本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有肿瘤引发靶向能力的复合纳米药物载体系统及其制备方法。
背景技术：
在对癌症的研究中，人们想寻找一种方式，能够定向的治疗癌症组织，实现靶向治疗的效果。肿瘤靶向治疗技术按治疗原理可分为生物性靶向治疗、化学性靶向治疗、物理性靶向治疗三大类。其中，化学靶向治疗因其原理透彻，操作简单，效果优良被广泛研究。
为此，美国科学家hignchi和zaffaroni于上个世纪60年代提出了药物载体(drugdeliverysystems，ddss)的概念。各种各样的载体被大量研究，从最开始的简单微胶囊、囊泡、脂质体到后来的有机金属框架以及无机介孔材料，其核心思想是将药物装载在百纳米尺寸的载体中之后，通过纳米尺寸的“阀门”或者聚合物进行封堵，使药物能在正常生理环境下尽可能的实现零释放，随着血液运输到在癌组织附近，由于细胞过度增殖导致环境下与正常组织差异较大，如ph低于正常组织，还原性高于正常组织，温度明显高于体温以及co2浓度明显增高,以及酶的种类和含量均有所变化,最明显的是细胞通透性增强，即epr效应，根据这些差别，设计的药物载体通常具有癌细胞靶向刺激响应。
作为抗癌药物载体系统，最多的是以脂质体、胶束为代表的有机/高分子载体。但是，有机/高分子载体载药量低、稳定性不佳等缺点限制了其进一步的发展。所以我们需要开发新的载体来更好的构建载药系统。
从2007年开始，自从介孔硅(msn)被首次报道以来，介孔硅因其大的比表面积，良好的孔结构，合适的纳米尺寸以及其尺寸可调，具有良好的生物相容性，容易得到百纳米尺寸的载体从而被广泛研究。形状、尺寸、孔隙大小在一定范围内都可以较好的控制。同时，msn表面含有较多si-oh，可以比较容易的对msn进行修饰，使msn表面接枝上其他功能基团，如-cooh、-nh2，通过功能团的引入很容易的将纳米尺寸的“阀门”包裹在msn表面，其大的比表面积及孔隙体积可以装载大量药物、良好的表面改性能力使其具有修饰各种功能基团的潜力、较之纯有机/高分子载体有着更好的化学稳定性。其百纳米级的尺寸满足“被动靶向”的需求；在到达癌组织后，在癌组织epr效应下，“阀门”打开，药物突释，起到靶向治疗效果，且可与金属纳米粒子结合以实现诊疗一体。
常用的“阀门”有传统的金属纳米粒子、脂质体、聚合物、蛋白质、天然多糖、dna和超分子等。其中超分子环糊精由于无毒害、生物相容性好、易于修饰、稳定、价格低廉易得被广泛研究应用于生物材料。由7个葡萄糖单元组成的beta-环糊精(β-cd)分子呈现截锥形结构，并且均外缘亲水而内腔疏水，使得环糊精分子能够通过疏水相互作用力、主客体分子间的尺寸匹配作用、氢键及范德华力等包络各种适当大小的客体分子，将环糊精进行修饰可很好的作为msn刺激响应性的“阀门”。
环糊精/介孔硅药物载体在药物控释方面的研究取得了一定进展，同时也存在许多问题：(1)对在环糊精/介孔硅药物载体体系中的释放行为、释放过程机理、药物释放动力学缺乏深入研究。大部分药物研究使用的为模拟药物，其结果具有不准确性和盲目性。(2)环糊精/介孔硅药物载体体系处于研发阶段，大多数研究为材料生物相容性和降解性能以及药物释放速率的研究。没有一个良好、公认的评价体系系统全面的分析、测试指标作为指导；(3)环糊精/介孔硅药物载体体系的研究属于生物工程，该研究受客观条件和伦理道德的束缚，临床试验在短时间内很难进行，载体药物控释止步于体外试验和动物试验，这些结果不能完全、真实的反应人体试验的情况，所以给评价环糊精/介孔硅药物载体体系带来了很多不准确性。
技术实现要素：
本发明提供一种具有肿瘤引发靶向能力的复合纳米药物载体系统及其制备方法，旨在一定程度上克服现有技术的不足。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种具有肿瘤引发靶向能力的复合纳米药物载体系统的制备方法，其包括如下步骤：
s1、制备包含模板十六烷基三甲基溴化铵的介孔硅纳米粒子(ctab@msn)；
