一种具有抗衰老效果的干细胞因子精华液的制备方法与流程

本发明涉及生物产品制备领域，具体涉及一种具有抗衰老效果的干细胞因子精华液的制备方法。

背景技术：

皮肤指覆盖在机体外面的组织，是人体最大的器官，主要承担着保护身体、排汗、感觉冷热和压力等功能。皮肤覆盖全身，它使体内各种组织和器官免受物理性、机械性、化学性和病原微生物性的侵袭。随着时间的增长，皮肤会出现明显的老化现象。皮肤的老化分为内源性老化和外源性老化。内源性老化是指皮肤随年龄增长的自然老化，细胞的代谢和更新变慢，皮肤的表皮和真皮变薄，胶原纤维合成速度变慢，导致皮肤变白，出现细小皱纹、弹性下降、皮肤松弛等。外源性的老化因素主要是环境因素，导致皮肤粗糙、干燥、变厚，皮肤松弛和皱纹加深，皮肤颜色变暗，毛细血管扩张和色素斑形成。

常规的化妆品或者面膜主要以化学成分为主，再添加一些植物提取物或者深海提取物，只能解决皮肤暂时缺水的问题，无法从根本上解决皮肤老化的问题，因此研发有修复皮肤损伤和逆转皮肤衰老的生物美容产品是十分必要的。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种具有抗衰老效果的干细胞因子精华液的制备方法，以解决常规化妆品抗衰老效果不佳的问题。

为达到上述目的，本发明提供了一种具有抗衰老效果的干细胞因子精华液的制备方法，其包括以下步骤：

步骤1：制备与培养人脐带间充质干细胞，收集干细胞培养上清，经浓缩后得到浓缩液，进而将浓缩液冷冻干燥，制得干细胞因子冻干粉；

步骤2：按体积百分比计，将以下组分：0.1～1％的透明质酸，1～10％的甘油，0.1～1％的胶原蛋白，0.1～1％的茶多酚，余量为水，进行混合，制得溶媒；

步骤3：将溶媒加入到干细胞因子冻干粉中，充分溶解，制得干细胞因子精华液。

上述的具有抗衰老效果的干细胞因子精华液的制备方法，其中，采用无血清培养基培养人脐带间充质干细胞。

上述的具有抗衰老效果的干细胞因子精华液的制备方法，其中，所述无血清培养基为StemPro MSC SFM无血清培养基。

上述的具有抗衰老效果的干细胞因子精华液的制备方法，其中，所述人脐带间充质干细胞在低氧培养条件下培养；所述低氧培养条件为2-12％的氧气。

上述的具有抗衰老效果的干细胞因子精华液的制备方法，其中，选择P3～P5代的人脐带间充质干细胞进行干细胞培养上清的收集。

上述的具有抗衰老效果的干细胞因子精华液的制备方法，其中，收集已培养3～4天的干细胞培养上清进行浓缩。

上述的具有抗衰老效果的干细胞因子精华液的制备方法，其中，在浓缩液中加入冻干保护剂；所述冻干保护剂包括：海藻糖、甘露醇、右旋糖酐和人血清白蛋白。

上述的具有抗衰老效果的干细胞因子精华液的制备方法，其中，加入冻干保护剂后，海藻糖在浓缩液中的体积百分比为1～10％，甘露醇在浓缩液中的体积百分比为1～10％，右旋糖酐在浓缩液中的体积百分比为1～5％，人血清白蛋白在浓缩液中的体积百分比为0.1～1％。

上述的具有抗衰老效果的干细胞因子精华液的制备方法，其中，在干细胞培养上清浓缩过程中，收集分子量在3～30KD的细胞因子，得到浓缩液。

上述的具有抗衰老效果的干细胞因子精华液的制备方法，其中，按体积份计，将1-6份的溶媒加入到由1份浓缩液冷冻干燥得到的干细胞因子冻干粉中，制得干细胞因子精华液。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明优选人脐带间充质干细胞作为活性细胞因子的来源。间充质干细胞的上清中富含表皮生长因子、血管内皮生长因子和干细胞因子等活性因子成分，这些因子能够促进体内干细胞的生长和增殖，促进皮肤内的成纤维细胞等分泌更多的胶原蛋白。这些生物效应具有传统化妆品不可比拟的优势，能够显著缓解的皮肤的老化。

