本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用spf鸡胚细胞生产黄热病减毒活疫苗的工艺。
背景技术：
：
黄热病是伊蚊传播的严重嗜内脏性及嗜神经性病毒性传染病，病死率很高，是非洲和南美洲许多国家非常关注的公共健康问题。在非洲，该病对33个国家的5.08亿人口构成严重威胁，大多发生在非洲亚撒哈拉贫困地区。在南美洲和非洲等流行区每年至少报告病例超过20万，死亡病例超过3万。我国虽不处于疫区，但是随着我国对外经济开放，每年往来于非洲、南美洲热带地区(劳务外出、公务访问、旅游探亲)的人员越来越多，黄热病的传播媒介-伊蚊分布很广，对黄热病病毒潜在危害越来越大。由于对黄热病没有针对性的治疗措施，疫苗接种是唯一有效的预防方法，因此对出国人员接种免疫预防是极为必要的，同时也要对黄热病病毒经回国人员的带入保持警惕，做好应对的准备。
我国目前国内生产黄热病疫苗。每年大约有三十万人份，主要用于出国人员接种。这些疫苗采用spf鸡胚卵黄囊接种，鸡胚组织培养，经研磨等过过程制成全胚粗制疫苗。由于杂质蛋白多，存在着不安全因素，有必要加以改进。
为了保证人用疫苗安全性，国家药监局对疫苗采用生产基质细胞有严格规定。二倍体细胞因来自人体正常组织，经过严格的检定，证明是一种最安全的细胞，但因来源有限，不能满足大批生产需要。vero细胞来自
非洲绿猴肾转化细胞，具有潜在的致瘤性，虽然who允许用于疫苗生产，但有严格的代次限制，国家也制定了严格的残留dna控制标准。而一般原代动物细胞，存在着外源因子污染。只有spf鸡胚细胞因为材料易得，外源因子污染少被国家药监局列为疫苗生产首选细胞。
本发明公开一种安全的黄热病疫苗生产工艺，可同样达到现有鸡胚生产黄热病减毒活疫苗who要求的疫苗效力和保护效果。本工艺疫苗杂质少，副反应小于传统生产工艺制造的疫苗，疫苗安全性更好。同时可大幅提高疫苗生产效率、降低成本。
技术实现要素：
本发明一种用鸡胚细胞黄热病减毒活疫苗的生产工艺。具体为：采用细胞工厂培养鸡胚细胞为病毒培养基质细胞，接种经在鸡胚细胞传代适应的17d减毒疫苗株毒种，通过培养，收集病毒液，再经过除菌、纯化、加入保护剂后冻干制备成品疫苗。
本发明涉及一种用鸡胚细胞培养17d毒株生产黄热减毒活疫苗生产工艺。采用细胞工厂培养鸡胚细胞作为病毒培养基质细胞，接种经鸡胚细胞传代适应的17d减毒疫苗株毒种，经过培养，收集病毒液，再经过滤除菌后，加入冻干保护剂，冻干制备成品疫苗。
在一个优选例中，本发明所用的17d减毒疫苗株毒种为世界卫生组织(who)提供的17d-204毒株(nibscode213-77)。鸡胚细胞用spf鸡胚制备。本发明所用的鸡胚细胞毒种为发明人经鸡胚细胞传代适应的毒种。毒种滴度按小鼠ld50法滴度不低于5.60ld50；蚀斑法滴定不低于5.8lgpfu/ml。
在另一个优选例中，本疫苗细胞培养方法为：
1).胰蛋白酶消化细胞浓度0.25％，ph为7.4～7.6。
2).鸡胚细胞培养液为含5％新生牛血清、0.3％水解乳蛋白、1％nahco3、2mm谷氨酰胺的mem培养基。
3).病毒.培养液为不含牛血清的dmem溶液，加入2％～3％nahco3,
ph7.4～7.6,同时补加0.5％人白蛋白。
4).鸡胚细胞培养采用细胞工厂作为培养载体，培养温度为37±0.1。
在另一个优选例中，疫苗制备采用方法：
1).病毒分种方法：采用细胞工厂培养鸡胚细胞。将消化后鸡胚细胞按2～8×105/cm2细胞数接种到细胞工厂，加入细胞培养液，37±0.1℃培养，待细胞成单层后接种鸡胚细胞毒种。
培养成单层的细胞，先倒去病毒培养液，按moi0.01～0.5接种病毒。接种病毒后的细胞置35℃～37℃4～6小时，使病毒与细胞充分接触吸附。然后倒去病毒液，用磷酸盐缓冲液(pbs)对细胞表面进行冲洗，最后加入ph7.4～7.6病毒培养液，送入35℃～37℃恒温室进行培养。
