本发明涉及组织工程与再生医学领域，具体地说，涉及的是一种高捕获缓释高活性骨形成蛋白的高分子微球，适用于骨组织工程领域。
背景技术：
骨形成蛋白是骨修复过程中极为重要的功能蛋白，亲水性骨形成蛋白能够促进新骨形成，在研究和临床中都被广泛应用。如果是以简单形式存在于体内，其生物活性会被显著降低。
高分子微球被广泛探索作为蛋白载药系统。高分子微球作为蛋白载药系统具有许多优势：能够以微创或者注射方式将药物递送到指定部位，无需外科手术或者切除，能够保护蛋白免于降解，药物释放延缓，可以脉冲释放蛋白药物。
通常，优良的生物相容性高分子微球负载蛋白递送系统具有以下三个特征：(1)微球具有高的蛋白药物负载效率；(2)蛋白药物可控释放；(3)蛋白药物释放后具有高的生物活性。以前的研究中，大多数蛋白(如胰岛素和骨形成蛋白)都是通过乳化溶剂挥发法直接加入到微球中。负载效率、蛋白质释放和生物活性维持主要受材料(高分子和蛋白质)性质、配方参数和产品性质影响。常用高分子有聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚己内酯、聚酯、及他们的混合物等。很难将亲水性蛋白负载到相对疏水性高分子微球，且会导致高的蛋白质初始释放。另外，存在于酸性高分子中或者许多高分子降解后产生的酸性基团会导致蛋白药物的活性降低或者失活。这些局限性限制了生物相容性高分子微球负载蛋白递送系统在临床上的应用。
许多工作尝试去获得优良的生物相容性高分子微球负载蛋白递送系统，如当前科研中的热点之一开发新高分子或者修饰高分子，该方法由于耗时较长且常常得不到所有满意的性质，而且由于这些新高分子或者修饰高分子在临床转化前需要被政府部门批准而增加了其临床转化的难度。因此科学家们也探索了基于政府部门批准的高分子如plga等的其它方法，如制备参数的优化、表面活性剂和聚电解质等添加剂的加入等。然而，制备参数的优化并不能显著提高生物相容性高分子微球负载蛋白递送系统的性质；表面活性剂如peg和peo的使用尽管能调节蛋白质的释放，但是降低了蛋白质负载效率；聚电解质可能导致潜在的毒性。因此需要研发新的生物相容性高分子微球负载蛋白递送系统，以尽快促进临床转化。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供高效负载、能缓慢释放、并能维持骨诱导因子高活性的高分子复合微球。该方法步骤简单，制作方便，可用于骨组织工程领域。
本发明提供一种高效负载、能缓慢释放、并能维持骨诱导因子高活性的高分子复合微球。该复合微球具有以下特点：
(1)该复合微球具有粒径均匀，粒径在100～300μm范围内；
(2)该复合微球的外观有很细小的微孔结构，微孔的直径在0.02-1μm之间；
(3)该复合微球可负载的骨形成蛋白，其骨形成蛋白的包封率大于70％，同时，骨形成蛋白是以骨形成蛋白和磷脂的复合物的形式出现在复合微球的表面和内部；
(4)该复合微球负载的骨形成蛋白可从复合微球内部及表面缓慢释放到外部环境；
(5)该复合微球可诱导骨细胞或者潜在的可分化的细胞(如干细胞)成骨分化。
实现该复合微球的技术方案是：
(1)磷脂-骨形成蛋白混合物的制备：将磷脂与骨形成蛋白按照不同的质量比例共同分散在含有5％(v/v)醋酸的二甲基亚砜，在30℃搅拌，后冻干处理。其中，磷脂与骨形成蛋白质量比例为2:1～8:1，30℃搅拌时长不低于12小时。