(2)本发明采用无血清培养基培养脐带干细胞，安全可靠，不会像传统的血清培养法可能会引起免疫排斥反应。

(3)本发明采用低氧技术培养脐带干细胞，低氧的培养条件更接近细胞的体内生理环境，能让干细胞分泌更多的生物活性因子。

(4)本发明首先将干细胞因子制成干粉，可以在低温条件下保存很长时间；使用精华液之前，可将溶媒和干粉混匀使用，解决了干细胞因子化妆品不能长时间保存的问题。

(5)本发明制备的精华液具有显著的美容与抗衰老效果，使用过本精华液的使用者，皱纹消失，弹力改善，肤色变白，毛孔缩小，皮肤变得光滑水嫩，持续效果好。

附图说明

图1为一受试者使用本发明干细胞因子精华液的前后面部变化图；

图2为另一受试者使用本发明干细胞因子精华液的前后面部变化图；

图3为又一受试者使用本发明干细胞因子精华液的前后面部变化图。

具体实施方式

以下结合附图通过具体实施例对本发明作进一步的描述，这些实施例仅用于说明本发明，并不是对本发明保护范围的限制。

本发明提供了一种具有抗衰老效果的干细胞因子精华液的制备方法，其包括以下步骤：

步骤1：制备与培养人脐带间充质干细胞，收集干细胞培养上清，经浓缩后得到浓缩液，进而将浓缩液冷冻干燥，制得干细胞因子冻干粉；

步骤2：按体积百分比计，将以下组分：0.1～1％的透明质酸，1～10％的甘油，0.1～1％的胶原蛋白，0.1～1％的茶多酚，余量为水，进行混合，制得溶媒；

步骤3：将溶媒加入到干细胞因子冻干粉中，充分溶解，制得干细胞因子精华液。

其中，透明质酸是广泛存在于皮肤和其他组织的生物大分子，主要功能是保湿和润滑，为细胞增殖与分化提供合适的场所，直接促进细胞生长、分化、重建与修复等，在医疗美容中，透明质酸被应用于填充凹陷、除皱和塑形。甘油可以吸收水分，保持皮肤的湿性，防止皮肤出现皱纹。胶原蛋白是重要的细胞外基质成分，可以促进皮肤活性细胞生成，增加皮肤紧致度，还可以修复肌肤凹陷损伤。茶多酚是水溶性物质，能清除面部的油腻，收敛毛孔，抗皮肤老化，减少日光中的紫外线辐射对皮肤的损伤等功效，同时对脂质氧化产生抑制，减轻色素形成。溶媒的作用是溶解干细胞因子干粉，促进皮肤对干细胞因子的吸收，保持皮肤的湿度，收紧毛孔，紧致皮肤和使皮肤出现光泽。

在一具体实施例中，优选采用无血清培养基培养人脐带间充质干细胞，安全可靠，不会像传统的血清培养法可能会引起免疫排斥反应。更优选地，所述无血清培养基为ThermoFisher Scientific公司的StemPro MSC SFM无血清培养基。进一步地，可以向所述无血清培养基里面添加ThermoFisher Scientific公司的MEM Vitamin Solution、MEM Amino Acids Solution和MEM Non-Essential Amino Acids Solution。

