本发明涉及家禽疫病控制领域，具体涉及一种提高禽流感灭活疫苗免疫效果的疫苗佐剂。
背景技术：
：疫苗佐剂(adjuvant)是能够非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答、发挥辅助作用的一类物质。佐剂能够促进机体产生长期、高效的特异性免疫反应，提高机体保护能力，同时又能减少抗原的用量，降低疫苗的生产成本。疫苗佐剂种类较多，常用的有白油佐剂、氢氧化铝佐剂、蜂胶佐剂等，但目前家禽类灭活疫苗应用最广泛的疫苗佐剂为白油佐剂，虽然效果明显，但也有一些不可避免的缺点，一是配方中含有吐温、司班、硬脂酸铝等成份，应激较大，注射后蛋鸡产蛋下降、肉鸡减料明显；二是易导致局部副反应，如发炎、脓肿、肉芽肿等；三是比较粘稠，较难注射，费时费力。因此探寻新型高效的水性疫苗佐剂是家禽疫苗重要的研究方向。无花果学名ficuscaricalinn，属于桑科的榕属灌木或者落叶乔木，全株内有白色的乳汁，是人类栽培最早的古老果树树种之一，在我国种植数量庞大。无花果不仅果实口味甘美，营养价值很高，而且也要具有重要的医药价值。我国应用无花果入药医病，已有数百年历史。《本草纲目》载：无花果“味甘、平、无毒。治五痔、咽喉痛”。《中药大辞典》载，无花果“消肿解毒，健胃清肠。治肠炎、喉痛、疮疖疥癣”。现代医学证明，除了果实，无花果的叶中含有丰富的维生素、微量元素、氨基酸、多肽、黄酮、糖类、果胶、苯甲醛、补骨脂素、佛手苷内酯、β-香树脂醇和蛇麻脂醇、β-谷甾醇，棕榈酸、廿八烷、愈疮木酚、芸香苷等。赖淑英等研究结果表明无花果叶含有丰富的微量元素铁、锌、硒、锰、铜、铬、钴等，其中铁和锌的含量最高，锰具有抗癌作用、锌还具有提高免疫功能作用，且硒的浓度高于果实。黄酮类化合物具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种功效。苏卫国等研究表明无花果叶中所含的黄酮类化合物含量是0.64％，高于银杏叶所含的黄酮类化合物。研究也表明，无花果叶的水提物和醇提物能够抑制多种细菌和病毒的感染，且多项研究表明无花果多糖对机体非特异性免疫和特异性免疫均具有良好的提高效果。此外，无花果叶中的苯甲醛已经被证明有抗癌的活性；补骨脂素常用于抗癌、治疗白癜风和牛皮癣等；佛手柑内酯化合物具有抗炎、镇痛的药理作用。以上证据表明，无花果叶活性成份丰富多样，药理功效全面，在医药应用方面具有极大的开发潜力，但是目前为止，还未有将无花果叶提取物作为疫苗佐剂的研究。技术实现要素：本发明的主要目的就在于克服上述现有技术的不足，提供一种提高禽流感灭活疫苗免疫效果的疫苗佐剂及其制备方法，所述佐剂为无花果叶水加醇混合提取物，使用剂量为20-50mg/ml，用以代替白油佐剂；本发明的有益效果是：所提供的佐剂工艺简单、成本低、使用方便，作用效果好，无毒副反应，在畜牧业中的开发利用潜力巨大，具有广阔的应用前景。本发明的以下技术方案如下：一种注射用禽流感灭活疫苗免疫佐剂，所述的佐剂为无花果叶水加醇混合提取物，与疫苗配比使用后，佐剂的终浓度为20-50mg/ml。本发明所采用的无花果叶提取物作为疫苗佐剂可以有效提高机体的抗体水平、细胞因子分泌水平和淋巴细胞增殖能力等体液免疫和细胞免疫水平。与传统白油佐剂相比具有更好的免疫增强效果，且无毒副作用，易于注射。与同类多糖类水性佐剂相比，效果更佳。与禽流感疫苗抗原液配比灵活，且具有一定的灭活作用，制备的疫苗效果好、成本低、易注射，使用方便。