物；双胍类药物包括阿托伐醌；苯乙双胍，二甲双胍，丁二胍。呼吸链抑制剂药物包括鱼藤酮，安密妥，杀粉蝶毒素，抗霉素a，氰化物，叠氮化物。
进一步的，光敏剂为二氢卟吩e6，血卟啉衍生物，二血卟啉醚，血卟啉单甲醚，间-四羟基苯基二氢卟酚，初卟啉锡，苯卟啉，德克萨卟啉，n-天门冬酰基二氢卟酚，金属酞菁类等具有光敏剂性质的化合物及光敏素ii，笨并卟啉衍生物单酸环a，维替泊芬，5-氨基酮戊酸，卟吩姆钠等光敏剂药物。
作为优选方案，所述纳米制剂中，耗氧抑制剂、光敏剂的载药量均在0.5-20%之间，纳米制剂的粒径大小为10-200nm。
本发明还提供所述的载双药纳米制剂的制备方法，如下：采用薄膜分散法，将耗氧抑制剂和光敏剂与两亲性聚合物共溶于有机溶剂中，水浴下旋转蒸发使耗氧抑制剂和光敏剂与两亲性聚合物贴壁形成有机相薄膜，加入水溶液，于30-60oc下超声30分钟，并于3000转/分钟离心除去杂质，即得。
进一步的，所述有机溶剂为四氢呋喃、乙腈、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、乙醇中的一种或几种的混合物。
进一步的，所述水溶液为葡萄糖溶液，生理盐水，磷酸盐缓冲液，醋酸盐缓冲液，氨-氯化铵缓冲液，汉克斯平衡盐溶液，硼酸盐缓冲液，巴比妥钠-盐酸缓冲液，三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，硫酸铵缓冲液，三乙醇胺缓冲液，氯化钠-枸橼酸钠缓冲液，盐酸三乙醇胺缓冲液。
本发明还要求所述的载双药纳米制剂在制备治疗肿瘤疾病药物中的应用。
有益效果：本发明提供的载双药纳米制剂，与现有技术相比，具有以下优点：
1、本发明创新性提出了一种通过降低肿瘤细胞耗氧率以改善肿瘤缺氧状况，减少肿瘤乏氧区域以提高光动力治疗的思路。由于光动力治疗的三大必需要素之一为氧气，而实体瘤内部的乏氧区域会造成光动力治疗“无效”的状况，通过降低处于缺氧区域细胞的耗氧率，相对升高细胞氧气含量，在光的激发下达到提高活性氧产生量的效果，最终达到提高光动力治疗杀伤肿瘤细胞，治疗肿瘤的目的。
2、本发明构建增强型光动力治疗递送系统，该共递送系统是使用生物相容性的两亲性共聚物通过薄膜分散法来包裹两种药物。首先基于纳米粒自身的实体瘤的高通透性和滞留效应（epr效应），可增强纳米粒在肿瘤部位的蓄积，提高纳米粒在肿瘤部位的含量；其次基于所制纳米粒小于50nm，增强了其在肿瘤组织内的渗透性，可提高两个药物在肿瘤组织内的分布；最后，阿托伐醌可降低细胞耗氧率，递送至肿瘤组织内部后，可通过相对提高肿瘤微环境氧气含量，改善肿瘤缺氧问题，从而增强光动力治疗效果。因此，该发明为肿瘤的光动力治疗提供实际可行、安全高效的药物组合方式，也为缺氧肿瘤组织的靶向治疗研究提供有价值的参考。
3、本发明涉及的药物均为fda批准或已上市的药物，药物安全有效。通过创新性的结合，开发了药物的新作用，最大化协同两种药物的治疗效果。在不带来其他副作用的前提下，有效提高了光动力治疗的效果。由前期结果可见，该组合方式产生明显的抑瘤效果，在一定范围内可完全消除肿瘤，具有潜在的临床应用价值。
附图说明
图1是本发明按照实施例1制备的载双药纳米粒的粒径表征，该制备方法所得的载双药纳米粒粒径在50纳米以内；
图2是本发明按照实施例2进行的纳米粒关于肿瘤球渗透性的表征；由表征结果，12小时即有很明显的向中心渗透，24小时渗透深度显著增加；
图3是本发明按照实施例3对载双药纳米粒的改善缺氧情况进行表征；以比较由氧气产生的活性氧量间接证明药物可改善乏氧细胞的氧气量，从而增强光敏剂对其的杀伤作用。结果中，绿色荧光代表活性氧，其颜色的深、浅及区域的大、小代表了该药物处理后的细胞光照后产生的活性氧的多、少；
图4是本发明按照实施例4进行的细胞存活率实验结果，细胞存活率的降低证明了该发明的双药协同作用；
图5是本发明按照实施例5进行的细胞存活率实验，由载双药纳米粒组细胞全部死亡而其他组未死亡或部分死亡证明了两药物的协同作用；
