本发明涉及一种包载多西紫杉醇(docetaxel,dtx)的透明质酸寡糖-壳聚糖微球及其制备方法与应用，属于药物载体制备领域。
背景技术：
近年来，天然高分子材料制备的药物载体被广泛应用于疾病的治疗中，如透明质酸(hyaluronicacid,ha)和壳聚糖(chitoan,cts)。透明质酸是一种由葡糖醛酸和n-乙酰氨基葡糖的双糖单位重复连接构成的酸性粘多糖，是细胞外基质的主要成份之一，发挥着一定的生理功能，如在皮肤中储存水分而起保湿作用，经研究发现，在实体肿瘤的边缘组织富集ha，同时肿瘤细胞表面高度表达ha受体cd44，ha通过受体介导信号传导途径对肿瘤的生长、粘附、转移起着重要的作用。壳聚糖是一种天然的高分子阳离子聚合物，具有良好的生物相容性、壳透气性好，并且无毒，可以提高药物的稳定性。但是，ha作为药物载体的稳定性差，易被降解，cts作为药物载体的载药率较低；因此，将ha和cts交联，既可以增加载体稳定性，提高载药率，又可以保留ha对肿瘤细胞的靶向性，以及cts缓释的作用。中国专利文献cn104840428a(申请号201410050110.9)公开了一种载有表皮生长因子的透明质酸-壳聚糖微球及其制备方法和应用，该发明所提供的载有表皮生长因子的透明质酸-壳聚糖微球，通过在保护剂作用下离子聚合、离心沉淀、纯化、冻干而得，使用的透明质酸分子量为60000da或120000da。中国专利文献cn105694120a(申请号201410699380.2)公开了一种壳寡糖透明质酸复合纳米微粒的制备方法，采用壳寡糖和透明质酸作为原料，通过聚合物凝聚法合成壳寡糖透明质酸复合纳米微粒，该方法中使用的透明质酸的分子量为10000-50000da。已报道透明质酸-壳聚糖微球大都采用大分子透明质酸，但是大分子的透明质酸作为肿瘤药物载体的靶向材料时靶向性弱，原因是细胞表面cd44受体与相对分子质量大的透明质酸是多价结合，会掩盖cd44受体的结合位点，导致cd44受体失活。
透明质酸寡糖(ohas)是相对分子质量＜5000da、单糖残基数量为2～30(一般为4～16)的透明质酸分子片段，属于小分子多糖，其性质与普通透明质酸有很大的不同，甚至具有完全相反的作用。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供了一种包载多西紫杉醇的透明质酸寡糖-壳聚糖微球及其制备方法。本发明的透明质酸寡糖-壳聚糖微球靶向性强，制备方法过程简单，成本较低，制备的微球产品形态好、无黏连、粒径分布均匀。
本发明还提供所制备的包载多西紫杉醇的透明质酸-壳聚糖微球的应用。
术语说明：
mes缓冲液：由2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物配制的酸性缓冲液，浓度为0.05mol/l，ph在4左右。
二级水：25℃时电阻率>1mω*cm的水，用于制备常用试剂溶液、制备缓冲液。
本发明的技术方案如下：
一种包载多西紫杉醇的透明质酸寡糖-壳聚糖微球，所述透明质酸寡糖的分子量为700～5000da，所述包载多西紫杉醇的透明质酸寡糖-壳聚糖微球的粒径为5～20μm。
进一步优选的，所述包载多西紫杉醇的透明质酸寡糖-壳聚糖微球的粒径为6～15μm。
一种包载多西紫杉醇的透明质酸寡糖-壳聚糖微球的制备方法，包括步骤：
(1)向mes缓冲液中依次加入透明质酸寡糖、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺，搅拌30min后加入壳聚糖，室温下反应，反应结束后，收集沉淀，经洗涤冷冻干燥后得透明质酸寡糖-壳聚糖偶联产物；
所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:1～3；
(2)按比例称取步骤(1)制备的透明质酸寡糖-壳聚糖偶联产物和多西紫杉醇，所述透明质酸寡糖-壳聚糖偶联产物和多西紫杉醇的质量比为3～7:1；以hac溶液为水相，液体石蜡为油相，三聚磷酸钠溶液为交联剂，将透明质酸寡糖-壳聚糖偶联产物溶于hac溶液中，多西紫杉醇溶于甲醇中，两者混合，依次加入液体石蜡和三聚磷酸钠溶液，乳化交联后，经洗涤冷冻干燥制得包载多西紫杉醇的透明质酸寡糖-壳聚糖微球。