(2)复合微球的制备：将上述的冻干的磷脂-骨形成蛋白混合物与高分子材料按照不同的质量比例共同加入有机溶剂中常温溶解，形成有机溶液。再将其滴加到聚乙烯醇水溶液中，采用磁力搅拌子以低速搅拌，待有机溶剂挥发后得到固化的微球；将微球离心5min，再用超纯水重新悬浮，反复3次洗去多余的聚乙烯醇，再将微球冷冻干燥处理。其中，磷脂-骨形成蛋白混合物与高分子材料的质量比例是骨形成蛋白与高分子材料的质量比例为依据。
附图说明：
附图1：高分子复合微球的形貌和元素分析。(a)和(c)：plga微球的扫描电子显微镜图，(b)和(d)：plga/6sl/bmp-2微球的扫描电子显微镜图，(e)plga微球的能谱，(f)plga/6sl/bmp-2微球的能谱。c、o、n和p分别指碳、氧、氮和磷元素。plga：聚乳酸-羟基乙酸共聚物；sl：磷脂；bmp-2：骨形成蛋白。
附图2：高分子复合微球的体外bmp-2释放曲线。plga：聚乳酸-羟基乙酸共聚物；sl：磷脂；bmp-2：骨形成蛋白。
附图3：高分子复合微球的细胞粘附和增殖分析。plga：聚乳酸-羟基乙酸共聚物；sl：磷脂；bmp-2：骨形成蛋白。
附图4：高分子复合微球释放的bmp-2生物活性分析。6种基因标志物：胶原类型1(col1)，基质gla蛋白(mgp)，runt相关转录因子2(runx2)，骨钙蛋白(ocn)，骨桥蛋白(opn)，骨保护素(opg)。
附图5：高分子复合微球蛋白高效负载、可控释放、高生物活性的建议机理。
具体实施方式
实施例1
磷脂-骨形成蛋白混合物的制备
分别按照4:1,5:1和6:1的质量称取磷脂与骨形成蛋白，并分散于含有5％(v/v)的醋酸和95％(v/v)的二甲亚砜的有机溶剂中，30℃条件下磁力搅拌24小时。然后将其冻干，除去残余的有机溶剂，磷脂-骨形成蛋白混合物需保存在4℃环境下。所制备的样品分别命名为4sl/bmp-2，5sl/bmp-2及6sl/bmp-2。
所制备的磷脂-骨形成蛋白混合物须具有良好的疏水性，可在有机溶剂中分散。将所制备的磷脂-骨形成蛋白混合物分别称取相同的质量加入到同样体积的水合二氯甲烷中，25℃环境下搅拌24h。将其6000rpm离心10min，取上清。使用bmp-2定量试剂盒进行上清中bmp-2的检测。
如表所示，结果表明，磷脂-骨形成蛋白混合物中的骨形成蛋白在二氯甲烷中的溶解度高于2mg/ml。
表1.不同的磷脂与骨形成蛋白的混合物在水合二氯甲烷中的溶解度对比。
实施例2
复合微球的制备
称取0.25g的plga和含有0.01gbmp-2的磷脂与骨形成蛋白的混合物(4sl/bmp-2)溶解在5ml二氯甲烷中，形成plga和磷脂与骨形成蛋白的混合物分散在二氯甲烷的有机相，其中bmp-2与plga为1:25(w/w)。称取0.05g聚乙烯醇解于100ml水中，高温溶解1小时，形成浓度为0.5％(w/v)聚乙烯醇的水相。取出上述有机相置于干燥的小烧杯中，立刻将乳化液均匀速度滴加到100ml的水相中。采用磁力搅拌子以300rpm的速度进行搅拌，待有机溶剂挥发后得到固化的微球；将微球离心5min，再用超纯水重新悬浮，反复3次洗去多余的聚乙烯醇，再将微球冷冻干燥处理。
经扫描电子显微镜观察(附图1)，复合微球的平均粒径为101μm～150μm之间，其外观有很细小的微孔结构，微孔的直径在0.02-1μm之间，其bmp-2的包封率在70～76％。
实施例3
复合微球的制备