除此之外，发明人还提供了该佐剂的制备方法如下：将新鲜或干燥的无花果叶置于提取罐中，加入6-10倍重量的水，浸泡2-4h后，升温至85℃-90℃浸提2-4h，提取液过滤并流入回收罐；再次向提取罐中加入6-10倍重量含30％-50％乙醇的水溶液，并加入整个溶液重量2％-5％的碳酸氢钠，调节ph值为8-10，升温至100℃浸提2-4h，提取液过滤并流入回收罐。二次提取的液体混合后，减压浓缩至十分之一体积，然后喷雾干燥成粉状固体。在比对了料液比、提取温度、提取溶剂、ph值、提取时间、干物质提取率、生产成本以及生产安全性能技术参数之后，最优选的提取工艺为：将干燥的无花果叶置于提取罐中，加入8倍重量的水，浸泡4h后，升温至90℃浸提3h，提取液过滤并流入回收罐；再次向提取罐中加入6倍体积含40％乙醇的水溶液，并加入碳酸氢钠调节ph值为10，升温至100℃浸提3h，提取液过滤并流入回收罐。二次提取的液体混合后，减压浓缩至十分之一体积，然后喷雾干燥成粉状固体。其中所述的提取方法采用设备为常用的中药提取罐、真空减压浓缩机、喷雾干燥机等，发明人在此不在赘述；与现有技术相比，本发明取得了如下的技术效果：1.本发明提供的禽流感疫苗佐剂原材料来源广泛、提取工艺简单、成本低、设备要求低、无毒副反应，有效解决了白油佐剂使用造成的应激大、副作用明显、工艺复杂、难注射、成本高等问题。2.本发明提供的提取技术是根据前人已鉴定的无花果叶有效成份种类和含量的特殊性，专门设计的水加醇混合提取法，在大量比对摸索料液比、提取温度、提取溶剂、ph值、提取时间、干物质提取率、生产成本以及生产安全性能技术参数之后得出的，分为两个关键步骤，一是在料液比1:6-10的前提下在85℃-90℃热水中浸提，该步骤主要将水溶性成份(多糖类、肽类、微量元素等)提取出；二是在ph值为8-10的低浓度乙醇水溶液中煎煮，可在保证生产安全性前提下，最大程度将其他酸性水溶性成份以及黄酮类、蒽醌类等有效成份提取出。这与之前报道的针对无花果叶在实验室条件下采用单纯的水提法或高浓度乙醇提取法均有较大改进。3.本发明提供的疫苗佐剂，具有显著增强机体体液免疫和细胞免疫的功能，从而增强动物抗病能力，提高疫苗的免疫效果。整体效果明显优于同类多糖类水佐剂。综上所述，本发明提供的注射用禽流感灭活疫苗免疫佐剂作用效果好，提取工艺简单、价格便宜、使用方便、无副反应，在畜禽养殖业中的开发利用潜力巨大，具有广阔的应用前景。具体实施方式下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定：实施例1佐剂制备按照本发明提供的无花果叶水+乙醇混合提取法，并参考已发表文献中的无花果叶水提法和醇提法以及针对多糖的水提醇沉法，制备不同的佐剂：佐剂1—无花果叶水+乙醇混合提取物：将干无花果叶置于提取罐中，加入8倍重量的水，浸泡4h后，升温至90℃浸提3h，提取液过滤并流入回收罐；再次向提取罐中加入6倍重量含40％乙醇的水溶液，并加入碳酸氢钠调节ph值为10，升温至100℃浸提3h，提取液过滤并流入回收罐。二次提取的液体混合后，减压浓缩至十分之一体积，然后喷雾干燥成粉状固体。固体物用无菌生理盐水配成100mg/ml溶液，备用。佐剂2—无花果叶水提取物：将干无花果叶置于提取罐中，加入8倍重量的水，浸泡4h后，升温至90℃浸提6h，提取液过滤并流入回收罐，提取液减压浓缩至十分之一体积，然后喷雾干燥成粉状固体。固体物用无菌生理盐水配成100mg/ml溶液，备用。