s2、制备氨基功能化的介孔硅纳米粒子(msn-nh2)；
s3、将d-葡萄糖酸溶液调节ph至5-6之间，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，冰水浴活化后，加入氨基功能化的介孔硅纳米粒子，室温下反应12-36小时后，水和甲醇清洗，真空干燥后即得d-葡萄糖酸接枝的介孔硅纳米粒子(msn-d-c6h12o6)；
s4、将s2中得到的d-葡萄糖酸接枝的介孔硅纳米粒子溶解在dmso中，加入2,4,6-三甲氧基苯甲醛和对甲苯磺酸，在75-85℃反应36-96小时，用去离子水清洗后冻干后即得苯甲醛修饰的介孔硅纳米粒子(msn-o-o-a)；
s5、制备氨基功能化的β-环糊精(β-cd-nh2)；
s6、将s4中得到的苯甲醛修饰的介孔硅纳米粒子分散在磷酸缓冲盐溶液中，加入抗肿瘤药物反应后，加入氨基功能化的β-环糊精冰水浴中反应，用磷酸缓冲盐溶液和水清洗反应产物后烘干，即得到载药后的msn-a-cd-nh2(药物@msn-a-cd-nh2)；
s7、制备醛基化的聚乙二醇(mpeg-cho)；
s8、将s6中产物和s7中产物分散在磷酸缓冲盐溶液中，室温反应12-48小时后，磷酸缓冲盐溶液和水洗涤烘干，即得所述具备肿瘤引发靶向能力的复合纳米药物载体系统(药物@msn-a-cd-peg)。
具体的，s1中所述的包含模板十六烷基三甲基溴化铵的介孔硅纳米粒子的制备方法如下：先将氢氧化钠与十六烷基三甲基溴化铵溶解在二次水中并升温至80℃，然后将正硅酸乙酯缓慢滴加至体系中，滴完后继续搅拌2小时产生白色沉淀物，反应结束后将产物离心出来并用二次水和甲醇洗涤多次，真空干燥后即得到包含模板十六烷基三甲基溴化铵的介孔硅纳米粒子。如若需去除模板，需将上述产物在包含有浓盐酸的甲醇中回流48小时，然后用二次水和甲醇多次洗涤，真空干燥后即得除去模板的介孔硅纳米粒子。
具体的，s2中氨基功能化的介孔硅纳米粒子的制备方法如下：先将包含模板十六烷基三甲基溴化铵的介孔硅纳米粒子分散在甲醇中，再加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷室温反应24小时，甲醇充分洗涤离心后真空干燥即得到包含模板十六烷基三甲基溴化铵的氨基功能化介孔纳米硅粒子；为了去除模板，需将上述产物在包含有浓盐酸的甲醇中回流48小时，然后用二次水和甲醇多次洗涤，真空干燥后即得氨基功能化的介孔硅纳米粒子。
具体的，s5中所述氨基功能化的β-环糊精的制备是分两步，环糊精酰氯化(ots化)和氨基化。合成p-甲苯磺酰基-β-环糊精的步骤如下：将β-环糊精悬浮于浓度为0.4mol/lnaoh溶液中，在0℃冰水浴下缓慢加入对甲苯磺酰氯,搅拌45min后将沉淀过滤，滤液用稀盐酸滴定，在ph约为8时出现沉淀，调至ph＝5.98,浑浊液至于冰箱冷藏过夜，次日抽滤将沉淀用80℃去离子水重结晶再抽滤，产物在80℃下真空干燥。将p-甲苯磺酰基-β-环糊精氨基化的步骤如下：将上述酰氯化产物溶解在无水乙二胺中，在80℃下通入n2回流24h后，用丙酮沉淀一天后用有机漏斗过滤再用丙酮沉淀重复2次共沉淀三次后真空干燥即得。
具体的，s7中所述醛基化的聚乙二醇的制备方法如下：将4-甲酰苯甲酸溶解在二氯甲烷中，加入二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶室温活化反应24小时，后加入干燥的聚乙二醇室温反应24小时，过滤得到澄清溶液，溶液用饱和食盐水萃取，有机层加入无水硫酸钠除水，然后将除水后的溶液滴入冷的乙醚中得到白色固体抽滤后真空干燥即得。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以有如下进一步的具体化。
具体的，所述介孔硅纳米粒子粒径为100-300纳米。
具体的，所述抗肿瘤药物为阿霉素、喜树碱或紫杉醇。