称取0.25g的plga和含有0.01gbmp-2的磷脂与骨形成蛋白的混合物(5sl/bmp-2)溶解在5ml二氯甲烷中，形成plga和磷脂与骨形成蛋白的混合物分散在二氯甲烷的有机相，其中bmp-2与plga为1:25(w/w)。称取0.2g聚乙烯醇解于100ml水中，高温溶解1小时，形成水相。取出上述有机相置于干燥的小烧杯中，立刻将乳化液均匀速度滴加到100ml的水相中。采用磁力搅拌子以250rpm的速度进行搅拌，待有机溶剂挥发后得到固化的微球；将微球离心5min，再用超纯水重新悬浮，反复3次洗去多余的聚乙烯醇，再将微球冷冻干燥处理。
经扫描电子显微镜观察(附图1)，复合微球的平均粒径为110μm～178μm之间，其外观有很细小的微孔结构，微孔的直径在0.02-1μm之间，其bmp-2的包封率在75～82％。
实施例4
复合微球的制备
称取0.25g的plga和含有0.01gbmp-2的磷脂与骨形成蛋白的混合物(6sl/bmp-2)溶解在5ml二氯甲烷中，形成plga和磷脂与骨形成蛋白的混合物分散在二氯甲烷的有机相，其中bmp-2与plga为1:25(w/w)。称取0.1g聚乙烯醇解于100ml水中，高温溶解1小时，形成浓度为1％(w/v)聚乙烯醇的水相。取出上述有机相置于干燥的小烧杯中，立刻将乳化液均匀速度滴加到100ml的水相中。采用磁力搅拌子以100rpm的速度进行搅拌，待有机溶剂挥发后得到固化的微球；将微球离心5min，再用超纯水重新悬浮，反复3次洗去多余的聚乙烯醇，再将微球冷冻干燥处理。
经扫描电子显微镜观察(附图1)，复合微球的平均粒径为180μm～220μm之间，其外观有很细小的微孔结构，微孔的直径在0.02-1μm之间，其bmp-2的包封率在77～91％。
实施例5
对照组微球的制备
对照组plga微球：称取0.25g的plga溶解在5ml二氯甲烷中，形成有机相。称取0.1g聚乙烯醇解于100ml水中，高温溶解1小时，形成浓度为1％(w/v)聚乙烯醇的水相。取出上述有机相置于干燥的小烧杯中，立刻将乳化液均匀速度滴加到100ml的水相中。采用磁力搅拌子以250rpm的速度进行搅拌，待有机溶剂挥发后得到固化的微球；将plga微球离心5min，再用超纯水重新悬浮，反复3次洗去多余的聚乙烯醇，再将微球冷冻干燥处理。
对照组plga/bmp-2微球：称取0.25g的plga和含有0.01g纯的bmp-2的溶解在5ml二氯甲烷中，形成plga和骨形成蛋白的混合物分散在二氯甲烷的有机相，其中bmp-2与plga为1:25(w/w)。称取0.1g聚乙烯醇解于100ml水中，高温溶解1小时，形成浓度为1％(w/v)聚乙烯醇的水相。取出上述有机相置于干燥的小烧杯中，立刻将乳化液均匀速度滴加到100ml的水相中。采用磁力搅拌子以250rpm的速度进行搅拌，待有机溶剂挥发后得到固化的微球；将微球离心5min，再用超纯水重新悬浮，反复3次洗去多余的聚乙烯醇，再将微球冷冻干燥处理。
经扫描电子显微镜观察，对照组plga微球和对照组plga/bmp-2微球的平均粒径分别为120～170μm和150～190μm之间。其外观光滑，没有明显的微孔结构，不同于实施例2～4中复合微球的表面。对照组plga/bmp-2微球bmp-2的包封率在22％～28％。
实施例6
复合微球的体外缓释能力
将上述实施例2～实施例4样品复合微球进行体外缓释能力测试(附图2)，以实施例5的plga/bmp-2微球为对照组。
复合微球的bmp-2的释放曲线测试使用的缓释液为含有0.1％(w/v)的胎牛血清的pbs(ph＝7.4)缓冲液。将每10mg的上述的实施例2～实施例4样品浸泡在300μl的上述缓释液中，并置于37℃条件下进行50rpm摇晃，持续30天。所收集的bmp-2的浓度采用bmp-2elisa试剂盒检测。