佐剂3—无花果叶乙醇提取物：将干无花果叶置于提取罐中，加入8倍重量含95％乙醇的溶液，升温至60℃浸提6h，提取液过滤并流入回收罐，减压浓缩至十分之一体积，将膏状提取物取出，烘干成固体。固体物用少量无水乙醇溶解后，用无菌生理盐水配成100mg/ml，备用。佐剂4—无花果叶多糖：将干无花果叶置于提取罐中，加入8倍重量的水，浸泡4h后，升温至90℃浸提6h，提取液减压浓缩至十分之一体积，然后混入含有4倍体积的95％乙醇溶液中，沉淀多糖，过滤弃掉上清后，烘干至固体。固体物用无菌生理盐水配成100mg/ml溶液，备用。佐剂5—黄芪多糖：将干黄芪置于提取罐中，加入8倍重量的水，浸泡4h后，升温至90℃浸提6h，提取液减压浓缩至十分之一体积，然后混入含有4倍体积的95％乙醇溶液中，沉淀多糖，过滤弃掉上清后，烘干至固体。固体物用无菌生理盐水配成100mg/ml溶液，备用。佐剂6—白油佐剂：采用购买的商品化进口白油佐剂。实施例2疫苗制备h9n2亚型禽流感病毒抗原液制备：9日龄spf鸡胚接种h9n2亚型禽流感病毒种毒，72h后，收获鸡胚尿囊液，用血凝试验测定病毒效价，将病毒液加水稀释至血凝效价为29，加入质量比为10％的甘油混合均匀，然后加入质量比为0.2％的甲醛，37℃灭活48h，即为抗原液。疫苗1—5：水佐剂h9n2亚型禽流感灭活疫苗制备：分别向抗原液中添加实施例1中获得的五种水性佐剂，并对应佐剂编号，分别命名为疫苗1-疫苗5。于常温下用均质机在3000rpm条件下充分混合均匀10min，所述免疫佐剂与抗原液体积比为1:1，即每种疫苗里佐剂干物质的含量均为50mg/ml；疫苗6：白油佐剂h9n2亚型禽流感灭活疫苗制备：向白油佐剂中缓慢加入抗原液，边加边搅拌，于常温下用均质机在6000rpm条件下充分混合乳化30min，所述免疫佐剂与抗原液体积比为1:1。实施例3毒性检验选取15日龄健康商品肉鸡(体重0.5kg左右)140只，将鸡随机分为7组，每组20只。1-6组分别大剂量腿部肌肉注射实施例2中制备的6种疫苗，每只鸡每只腿注射2ml疫苗；7组为正常对照。注射后观察鸡只的临床症状，包括精神萎靡、食欲减退、扎堆、炸毛、下痢、死亡等，连续观察7天。观察结果如下表，结果显示无花果叶水加乙醇混合提取物和无花果叶醇提物作为佐剂制备的疫苗无任何副作用，可能是其中的黄酮类物质发挥抗炎作用，而大剂量注射时白油佐剂疫苗表现出明显的副作用。表1不同疫苗组大剂量接种副作用观察编号症状疫苗1无疫苗23只鸡接种部位轻微红肿疫苗3无疫苗44只鸡接种部位轻微红肿疫苗56只鸡接种部位轻微红肿疫苗68只鸡24h内精神不佳，食欲下降；12只鸡接种部位红肿实施例4免疫效果比较1试验设计按实施例1和2中的方法获得6种不同佐剂疫苗。选取70只健康海兰褐雏鸡，平均分成7组，每组10只。前6组鸡分别肌肉注射6种疫苗，1ml/只。第7组为正常对照组。分别在免疫后14、28、42d采血，用血凝(ha)与血凝抑制(hi)试验检测血清抗体效价，用elisa法检测血清中细胞因子的水平，用pi染色法检测血液淋巴细胞增殖率。所有数据用spss17.0软件进行duncan’s多重比较分析，数据为平均值±sd，p<0.05表示差异显著。2结果与分析2.1血清抗体效价比较各试验组于免疫后14、28、42d随机抽取3只鸡，翅下静脉采血1ml，分离血清，用血凝(ha)和血凝抑制(hi)试验检测抗体滴度，结果以log2表示。