具体的，s3中d-葡萄糖酸与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl)的摩尔比优选1:1.5，d-葡萄糖酸与n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的摩尔比优选1:1.5。
具体的，s4中反应温度优选80℃。
具体的，步骤s6中，msn-o-o-a和抗肿瘤药物的投料质量比为2:1-10:1，优选4:1。msn-o-o-a和β-cd-nh2的投料质量比优选1:1。msn-o-o-a和抗肿瘤药物的反应优选在ph为8.0的磷酸缓冲盐溶液(pbs)中进行，反应条件优选避光40℃下反应24小时。
具体的，s7中聚乙二醇的重均分子量为1500-2000。
具体的，步骤s8中，药物@msn-a-cd-nh2和mpeg-cho的投料质量比为1:4-1:1，优选1:2。
具体的，s8中优选将药物@msn-a-cd-nh2和mpeg-cho分散在ph为8.0的磷酸缓冲盐溶液中，室温反应12-48小时后，用ph为7.4的磷酸缓冲盐溶液洗3次，水洗1次，50℃下烘干。
本发明还提供一种具备肿瘤引发靶向能力的复合纳米药物载体系统，其通过上述方法制备得到。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
第一、相对于其他非晶硅材料，选用百纳米尺寸的msn具有优良生物相容性、较高比表面积与孔体积、可调的介孔尺寸、胶体稳定性以及功能化简易性等优越的结构性质，药物装载量高，以msn为主体的多功能刺激响应型纳米载药系统具有很好的“被动靶向”的能力。
第二、将苯甲醛封端的聚乙二醇(peg)通过ph敏感的亚胺键接枝在β-环糊精(β-cd)表面，由于peg的动态保护，可以使药物载体在正常的血液循环中起到“隐形”作用，可以使药物系统在癌组织部位“被动靶向”富集。载体到达癌组织后，在癌细胞外弱酸性环境(ph≈6.5)下腙键断开，包覆在载体表面的peg脱落，从而使载体带正电，促进细胞摄取。
第三、通过环氧脂键将2,4,6-三甲氧基苯环连接在msn的表面，再选用β-环糊精(β-cd-nh2)为“阀门”材料，通过环糊精与苯环主客体作用，将β-环糊精封盖在msn的表面，方便易行，效率高。环氧脂键具有ph敏感性，在弱酸环境下(ph≈5.0)，容易断裂，体内正常ph环境(ph≈7.4))不足以使环氧脂键断裂，进而保证药物不会被提前释放。当载体进入细胞后，在细胞内酸性环境(ph≈5.0)下环氧脂键断裂，包裹在载体表面的β-cd脱落，从而释放药物。
第四、采用双重ph敏感的机制以实现逐级的酸响应，能更好的实现对癌症靶向控释治疗，并将“肿瘤引发靶向”的策略引入msn药物载体系统中，构建一种新型的药物载体系统。
通过这一系列的设计，可以构建一种具备“肿瘤引发靶向”能力、基于peg/β-cd/msn的复合纳米药物载体系统，相比传统的msn载体，该系统具备更加高效的癌细胞内靶向给药能力，可以有效提高药物利用率并降低其毒副作用。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的介孔硅纳米粒子msn的透射电镜图。
图2为本发明实施例1制得的介孔硅纳米粒子msn的x射线衍射图。
图3为本发明实施例1制得的dox@msn-a-cd-peg的透射电镜图。
图4为发明实施例1制得的dox@msn-a-cd-peg的体外释药曲线。
图5为发明实施例1制得的dox@msn-a-cd-peg的体外脱peg保护性能测试曲线。
图6a为实施例1制备的空白载体msn-a-cd-peg的细胞毒性图；图6b为dox@msn-a-cd-peg在不同ph、不同dox浓度条件下与人类宫颈癌(hela)细胞共培养后hela细胞的存活率柱状图。
图7为实施例1制得的dox@msn-a-cd-peg的细胞流式图。
图8为实施例1制备dox@msn-a-cd-peg过程中各步产物的热重曲线；
图9为实施例1制备dox@msn-a-cd-peg过程中各步产物的红外光谱图。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明提供的技术方案作进一步的详细说明，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