根据本发明优选的，步骤(1)中，mes缓冲液的浓度为0.05mol/l，ph为4。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述透明质酸寡糖的分子量为700-5000da。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述透明质酸寡糖溶解后的浓度为1～5mg/ml。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述壳聚糖的黏度为30mpa.s，分子量为50000da，脱乙酰度大于90％。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述透明质酸寡糖和壳聚糖的质量比为1:1～3。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解后的浓度为4～8mg/ml。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:1～2。
根据本发明优选的，步骤(1)中透明质酸寡糖、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺均在前一种试剂完全溶解后再加入。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述室温下反应的过程包括：室温下反应15～20h，收集上清，调节ph至7.10，继续反应4h后，调节ph至7.50，5500rpm/min离心5min，收集沉淀。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述洗涤采用的是二级水。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述透明质酸寡糖-壳聚糖偶联产物溶于hac溶液中的浓度为30～40mg/ml，所述多西紫杉醇溶于甲醇中的浓度为20～50mg/ml。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述透明质酸寡糖-壳聚糖偶联产物和多西紫杉醇的质量比为4～6:1。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述液体石蜡的质量分数为2～5％，所述hac溶液的质量分数为1～5％，所述三聚磷酸钠溶液的质量分数为3～7％。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述洗涤采用的是石油醚和异丙醇交替洗涤。
本发明制备的包载多西紫杉醇的透明质酸寡糖-壳聚糖微球在制备肿瘤靶向性药物中的应用。
本发明的有益效果：
1.本发明采用透明质酸寡糖作为靶向识别材料，透明质酸寡糖不仅能够完全与细胞表面的cd44受体结合，而且还会与内源性大分子ha竞争性的结合受体cd44，因此，可以提高对肿瘤细胞的靶向性。而大分子的ha作为药物载体的靶向材料时靶向性弱，原因是细胞表面cd44受体与相对分子质量大的ha是多价结合，会掩盖cd44受体的结合位点，导致cd44受体失活。
2.本发明采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/n-羟基琥珀酰亚胺(edc/nhs)的方法合成透明质酸寡糖-壳聚糖偶联产物，制备过程简单，成本较低；通过乳化交联法制备载药微球，制备过程简单，微球表面光滑，获得形态好、无黏连、粒径分布均匀的微球，可以实现微球制备的批量化生产。
3.本发明采用的透明质酸寡糖是来自机体组织本身的纯天然材料，无毒，无刺激，性质稳定，具有很好的生物相容性，并且可识别肿瘤细胞表面的cd44受体，具有靶向性。所用的壳聚糖是自然界存在的唯一的碱性多糖，无毒，具有体内生物降解性和生物相容性。
4.本发明对载药微球进行了包括载药率、包封率、药物释放以及相关的细胞实验等，为临床应用奠定基础，制备的包载多西紫杉醇的透明质酸寡糖-壳聚糖微球(dtx-ohas-cts)对抑制肿瘤细胞有良好的效果。
附图说明
图1为本发明edc/nhs法制备的透明质酸寡糖-壳聚糖偶联产物(4kohas-cts)的红外图谱；