2)病毒混种方法为：消化后的细胞悬液按0.001～0.1moi接种病毒充分混合后，分装至细胞工厂，置35℃～37℃培养。
培养48小时后倒去病毒培养液，用磷酸盐缓冲液(pbs)对细胞表面进行冲洗，最后加入病毒培养液，ph7.4～7.6，送入35℃～37℃培养。
在另一个优选例中，两种方法病毒收获时间为自接种后培养72～96小时后开始收获病毒。收获的病毒液经1μm或0.6μm滤膜澄清后再经0.22μm除菌过滤即为原液，检定合格后加入冻干保护剂进行冻干制成疫苗。
在另一个优选例中，本专利疫苗保冻干护剂溶液的成分为：不含明胶的ph7.4～7.6dmem多糖溶液。
附图说明
图1.鸡胚细胞黄热病减毒活疫苗工艺流程图(混种)。
图2.鸡胚细胞黄热病减毒活疫苗工艺流程图(分种)。
图3.本发明的疫苗细胞培养方法的流程图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。本实施例仅用于对本发明的说明，不构成对本发明的限制。
本发明所用的17d减毒疫苗株毒种为世界卫生组织(who)提供的17d-204毒株(nibscode213-77)(图3)。鸡胚细胞用spf鸡胚制备。本发明所用的鸡胚细胞毒种为发明人经鸡胚细胞传代适应的毒种。毒种滴度按小鼠ld50法滴度不低于5.60ld50；蚀斑法滴定不低于5.8lgpfu/ml。
本疫苗细胞培养方法为：
1).胰蛋白酶消化细胞浓度0.25％，ph为7.4～7.6。
2).鸡胚细胞培养液为含5％新生牛血清、0.3％水解乳蛋白、1％nahco3、2mm谷氨酰胺的mem培养基。
3).病毒.培养液为不含牛血清的dmem溶液，加入2％～3％nahco3,
ph7.4～7.6,同时补加0.5％人白蛋白。
4).鸡胚细胞培养采用细胞工厂作为培养载体，培养温度为37±0.1。
疫苗制备采用方法：
1).病毒分种方法：
采用细胞工厂培养鸡胚细胞。将消化后鸡胚细胞按2～8×105/cm2细胞数接种到细胞工厂，加入细胞培养液，37±0.1℃培养，待细胞成单层后接种鸡胚细胞毒种。
培养成单层的细胞，先倒去病毒培养液，按moi0.01～0.5接种病毒。接种病毒后的细胞置35℃～37℃4～6小时，使病毒与细胞充分接触吸附。然后倒去病毒液，用磷酸盐缓冲液(pbs)对细胞表面进行冲洗，最后加入ph7.4～7.6病毒培养液，送入35℃～37℃恒温室进行培养。
2)病毒混种方法为：
消化后的细胞悬液按0.001～0.1moi接种病毒充分混合后，分装至细胞工厂，置35℃～37℃培养。
培养48小时后倒去病毒培养液，用磷酸盐缓冲液(pbs)对细胞表面进行冲洗，最后加入病毒培养液，ph7.4～7.6，送入35℃～37℃培养。
两种方法病毒收获时间为自接种后培养72～96小时后开始收获病毒。收获的病毒液经1μm或0.6μm滤膜澄清后再经0.22μm除菌过滤即为原液，检定合格后加入冻干保护剂进行冻干制成疫苗。
实施例1、鸡胚细胞消化
鸡胚细胞来自国产spf鸡胚，取正常发育的9-10日龄鸡胚，以无菌操作方法取出鸡胚，去除头和内脏，用pbs清洗三遍，用灭菌医用手术剪将其剪成2-3mm组织块，加入0.25％胰蛋白酶溶液消化20分种，中间10分钟轻轻摇动使胰蛋白酶与组织块充分接触。
消化终止时，倒去胰蛋白酶溶液。然后用吹打吸管对组织块按20、30、50、40吹打4次，力度由请到逐渐加重。每次捶打完后，按每胚30ml加入细胞培养液，即为细胞悬液。
实施例子2、鸡胚细胞在细胞工厂上培养和接种病毒
1)病毒分种方法为：
采用细胞工厂培养鸡胚细胞。将消化后鸡胚细胞按2～4×105/cm2细胞数接种到细胞工厂，加入细胞培养液，37±0.1℃培养，待细胞成单层后接种鸡胚细胞毒种。具体方法：
培养成单层的细胞，先倒去病毒培养液，按moi0.01～0.5接种病毒。接种病毒后的细胞置35℃～37℃4～6小时，使病毒与细胞充分接触吸附。然后倒去病毒液，用磷酸盐缓冲液(pbs)对细胞表面进行冲洗，最后加入ph7.4～7.6病毒培养液，送入35℃～37℃恒温室进行培养。