以下实施例中用到的药品若无特别说明则均为市售产品，用到的方法若无特别说明均为常规方法。
实施例1
一种具备肿瘤引发靶向能力的复合纳米药物载体系统的制备及其性能研究，其通过如下方法制备得到：
s1.制备mcm-41型介孔硅纳米粒子(msn)
先将0.28g氢氧化钠与1g十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶解在480ml二次水中并升温至80℃，然后将5ml正硅酸乙酯(teos)缓慢滴加至体系中，滴完后继续搅拌2h产生白色沉淀物。反应结束后将产物离心(9500r/min×10min)出来并用二次水和甲醇多次洗涤，50℃真空干燥后便得到包含模板ctab的msn(ctab@msn)。如若需去除模板ctab，需将得到的0.5gctab@msn在包含有9ml浓盐酸的160ml甲醇中回流48h，然后用二次水和甲醇多次洗涤离心，50℃真空干燥后得到msn，其透射电镜图及x射线衍射图分别如图1和图2所示，由图1可见msn具有介孔结构，由图2可知其小角射线衍射图谱具有三个特征衍射峰，分别对应(100)、(110)和(200)晶面的布拉格衍射峰，其孔道呈六方型排列。
s2.制备氨基功能化msn(msn-nh2)
先将1.0gctab@msn分散在110ml甲醇中，再加入5ml3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane,aptes)室温反应24h，甲醇充分洗涤离心后在50℃下真空干燥24h便可得到ctab@msn-nh2。类似的，为了去除模板ctab，需将得到的0.8gctab@msn-nh2在包含有9ml浓盐酸的160ml甲醇中回流48h，然后用二次水和甲醇多次洗涤，50℃真空干燥24h后得到msn-nh2。
s3.制备d-葡萄糖酸接枝的msn(msn-d-c6h12o6)
2.0g的d-葡萄糖溶液用ph＝7.4的pbs调节ph至5-6之间，加入2.87g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl)和1.7262gn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，冰水浴活化24h后，加入1.0gmsn-nh2室温下反应24h后，二次水洗两次，甲醇洗两次后，50℃下真空干燥24h后得到msn-d-c6h12o6。
s4.制备修饰苯甲醛的msn(msn-o-o-a)
将1.0gmsn-d-c6h12o6溶解在30mldmso中，加入1.21g2,4,6-三甲氧基苯甲醛和0.202g对甲苯磺酸，在80℃下反应72h后用去离子水清洗数次后冻干得到修饰上苯甲醛的介孔硅(msn-o-o-a)。
s5.制备氨基功能化的β-环糊精(β-cd-nh2)
β-cd-nh2的制备是分两步，环糊精酰氯化(ots化)和氨基化。合成p-甲苯磺酰基-β-环糊精的步骤如下：将β-环糊精称取25g悬浮于300ml浓度为0.4mol/lnaoh溶液中。在0℃冰水浴下缓慢加入18g对甲苯磺酰氯,搅拌45min后将沉淀过滤，滤液用稀盐酸滴定，在ph约为8时出现沉淀，调至ph＝5.98,浑浊液至于冰箱冷藏过夜，次日抽滤将沉淀用80℃去离子水重结晶再抽滤，产物在80℃下真空干燥30h。将p-甲苯磺酰基-β-环糊精氨基化的步骤如下：将10g上述酰氯化产物溶解在60ml无水乙二胺中，在80℃下通入n2回流24h后，用丙酮沉淀一天后用有机漏斗过滤再用丙酮沉淀重复2次共沉淀三次后真空干燥48h得到β-cd-nh2。
s6.制备β-cd-nh2封装的载药阿霉素(dox)后的msn-o-o-a(dox@msn-a-cd-nh2)