在一具体实施例中，所述人脐带间充质干细胞在低氧培养条件下培养；所述低氧培养条件为2-12％的氧气。更优选地，氧气浓度为5％。

在一具体实施例中，选择P3～P5代的人脐带间充质干细胞进行干细胞培养上清的收集。

在一具体实施例中，收集已培养3～4天的干细胞培养上清进行浓缩。

在一具体实施例中，在浓缩液中加入冻干保护剂；所述冻干保护剂包括：海藻糖、甘露醇、右旋糖酐和人血清白蛋白。优选地，加入冻干保护剂后，海藻糖在浓缩液中的体积百分比为1～10％，甘露醇在浓缩液中的体积百分比为1～10％，右旋糖酐在浓缩液中的体积百分比为1～5％，人血清白蛋白在浓缩液中的体积百分比为0.1～1％。

在一具体实施例中，在干细胞培养上清浓缩过程中，收集分子量在3～30KD的细胞因子，得到浓缩液。这些细胞因子包括表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、干细胞因子、神经生长因子和胰岛素样生长因子等。

在一具体实施例中，按体积份计，将1-6份的溶媒加入到由1份浓缩液冷冻干燥得到的干细胞因子冻干粉中，制得干细胞因子精华液。

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是成体干细胞的一种，它对细胞的修复与再生作用已经被初步证实。其在创面愈合中的关键作用包括2个方面：一是直接参与损伤组织的重建，主要包括细胞的增殖、迁移、归巢、分化等；二是以调节性功能细胞的方式，间接参与组织损伤的修复重建，主要涉及干细胞激活后以旁分泌形式分泌大量生物活性分子，促进其他修复细胞的功能。间充质干细胞在培养的过程中会分泌各种生长因子，例如干细胞因子(SCF)，表皮生长因子(EGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，转化生长因子(TGF-β)，神经生长因子(NGF)，胰岛素样生长因子(IGF)等。干细胞分泌的生长因子能够促进各种细胞的增殖和分化，产生新的细胞，代替衰老和损伤的细胞；促进细胞合成和分泌细胞外基质成分，增加皮肤的亲水性，改善皮肤的微环境，提供良好的营养环境，维持一定的皮肤脂肪，减少皮肤皱纹。此外，干细胞的分泌因子中还含有各种细胞外基质蛋白，能够改善皮肤肤质，特别是对皮肤瘢痕和疤痕具有很好修复作用。

间充质干细胞在体内的生长环境是处于低氧的微环境，而且不同组织的氧浓度都是有区别的。然而，目前的干细胞培养多数是在21％氧气浓度的条件下进行，与组织中低氧环境相差较大。研究证明，低氧环境能够促进间充质干细胞的增殖与迁移，增加生物活性因子的表达水平，提高干细胞抗凋亡的能力，和保持干细胞的干性。

本发明的制备工艺使用低氧和无血清培养基的培养条件培养脐带间充质干细胞，对干细胞分泌的细胞因子进行加工和处理，得到一种具有抗衰老功能的干细胞因子精华液产品。

一、制备脐带间充质干细胞

1.用无血清DMEM培养基配制50μg/mL Liberase和1μg/mL透明质酸酶的混合酶溶液。

2.把健康人的脐带组织放入超净台中，用生理盐水清洗脐带数次，洗去脐带和血管中的血液后，用手术剪将脐带外壁剪开，用镊子小心夹取沃顿胶组织至培养皿中，向培养皿中按照组织体积：消化液体积为1:3～5的比例加入消化酶溶液。

3.进一步用手术剪把培养皿中的组织剪成大小为1mm³左右的组织块。把培养皿的组织块和消化液一起转移到50毫升的离心管中，把离心管固定在37℃的恒温水浴摇床中，以100rpm的转速消化45分钟。消化结束后，静置离心管2～3分钟左右，让残余的组织块沉淀到离心管的底部，用移液管吸走细胞悬液至另一个新的离心管中。在离心管中加入与细胞悬液等体积的含有10％FBS的DMEM培养基，用1000rpm的速度离心5分钟。离心后，弃掉上清，用生理盐水重悬细胞，先后用孔径为100微米和40微米的过滤网过滤细胞悬液。离心，弃掉上清，再用无血清培养基洗细胞2次。