图6是本发明按照实施例6的体内药效学表征；
图7是本发明按照实施例7的治疗结果表征。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作更进一步的说明。
本发明是通过以下的技术方案实现的，具体步骤如下：
将耗氧抑制剂与光敏剂以1:1共溶于四氢呋喃中，加入溶解于四氢呋喃的plga-peg中（载药量为2.5%），40oc水浴旋蒸除去有机溶剂，使其形成薄膜，而后加入ph8.6的水溶液，40oc下超声使其形成纳米粒。3000转/分钟离心，除去未包裹的药物，即为目标纳米制剂。
上述薄膜分散法所制的载双药纳米制剂，测定其具体表征。
上述载双药纳米制剂在治疗乳腺癌上的应用。
实施例1
载双药纳米粒制备方案具体如下：称取药物维替泊芬2.5毫克，溶于1毫升四氢呋喃中；称取阿托伐醌2.5毫克，溶于1毫升四氢呋喃中；称取plga-peg200毫克，溶于2毫升四氢呋喃中。混合三种药液，并使用2毫升四氢呋喃润洗使转移完全。于40oc水浴旋蒸除去有机溶剂，使其贴壁形成薄膜。而后加入ph8.6的葡萄糖注射液2.5毫升，于40oc下超声使其形成纳米浊液。纳米浊液于3000转/分钟下离心3分钟，收集上清液即得。本实施例所制备的载双药纳米粒的激光动态光散射法测定结果如图1所示，纳米粒的粒径为37.8nm。本实施例中，说明书中所提到的共聚物均为两亲性高分子材料，与本实施例中plga-peg具有相同的性质，可作为载体材料替换使用；说明书中所提到的耗氧抑制剂，与本实施例中的阿托伐醌具有相似的药效，可作为呼吸抑制剂替换使用；说明书中所提到的光敏剂药物，与本实施例中的维替泊芬均为光敏剂，具有相似的光动力治疗效果，可替换使用。
实施例2
载双药纳米粒在肿瘤球的渗透情况表征。将肿瘤球转移至含有一定浓度制剂的培养液中，分别培养12、24小时。对于药物在肿瘤球的渗透深度进行表征。本实施例通过激光共聚焦拍摄结果如图2所示，由表征结果看出，12小时即有很明显的向中心渗透，24小时渗透深度显著增加。
实施例3
载双药纳米粒组及对照组在光照后对于增强细胞ros能力的表征。细胞分别在常氧及缺氧条件下给药摄取4小时，光照十10分钟。加入ros探针表征ros产生量。本实施例通过倒置荧光显微镜拍摄最终结果如图3所示，以比较由氧气产生的活性氧量间接证明药物可改善乏氧细胞的氧气量，从而增强光敏剂对其的杀伤作用。结果中，绿色荧光代表活性氧，其颜色的深、浅及区域的大、小代表了该药物处理后的细胞光照后产生的活性氧的多、少。
实施例4
载双药纳米粒组相对于对照组明显增强乏氧肿瘤细胞细胞毒性的表征。细胞于缺氧条件下培养后，继续于缺氧条件下给药摄取4小时。光照30分钟后，于常氧条件恢复24小时，对其最终存活细胞比率进行表征。本实施例通过细胞噻唑蓝（mtt）染色，测定吸光度值计算存活率，结果如图4所示。
实施例5
同实施例4处理细胞。光照后使用碘化丙啶/钙黄素am进行细胞染色。红色区域代表死细胞，绿色区域代表活细胞。本实施例使用倒置荧光显微镜拍摄结果如图5所示，由载双药纳米粒组细胞全部死亡而其他组未死亡或部分死亡证明了两种药物的协同作用。
实施例6
使用载双药纳米制剂及其对照制剂通过尾静脉给药处理荷瘤小鼠。6小时后光照20分钟。一个疗程共治疗4次，一个疗程期间对小鼠荷瘤大小变化进行表征。本实施例测定活体肿瘤大小结果如图6所示。
实施例7
同实施例6处理荷瘤小鼠。治疗一个疗程后取出瘤组织，对其大小及重量进行精确表征。本实施例测定取出的肿瘤大小及重量结果如图7所示，以治疗最终乳腺肿瘤的大小及重量表征治疗结果。
本实施例中使用两亲性嵌段聚合物plga-peg作为纳米粒载体共递送光敏剂维替泊芬与降低细胞耗氧率药物阿托伐醌，使其一方面由于epr效应聚集于肿瘤部位，另一方面由于较小的粒径可渗透进入肿瘤内部乏氧区域，实现药物改善内部缺氧的目的，从而增强光敏剂的对肿瘤细胞的全方位杀伤作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。