图2为本发明制备的dtx-4kohas-cts微球的扫描电镜照片；
图3为本发明制备的cts微球的扫描电镜照片；
图4为本发明制备的五种微球及一种混合物的热重分析图；
图5为mtt实验中a549细胞吸光度值的变化情况；
图6为a549细胞、piec细胞、mcf-10a细胞和mcf-7细胞的激光共聚焦图；
图7为a549细胞和piec细胞的荧光强度图；
图8为mcf-7细胞和mcf-10a细胞的荧光强度图。
具体实施方式：
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步说明，但不仅限于此。本发明未详尽说明的，均按本领域常规技术。
本实施例中所涉及的试剂及药品，如透明质酸寡糖(ohas)、透明质酸(ha)、壳聚糖(cts)、多西紫杉醇(docetaxel,dtx)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、异硫氰酸荧光素(fitc)、二甲基亚砜(dmso)、肿瘤细胞(a549细胞、mcf-7细胞)、正常细胞(piec细胞、mcf-10a)、二级水等，均为普通市售产品。
实施例1、ohas-cts偶联产物制备：
向30ml0.05mmes缓冲液中先后加入透明质酸寡糖(平均分子量为4000da，记作4kohas)90mg、edc180mg、nhs195mg，每一种试剂均在前一种试剂完全溶解后加入，磁力搅拌30min后，加入cts(平均分子量为50000da)180mg继续搅拌，室温下反应20h，收集上清，调节ph至7.10左右，继续反应4h后，调节ph至7.50左右，5500rpm离心5min，收集沉淀，将沉淀用二级水洗涤4次，冷冻干燥，制备得到4kohas-cts偶联产物；
按照上述制备方法，制备得到1kohas-cts偶联产物，所不同的是，向mes缓冲液加入平均分子质量为1000da的ohas(记作1kohas)，加入的量分别为45mg。
上述偶联产物的特征检测：
偶联产物中ohas含量的测定：采用硫酸-咔唑法，称取上述制备的偶联产物样品1.6mg左右于试管中，每个试管加1ml二级水，5ml0.025mol/l的四硼酸钠硫酸溶液，振摇至全溶，煮沸20min，冷却至室温后，向每个试管中再加200μl质量分数为0.1％的咔唑乙醇液，震荡混匀，煮沸20min，冷却，用酶标仪测290nm下的吸收度值，根据标准曲线即可得出ohas的含量。结果显示：4kohas-cts偶联产物中ohas的含量为12～14％左右；1kohas-cts偶联产物中ohas的含量与4kohas-cts偶联产物的相似，在13％左右。
红外表征：采用溴化钾压片的方法，将样品与kbr混合研磨至粉末，压片后置于红外光谱仪检测，检测4kohas-cts偶联产物、cts、4kohas的红外图谱如图1所示，4kohas-cts偶联产物中壳聚糖中仍然有酰胺键的存在，反应前后没有新的化学键生成，但羰基峰的化学位移值有发生变化，相对于透明质酸寡糖发生了红移，相对于壳聚糖发生了蓝移。
实施例2、包载多西紫杉醇的透明质酸寡糖-壳聚糖微球(dtx-ohas-cts)的制备：
称取75mg实施例1制备的4kohas-cts偶联产物，加入2ml质量分数为2％的hac溶液，磁力搅拌至全溶(约3h)，按照载体与药物的质量比为7：1、5:1、3:1，分别称取dtx溶于500μl甲醇中，加入到4kohas-cts的hac溶液中，搅拌30min。用200μl移液枪逐滴加入到40ml质量分数为4％的液体石蜡中，磁力搅拌2h，再用5ml注射器逐滴加入5ml质量分数为5％的三聚磷酸钠溶液，室温下磁力搅拌，转速为1000rpm，交联4h，收集沉淀，用石油醚洗涤3次，异丙醇洗涤1次，并且尽可能减少异丙醇与微球的接触时间，交替洗涤2次，最后用石油醚洗涤三次，冷冻干燥，制备得到三种不同投料比的包载多西紫杉醇的透明质酸寡糖-壳聚糖微球(dtx-4kohas-cts)。
投料比为5:1的dtx-4kohas-cts微球的扫描电镜照片如图2所示，由照片可知，投料比为5:1的dtx-4kohas-cts微球的粒径为5～20μm。
按照上述dtx-4kohas-cts微球的制备方法，制备得到dtx-1kohas-cts微球，所不同的是称取75mg实施例1制备的1kohas-cts偶联产物加入到hac溶液中。