将0.200gmsn-o-o-a分散在100mlph＝8.0的pbs缓冲溶液中，加入50mg阿霉素(dox)避光40℃下反应24h，在加入0.200gβ-cd-nh2冰水浴中再反应24h后，ph＝7.4pbs洗3次，水洗1次，,50℃下烘干20h，即得到载药后的dox@msn-a-cd-nh2。
s7.制备醛基化的peg(mpeg-cho)
6.0g的4-甲酰苯甲酸溶解在300ml二氯甲烷中加入8.4g二环己基碳二亚胺(dcc)、0.64g4-二甲氨基吡啶(dmap)室温活化反应一天；后加入10.0g干燥的mpeg(mw＝1900da,5.2mmol)室温反应24h，过滤得到澄清溶液，溶液用饱和食盐水萃取(100ml×6)，有机层加入无水硫酸钠除水，然后将溶液滴入400ml冷的乙醚中得到白色固体抽滤后在40℃下真空干燥20h，即得到mpeg-cho。计算醛基接枝率为96％。
s8.制备药物载体msn-a-cd-nh2接枝mpeg保护层(dox@msn-a-cd-peg)
将0.200gdox@msn-a-cd-nh2和0.400gmpeg-cho充分分散在60mlph＝8.0的pbs中，室温反应24h后用ph＝7.4的pbs洗3次，水洗1次，50℃下烘干20h，得到接枝mpeg保护层的dox@msn-a-cd-peg，即本发明所述的具备肿瘤引发靶向能力的复合纳米药物载体系统。
实施例2
一种具备肿瘤引发靶向能力的复合纳米药物载体系统的制备及其性能研究，其通过如下方法制备得到：
msn、msn-nh2、β-cd-nh2和mpeg-cho的制备(即s1、s2、s5和s7)同实施例1。
s3.制备d-葡萄糖酸接枝的msn(msn-d-c6h12o6)
4.0g的d-葡萄糖溶液用ph＝7.4的pbs调节ph至5-6之间，加入5.75g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl)和3.45gn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，冰水浴活化24h后，加入1.5gmsn-nh2室温下反应24h后，二次水洗两次，甲醇洗两次后，50℃下真空干燥24h后得到msn-d-c6h12o6。
s4.制备修饰苯甲醛的msn(msn-o-o-a)
将1.0gmsn-d-c6h12o6溶解在30mldmso中，加入1.85g2,4,6-三甲氧基苯甲醛和0.3g对甲苯磺酸，在80℃下反应72h后用去离子水清洗数次后冻干得到修饰上苯甲醛的介孔硅(msn-o-o-a)。
s6.制备β-cd-nh2封装的载药喜树碱(cpt)后的msn-o-o-a(dox@msn-a-cd-nh2)
将0.400gmsn-o-o-a分散在100mlph＝8.0的pbs缓冲溶液中，加入50mg喜树碱(cpt)避光40℃下反应24h，在加入0.400gβ-cd-nh2冰水浴中再反应24h后，ph＝7.4pbs洗3次，水洗1次，,50℃下烘干20h，即得到载药后的cpt@msn-a-cd-nh2。
s8.制备药物载体msn-a-cd-nh2接枝mpeg保护层(cpt@msn-a-cd-peg)
将0.400gcpt@msn-a-cd-nh2和0.400gmpeg-cho充分分散在60mlph＝8.0的pbs中，室温反应24h后用ph＝7.4的pbs洗3次，水洗1次，50℃下烘干20h，得到接枝mpeg保护层的cpt@msn-a-cd-peg，即本发明所述的具备肿瘤引发靶向能力的复合纳米药物载体系统。
实施例3
一种具备肿瘤引发靶向能力的复合纳米药物载体系统的制备及其性能研究，其通过如下方法制备得到：
msn、msn-nh2、β-cd-nh2和mpeg-cho的制备(即s1、s2、s5和s7)同实施例1。
s3.制备d-葡萄糖酸接枝的msn(msn-d-c6h12o6)
2.0g的d-葡萄糖溶液用ph＝7.4的pbs调节ph至5-6之间，加入2.5g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl)和1.75gn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，冰水浴活化24h后，加入1.2gmsn-nh2室温下反应24h后，二次水洗两次，甲醇洗两次后，50℃下真空干燥24h后得到msn-d-c6h12o6。