如图2所示，复合微球的bmp-2的释放曲线显示，累计释放率在第1天释放20％-25％，在第10天释放30％-60％，在第30天释放40％-70％。而对照组plga/bmp-2微球在第1天释放超过50％，第2天超过80％；第2天后，释放率维持在85～89％。
实施例7
复合微球的细胞粘附能力
将上述实施例2～实施例4样品进行体外细胞粘附及细胞增殖测试(附图3a)。细胞选用典型的成骨细胞或可成骨分化的细胞。
10mg复合微球使用75％乙醇灭菌1h，pbs离心清洗三次，加入人成骨样细胞系oct-1混悬液，37℃5％co2培养箱中培养。孵育6小时候测量细胞粘附能力。复合微球使用40μm孔径蓝色细胞筛网收集，pbs清洗三次，加入胰蛋白酶和二胺四乙酸消化复合微球上粘附的细胞，计数。则细胞粘附效率通过以下公式计算：
细胞粘附效率(％)＝(nattached/ntotal)×100％
此处nattached，ntotal分别是粘附的细胞数和种植的细胞数。每个数据来自6个平行样品。
结果表明，细胞在复合微球上的粘附率大约50％,细胞在对照组微球的粘附率小于40％。
实施例8
复合微球的细胞增殖能力
细胞增殖能力是通过cck-8定量分析，并采用激光共聚焦显微镜及电子扫描显微镜观察细胞数量，分布及细胞在微球上的生长形态(附图3b-d)。
在设计的时间点(1天,7天和15天)，弃去细胞培养液，加入含有0.2mlcck-8的2mldmem培养液，37℃5％co2培养箱中孵育2h。100微升上清液转移到96孔板中，酶标仪测定在450nm处的吸光度。结果表明，复合微球的细胞活性大于对照组微球的细胞活性；且随着培养时间的增长，复合微球的细胞活性优势，越来越大。
细胞数量和分布使用激光共聚焦显微镜进行染色观察，细胞形状和数量使用扫描电子显微镜进行观察。结果表明，随着培养时间的增长，复合微球和对照组微球上的细胞数量都有所增加，但复合微球的增长趋势更加明显。
细胞在微球上的生长形态使用电子扫描显微镜观察，结果表明，细胞能在复合微球表面生长，且形成大量的细胞群落，完全覆盖微球表面。
实施例9
复合微球的细胞成骨分化能力
细胞成骨分化能力采用碱性磷酸酶(alp)和成骨分化基因标记物q-pcr测试(附图4)。
在设计的时间点(1天,7天和15天)，通过离心(800rpm，5min)收集孵育有细胞的微球，pbs清洗3次。混悬在0.1％tritonx-100溶液中10min。随后离心收集上清液，然后利用alp活性检测试剂盒和蛋白检测试剂盒根据厂商测试方案测定alp活性和总蛋白含量。每个数据来自6个平行样品。实验结果见附图4a。结果表明，随着培养时间的增长，复合微球和对照组微球上的细胞alp含量都有所增加，但复合微球的增长趋势更加明显。在培养7天后，复合微球的alp含量明显大于对照组微球。
在15天时，成骨基因表达水平通过q-pcr进行测定。分析了6种基因标志物：胶原类型1(col1)，基质gla蛋白(mgp)，runt相关转录因子2(runx2)，骨钙蛋白(ocn)，骨桥蛋白(opn)，骨保护素(opg)。每个数据来自6个平行样品。实验结果见附图4b-g。复合微球相在所有的6种基因标记物中，除了骨钙化抑制剂基质gla蛋白基因(mgp)是低于对照组微球，其余的5种成骨分化促进的基因标记物均为高于对照组微球。说明，复合微球相对传统的对照组微球，有更好的成骨分化作用。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例做了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。