对比例1、cts微球的制备：
称取50mgcts单体，加入2ml质量分数为2％的hac溶液，磁力搅拌至全溶(约3h)。用200μl移液枪逐滴加入到40ml质量分数为4％的液体石蜡中，磁力搅拌2h，再用5ml注射器逐滴加入5ml质量分数为5％的三聚磷酸钠溶液，室温下磁力搅拌，转速为1000rpm，交联4h，收集沉淀，用石油醚洗涤3次，再异丙醇、石油醚交替洗涤4次，每次5ml，冷冻干燥，制备得到cts微球。cts微球的扫描电镜照片如图3所示。
按照上述cts微球的制备方法，制备得到4kohas-cts微球、1kohas-cts微球，所不同的是，分别称取实施例1制备的4kohas-cts偶联产物和1kohas-cts偶联产物，加入到hac溶液中，称取的偶联产物的量均为75mg。
实施例2制备的三种投料比dtx-4kohas-cts微球及对比例1制备的4kohas-cts微球、cts微球、以及dtx与4kohas-cts质量比为1:3的混合物的热重分析图如图4所示。
对比例2、cts-fitc微球的制备：
称取25.01mgcts单体，加入1ml质量分数为2％的hac溶液，磁力搅拌至全溶(约3h)，用0.1mnaoh调ph至出现絮状沉淀(ph约为9.0)，加入0.5ml浓度为10mg/mlfitc的dmso溶液，室温下磁力搅拌，转速为500rpm，避光反应4h，用0.1mnaoh调ph至10.0，将cts-fitc彻底沉淀，用质量分数为70％的乙醇溶液反复洗涤分散，8000rpm离心10min，取上清检测，至酶标仪检测不出fitc，收集沉淀，冷冻干燥后制得cts-fitc微球。
按照上述cts-fitc微球的制备方法，制备得到4kohas-cts-fitc微球、1kohas-cts-fitc微球，所不同的是分别称取实施例1制备的4kohas-cts偶联产物和1kohas-cts偶联产物，加入到hac溶液中，称取的偶联产物的量分别为37.47mg和37.51mg。
实验例1、载药微球的载药率、包封率和药物释放速率测定
对载药微球的载药率及包封率加以测定，并对其药物释放速率进行检测，其中：
载药率＝微球中药物的质量/微球的总质量×100％；
包封率＝微球中药物的质量/投药的质量×100％。
称取1.6mg实施例2制备的dtx-4kohas-cts微球，用1ml质量分数为2％的hcl溶液溶解过夜，破坏微球，用800μl氯仿萃取2次，取氯仿层(下层)，合并，浓缩旋干，用3ml甲醇溶解，滤膜过滤后，用hplc检测，测定载药微球的载药率及包封率。
称取1.6mg实施例2制备的dtx-4kohas-cts微球，装入透析袋(mw＝20000)中，加入3mlpbs，放入250mlpbs(ph＝6.4、6.7、7.0、7.4)中，进行透析，定时取样(2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h、264h、312h、360h)10ml，冻干，用800μl水复溶，用800μl乙酸乙酯萃取两次，取乙酸乙酯层(上层)，合并，浓缩旋干，用100μl甲醇溶解，13500rpm离心20min，取上清用hplc检测，测定载药微球的药物释放速率。
其中，测定载药微球的药物释放速率时标准曲线绘制：称取1.2mgdtx，用甲醇溶解，10ml容量瓶定容，依次稀释得dtx标准溶液，浓度分别为120μg/ml、90μg/ml、60μg/ml、30μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml，滤膜过滤后，用hplc检测，绘制dtx标准曲线。
三种不同投料比的载药微球dtx-4kohas-cts的载药率及包封率的测定结果如表1所示：
表1、三种载药微球dtx-4kohas-cts的载药率及包封率
结果显示，三种载药微球均能达到包载药物的目的，对比三种载药微球的包封率及载药率，发现投料比为3:1的载药微球包封率低，投料比为7:1的载药微球载药率低，投料比为5:1的载药微球包封及载药效果最好。
药物释放实验结果：测得三种dtx-4kohas-cts微球在ph为7.4的pbs中大约4天左右药物释放完全，药物释放率均达94％左右；在ph为7.0、6.7、6.4的pbs中，载药微球释放的速率依次加快。