鸡胚细胞黄热病减毒活疫苗工艺流程图(混种)如图1。
2)病毒混种方法为：
消化后的细胞悬液按0.001～0.1moi与病毒充分混合后，按3～5×105/cm2分装至细胞工厂，置35℃～37℃培养。
培养48小时后倒去病毒培养液，用磷酸盐缓冲液(pbs)对细胞表面进行冲洗，最后加入病毒培养液，ph7.4～7.6，送入35℃～37℃培养。
以上细胞工厂中按每层200ml补加细胞生长液。
鸡胚细胞黄热病减毒活疫苗工艺流程图(分种)如图2。
实施例3、病毒收获
病毒接种72至96小时，当病变发展至+++～++++即可收获病毒。
实施例子4：毒种制备
以上面方法进行病毒连续传代制备17d黄热疫苗病毒种子，当滴度达到5.6lgpfu/ml可认为获得鸡胚细胞适应的17d病毒株，进行各项指标检定合格即为病毒种子。
种子批毒种的检定
主种子批应进行以下全面检定：
1)鉴别试验
采用蚀斑法进行鉴别试验。将病毒稀释到50～100pfu/0.4ml，与黄热病毒特异性免疫血清和非免疫血清等量混合，37±1℃水浴中和60分钟，置35±1℃培养6天，免疫血清组的蚀斑数比非免疫血清组的减少率应不低于80％。同时应设血清和细胞对照，均应为阴性；病毒对照病毒量应为50～100pfu/0.4ml，应为阳性。
2)病毒滴度
可采用蚀斑法或小鼠法进行病毒滴定。主种子批应同时采用蚀斑法和小鼠ld50法进行病毒滴定。
a.蚀斑法：
取毒种进行10倍稀释，再进行4倍系列稀释，取3～4个适宜稀释度接种vero细胞，置35±1℃培养6天，同时设细胞对照，蚀斑形成后计数蚀斑数，病毒滴度。应不低于5.8lgpfu/ml。
b.小鼠法：
取毒种进行10倍系列稀释，每个稀释度病毒液接种10～12g小鼠6只，每只脑内0.03ml，观察21天，3天内死亡者不计，(动物死亡数量应不得超过试验动物总数的20％)，计算ld50。病毒滴度应不低于5.50lgld50/ml。
3)无菌检查依法检查，应符合2015版《中国药典》规定。
4)支原体检查依法检查，应符合2015版《中国药典》规定。
5)病毒外源因子检查依法检查，应符合2015版《中国药典》规定。
6)外源性禽白血病病毒检测
将供试品接种spf鸡胚，经培养后采用酶联免疫法检查培养物，结果应为阴性。
7)外源性禽腺病毒检测
将供试品接种spf鸡胚肝细胞培养，分别用适宜的血清学方法检测培
养物的i型和iii型腺病毒，结果应为阴性。
8)基因序列分析
进细胞连续传代适应的病毒种子其基因序列与原鸡胚培养病毒种子一致。
9)猴体试验
主种子批进行猴体试验。应符合2015版《中国药典》规定。
工作种子批应至少进行1)～8)项检定合格。
新制备的种子批用于生产时，连续制备的前三批疫苗原液应进行病毒关键基因序列测定，测定结果应与主种子批保持一致。
10)毒种保存
种子批毒种应冻干后于-60℃以下保存。
实施例5、病毒收获
收获后的病毒经1μm或0.6μm滤膜过滤，用0.2μm滤膜除菌除去细胞碎片宿主蛋白，加入冻干保护剂即为原液，原液应置于-20℃保存。待并对滴度合格后及时冻干置2℃～8℃保存。
以本发明所述的制备方法，疫苗主要质量指标为：
毒成品滴度不低于4.5iu/ml/剂
疫苗免疫剂量：0.5ml/人
卵清蛋白含量：≤100ng/剂.
抗生素残留量：≤50ng/剂
牛血清残留量：≤50ng/剂
热原：≤5eu/剂
疫苗ph:7.2-8.0
冻干水分：≤3％
热稳定性:37℃放置2周后不低于4.5lgpfu/ml/剂,37℃放置2周后滴度下降不超过1.0lgpfu/ml。
无菌检查：符合2015年《中国药典》第三部标准，合格。
支原体检查：符合2015年《中国药典》第三部标准，合格。
异常毒性试验：符合2015年《中国药典》第三部标准，合格。
鉴别试验：合格。
应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。