s4.制备修饰苯甲醛的msn(msn-o-o-a)
将2.0gmsn-d-c6h12o6溶解在60mldmso中，加入2.5g2,4,6-三甲氧基苯甲醛和0.4g对甲苯磺酸，在80℃下反应72h后用去离子水清洗数次后冻干得到修饰上苯甲醛的介孔硅(msn-o-o-a)。
s6.制备β-cd-nh2封装的载药阿霉素(dox)后的msn-o-o-a(dox@msn-a-cd-nh2)
将0.200gmsn-o-o-a分散在100mlph＝8.0的pbs缓冲溶液中，加入100mg阿霉素(dox)避光40℃下反应24h，在加入0.200gβ-cd-nh2冰水浴中再反应24h后，ph＝7.4pbs洗3次，水洗1次，,50℃下烘干20h，即得到载药后的dox@msn-a-cd-nh2。
s8.制备药物载体msn-a-cd-nh2接枝mpeg保护层(dox@msn-a-cd-peg)
将0.100gdox@msn-a-cd-nh2和0.400gmpeg-cho充分分散在60mlph＝8.0的pbs中，室温反应24h后用ph＝7.4的pbs洗3次，水洗1次，50℃下烘干20h，得到接枝mpeg保护层的dox@msn-a-cd-peg，即本发明所述的具备肿瘤引发靶向能力的复合纳米药物载体系统。
测试例
以实施例1制备的具备肿瘤引发靶向能力的复合纳米药物载体系统dox@msn-a-cd-peg为测试对象，分别测试了其透射电镜图(图3所示)、体外不同ph下的释药曲线(图4所示)、体外不同ph下脱peg保护的情况(图5所示)以及体外细胞实验(图6所示)。
体外释药测试条件如下：
在测试体外药物释放之前，首先对dox@msn-a-cd-peg的载药量lc和包封率ee进行测定。将纳米粒子溶解在hf(体积分数40％)溶液中，通过紫外分光光度计测定溶液的吸光度a来计算出lc和ee，首先记录波长在493nm处的吸光度a，通过dox在hf中的溶解后得到dox浓度与吸光度的标准曲线，通过公式换算的到lc和ee的计算计算公式如下：
体外药物释放实验在不同的ph＝7.4、ph＝6.5的pbs缓冲溶液和ph＝5.0的abs缓冲溶液中进行，首先将5mgdox@msn-a-cd-peg超声均匀分散在5ml去离子水中，用移液枪将分散液小心地装入14000分子量的透析袋，然后快速地浸入到装有35ml不同ph的溶液中，放在在37℃恒温摇床震荡120h。设定时间间隔(30min，1h，2h，4h，8h，12h，24h，36h，48h，72h，96h，120h)从其中分别取出4mlpbs/abs溶液，然后对应的补加4mlpbs/abs溶液使得离心管内溶液体积保持恒定。测定每一个时间间隔取出液的吸光度，记录493nm处溶液的吸光度，并用dox在hf中的标准曲线计算出其浓度。
mpeg保护层脱落行为测试条件如下：
分别称取1.0mgdox@msn-a-cd-peg加入到不同ph值(7.4和6.5)的pbs缓冲溶液溶液中，载体粒子在37℃恒温摇床震荡24h。最终载体粒子离心并用去离子水清洗三次，冻干。取少量载体粒子分散在蒸馏水中，由zeta电位测试表征。
细胞毒性测试条件如下：
通过mtt法，测定药物载体材料的体外细胞毒性，纯载体纳米粒子细胞毒性：将hela细胞以5.0×104cells/well的浓度种入96孔板中，每个孔板中加入100μl的dmem培养基(含10％fbs)。在37℃且5％co2条件下的培养箱中培养24h后，将每个孔板中的培养液换成100μl新鲜培养基，将细胞与设定浓度梯度的纯载体粒子msn-a-cd-peg在新鲜培养基中共培养48h。培养结束后，将培养基中换为200μl新鲜的dmem培养基和20μlmtt溶液(5mg/mlpbs)。继续培养4h后，将mtt溶液小心地移除，补加200μldmso至孔中，培养基托盘在室温下震荡摇晃，混和均匀。在酶标仪上记录(model550,bio-rad,usa)每个孔在570nm的吸光度，细胞存活率计算公式如下：