实验例2、载药微球的细胞增殖抑制实验(mtt)：
取a549细胞、piec细胞、mcf-10a细胞和mcf-7细胞，将复苏后至少传代一次的细胞消化、离心、浑悬和计数，稀释后接种于培养板中，每种细胞接种4块培养板，均使用96孔细胞培养板，a549细胞、piec细胞和mcf-10a细胞接种密度为7×103个/ml，每孔200μl(相当于接种密度为4.4×103个/cm2)，mcf-7细胞贴壁速度及生长速度均较缓慢，因此，接种密度是其他三种细胞接种密度的2倍。四种细胞培养36h，待细胞贴壁后，去除培养基。其中一块培养板进行mtt实验，其他三块培养板加入200μl含有不同dtx浓度的培养基(0、0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml)、实施例1制备的载体材料(4kohas、cts、4kohas-cts偶联产物、1kohas-cts偶联产物)、实施例2和对比例1制备的微球(cts微球、4kohas-cts微球、1kohas-cts微球、投料比为5：1的dtx-4kohas-cts微球、投料比为5：1的dtx-1kohas-cts微球)，分别培养1天、2天、4天后，进行mtt实验，即小心吸去培养基，用不含胎牛血清的培养基洗3次，每次200μl，最后每孔加入200μl不含胎牛血清的培养基和20μl的mtt，置培养箱中继续孵育4h，弃除孔内上清液，每孔加入160μl的dmso，置平板摇床上振荡15min，用酶标仪检测490nm下的吸光度值，其中a549细胞吸光度值的变化如图5所示。
结果显示，载体材料对细胞的影响不大，未载药的空白微球对细胞有一定的影响，但相比于载药微球，抑制作用不明显，且载药微球与纯药物均有抑制细胞生长的功能。
实验例3、微球进入细胞情况检测
1、激光共聚焦仪测药物进入细胞的情况：
将复苏传代后第三天培养于培养瓶中的a549细胞、piec细胞、mcf-7细胞和mcf-10a细胞，消化接种于激光共聚焦皿上，其中a549细胞、piec细胞和mcf-10a细胞的接种密度为1×105个/ml，接种体积为200μl(相当于接种密度为1.3×104个/cm2)，mcf-7细胞的接种密度为2×105个/ml，接种体积为200μl(相当于接种密度为2.6×104个/cm2)，每种细胞接种3个激光共聚焦皿，编号1号、2号和3号，培养36h后，向1号中加入cts-fitc微球的培养液，向2号中加入1kohas-cts-fitc微球的培养液，向3号中加入4kohas-cts-fitc微球的培养液，培养过夜，用pbs洗涤3-5次，除去未进入细胞中的荧光微球，加入多聚甲醛，室温下固定细胞20min，用pbs洗涤3次，再加入荧光染料dapi，室温下染10min，用pbs洗涤3次，用激光共聚焦显微镜拍照观察，结果如图6所示，三种微球可以被细胞摄取，且肿瘤细胞a549和mcf-7对微球的摄取量高于正常细胞piec和mcf-10a。
2、流式细胞仪检测细胞的微球摄取量
同激光共聚焦的检测步骤，接种密度略有不同，其中a549细胞、piec细胞和mcf-10a细胞的接种密度为2×105个/ml，接种体积为3ml(相当于接种密度为6.25×104个/cm2)，mcf-7细胞的接种密度为4×105个/ml，接种体积同样为3ml(相当于接种密度为12.5×104个/cm2)，每种细胞接种2块6孔板，即接种12个孔，3个孔做阴性对照，加不含微球的培养液，3个孔加含cts-fitc微球的培养液，3个孔加含1kohas-cts-fitc微球的培养液，3个孔加含4kohas-cts-fitc微球的培养液，培养过夜，用pbs洗涤3-5次，除去未进入细胞中的荧光微球，消化离心，用pbs分散两次后收集细胞，使用流式细胞仪检测细胞的荧光强度，结果如图7和图8所示。
其中，ohas-cts-fitc微球的培养液：1mgohas-cts-fitc微球，加3ml培养液；cts-fitc微球的培养液：1mgcts-fitc微球，加4ml培养液。
结果显示，三种微球均可以被细胞摄取，但是正常细胞(piec细胞、mcf-10a细胞)的摄取量要低于肿瘤细胞(a549细胞、mcf-7细胞)。说明应用本发明的制备方法制备的微球对于肿瘤细胞具有一定的靶向识别性，可以作为肿瘤靶向性药物的载体。