4.用无血清培养基重悬细胞，细胞计数，将细胞转移至培养瓶中，放入细胞培养箱中培养。细胞培养72小时以后，吸走上清，用生理盐水洗细胞一次，往培养瓶中加入新鲜的无血清培养基。之后根据细胞的实际生长情况，每2～3天给细胞换液或者传代。

5.用TrypLE^TMSelect消化液消化P1、P3和P5代的脐带间充质干细胞，用抗体标记脐带干细胞，流式细胞仪上机检测干细胞标志物的表达水平。检测结果表明，间充质干细胞阳性标志物CD73、CD90和CD105的阳性比例基本超过97％，间充质干细胞阴性标志物CD31、CD34、CD45和HLA-DR的阳性比例基本小于2％。

二、制备干细胞培养上清

本发明优选使用P3～P5代的脐带干细胞作为干细胞因子的来源。用新鲜的无血清培养基重悬脐带干细胞，接种到细胞培养瓶中。细胞在37℃有5％二氧化碳和5％氧气浓度的潮湿环境下培养，每3～4天半换液一次，收集废弃的细胞培养上清，储存在4℃冰柜中，用于后续冻干粉的制备。

三、制备干细胞因子冻干粉

在4℃下以3000rpm的速度离心收集到的细胞培养上清10分钟，把上清转移到切向流超滤系统中超滤浓缩，收集3～30KD之间的蛋白质因子；用0.22μm过滤网过滤浓缩的上清。往干细胞培养上清浓缩液中加入保护剂成分：海藻糖、甘露醇、右旋糖酐和人血清白蛋白；加入保护剂后，海藻糖在干细胞培养上清浓缩液中的比例是1～10％，甘露醇在上清浓缩液中的比例是1～10％，右旋糖酐的比例是1～5％，人血清白蛋白的比例是0.1～1％。把混合保护剂的干细胞培养上清浓缩液分装到西林瓶中，每支西林瓶中加入2～3毫升浓缩液。

然后把装有浓缩液的西林瓶放到入-80度超低温冰箱冷冻处理24h，再用冷冻干燥机冻干，真空度1Pa，冷阱温度-70度，抽真空时间为32h。

四、制备溶媒

将透明质酸、甘油、胶原蛋白、茶多酚和超纯水在超净台内按比例配制，放入恒温振荡器，震荡5～10min，振荡均匀后进行分瓶包装，每瓶10ml；溶媒中含有0.1～1％的透明质酸，1～10％的甘油，0.1～1％的胶原蛋白和0.1～1％的茶多酚，余量为超纯水。在该技术方案中，透明质酸的比例是0.6％，甘油的比例是5％，胶原蛋白的比例是0.5％，茶多酚的比例是0.2％。

五、制备干细胞因子精华液

在1瓶冻干粉中加入1瓶溶媒，充分溶解，制成具有抗衰老功能的干细胞因子精华液。

本发明选择8名面部有皱纹、色斑、瘢痕或者皮肤松弛的受试者，每天早晚洁面后，将干细胞因子精华液涂抹在面部，连续使用2个月。

总体上，8名受试者在连续使用精华液2个月以后，面部的皱纹变淡变浅，色斑变淡或者消失，瘢痕得到明显的填充，皮肤变得细腻光滑。图1、2和3是三名女性受试者使用本发明精华液的前后变化图；可见，其面部皱纹消失，瘢痕不见，皮肤变白和变得光滑。

综上所述，本发明利用低氧培养技术培养脐带间充质干细胞，收集干细胞培养上清，利用低温超浓缩技术获得高纯度和高活性的干细胞因子浓缩液，低温冻干制备成干粉；溶媒中含有多种能够滋养皮肤、保湿和溶解细胞因子干粉的成分，并保持细胞因子的活性。本发明制备的干细胞因子精华液含有表皮生长因子、血管内皮生长因子、肝细胞生长因子和神经生长因子等多种细胞活性因子成分，可以滋养皮肤，促进皮肤修复和再生，抗皱，和除色斑等，在医疗美容领域有良好的应用价值。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。