其中od570(对比)是未加入纳米粒子msn-a-cd-peg时测定的吸光值，od570(载体)是加入纳米粒子msn-a-cd-peg后测得的吸光值。
纳米粒子dox@msn-a-cd-peg在不同ph值培养液的细胞毒性试验：将hela细胞以5.0×104cells/well的浓度种入96孔板中，每个孔板中加入100μl的dmem培养基(含10％fbs)。在培养基中培养24h后，培养基中的一部分孔板换成100μl新鲜的培养液(ph7.4)，剩下的孔板换成100μl新鲜的培养(ph6.5)，新鲜的培养液中两种不同ph(7.4和6.5)都包含有dox@msn-a-cd-peg，纯dox在ph7.4的新鲜培养液。在培养基中培养48h后，所有孔板中的培养液换新鲜的，用mtt来判断细胞活性。
流式细胞计测试条件：
将hela细胞以1.0×105cells/well的浓度种入6孔板中，其中每个孔板中加入1ml包含了10％fbs和1％抗生素(penicillin–streptomycin,10000uml-1)的dmem。在37℃含5％co2的培养箱中培养24h后，换培养液后部分孔板中加入dox为2mg/l纳米粒子dox@msn-a-cd-peg的dmem(ph＝7.4)，另一部分孔板中加入dox为2mg/l纳米粒子dox@msn-a-cd-peg的dmem(ph＝6.5)。细胞再继续培养4h后，用pbs将细胞离心洗涤三次。所有细胞用胰蛋白酶分散均匀后装离心管离心(1000r/min×5min)收集。倒掉上清液，底部的细胞用pbs7.4清洗两次。最后将细胞悬浮液过滤并用流式细胞计分析，将未用纳米粒子处理过的细胞作为对照组。
由图3与图1的对比可知，msn在装载药物及被包封生成dox@msn-a-cd-peg后其介孔结构消失；由图4可知，在人体正常组织的ph环境下(ph约为7.0-7.4),药物释放缓慢，而在非正常的肿瘤组织的偏酸性环境下(ph约为5)，药物释放迅速；由图5可知在人体正常血液的ph环境下(ph约为7.35-7.45)，本发明提供的药物载体系统的peg保护层不会脱落，则药物也基本不会释放，故其具有在血液中“隐形”的特点，当该药物载体系统从血液中进入非正常组织或ph相对较低的环境时，peg保护层则快速脱落，以便内部的“阀门”材料β-环糊精与外界接触并判断是否开启释放药物；图6可知，通过hela细胞在不同dox浓度，以及在不同ph环境下(7.4和6.5)时不同浓度药物载体dox@msn-a-cd-peg条件下细胞的存活率，可知药物载体在酸性条件下具有很好的杀死癌细胞能力。流式细胞分析仪是从数量上来评估在hela细胞系中细胞吞噬摄取纳米粒子dox@msn-a-cd-peg的能力。如图7所示，在ph6.5条件下细胞吞噬摄取纳米粒子的能力显然比在ph7.4要好得多，在ph6.5条件下平均荧光强度(mfi)值大于在ph7.4条件下的平均荧光强度(mfi)值。细胞流式分析结果证明peg动态保护策略的作用效果，即终载体dox@msn-a-cd-peg在ph7.4环境下“隐形”，却在弱酸(ph6.5)环境下被“激活”从而被细胞摄取并且能够在肿瘤细胞内药物释放从而杀死肿瘤细胞。
另外，为了更清楚的说明本发明成功得到了dox@msn-a-cd-peg，将实施例1制备dox@msn-a-cd-peg过程中的各步产物msn、msn-nh2、msn-d-c6h12o6、msn-o-o-a、dox@msn-a-cd-nh2、dox@msn-a-cd-peg分别进行了热重(tg)和红外光谱测试(ft-ir)测试，结果如图8和图9所示，分析图8和图9可知随着反应的进行热重每一步失重率上升，说明每一步有机物含量增加，根据红外测试，各反应后形成的特征峰均可以被找到，根据两项测试可以说明各步均发生了相应反应，并得到了目标产物。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。