结果见表2，疫苗1、2、3、4组鸡新城疫血清抗体滴度在三个时间点均明显高于疫苗5、6组和对照组，尤其是在28d抗体滴度高1-2个滴度(p<0.05)，其中疫苗1组抗体效价最高。疫苗5和6组差异不显著。结果表明，疫苗1、2、3、4均能够显著提高疫苗接种诱导的抗体水平，其中疫苗1组免疫效果最优。表2不同疫苗组鸡新城疫血清抗体水平比较(log2)2.2外周血ifn-γ浓度比较每组于上述时间点随机选取3只鸡采血，离心分离血清备用。使用鸡ifn-γ的elisa试剂盒测定血清中各细胞因子的含量，用酶标仪测od450nm的吸光度，根据标准品的浓度及对应的od值计算出标准曲线的直线回归方程，再按照样品的od值在回归方程上计算出对应的样品浓度。具体方法根据试剂盒说明书进行。结果见表3，疫苗1-6组鸡血清ifn-γ浓度在三个时间点均高于对照组，于14d时疫苗1-5组显著高于对照组(p<0.05)，于28d时疫苗1-6组显著高于对照组(p<0.05)，于42d时疫苗1-3组显著高于4-6组(p<0.05)，表明佐剂1-3具有更好的提高血清ifn-γ浓度的作用，其中佐剂1组效果最佳。表3不同疫苗组外周血ifn-γ浓度比较(ng/l)2.3外周血淋巴细胞增殖率比较如上所述分离得到淋巴细胞，将其密度调整到1×106/ml，以100μl/孔接种于96孔培养板，用含10％胎牛血清的rpmi-1640培养基培养。每列前3孔加入25ulcona(20mg/ml)溶液，每列后3孔设为对照孔加25ulpbs，5％co2、37℃条件下孵育24h后每孔加10lmtt，孵育4h，弃掉培养液，每孔加100mldmso，酶标仪测od490nm的吸光度。淋巴细胞转化率(ltr)用下列公式计算：ltr＝(cona刺激均值－无cona刺激均值)/无cona刺激均值。结果见表4，疫苗1-6组鸡血清ifn-γ浓度在三个时间点均高于对照组，而于三个时间点疫苗1-4组均显著高于对照组(p<0.05)，且疫苗1组数据最高；疫苗5、6组仅在28d时显著高于对照组(p<0.05)。结果表明，佐剂1-4具有更好的提高外周血淋巴细胞增殖率的作用，其中佐剂1效果最佳。表4不同疫苗组外周血淋巴细胞增殖率比较(％)综上研究比较，佐剂1、2、3、4的免疫增强效果均优于佐剂5和6，即无论是无花果叶水提物、醇提物还是多糖，其免疫增强效果均好于黄芪多糖和白油佐剂，但是以无花果叶水+醇混合提取物的佐剂效果最佳。毒性试验结果表明，含有无花果叶醇提物的佐剂1和佐剂3具有更好的抗炎作用。从提取成本考虑，佐剂3为95％乙醇提取物，其提取成本较高、工艺复杂和安全性较差，而佐剂1同时具备良好的免疫提高效果和较低的提取成本，且工艺简单，适合大规模生产，无安全隐患，因此本发明优选佐剂1作为本发明最终产品。实施例5使用剂量比较根据实施例4的结果，本发明优选佐剂1作为疫苗佐剂。按照实施例2中的方法，制备佐剂1干物质含量分别为20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml四个浓度的h9n2亚型禽流感病毒灭活疫苗。采用实施例4中的方法进行免疫，用相同的方法检测免疫效果。结果显示，疫苗的免疫效果随着佐剂浓度增加而递增，其中干物质浓度为50mg/ml和60mg/ml时免疫效果最佳，且二者差异不显著。综合考虑生产成本，本发明最优的使用浓度为50mg/ml。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12