青藤碱在预防和治疗胸主动脉夹层/主动脉瘤中的应用的制作方法

本发明属于医药生物领域，具体而言，涉及青藤碱在预防和治疗胸主动脉夹层/主动脉瘤中的应用。

背景技术：

主动脉夹层和主动脉瘤是最常见的致死性主动脉疾病。其中主动脉夹层是指血液撕裂主动脉壁内膜进入中膜形成假腔的一类疾病。主动脉瘤是指由于炎症、动脉粥样硬化斑块等引起动脉壁损伤、弹力下降，导致主动脉呈气球样扩张膨出，直径增大50％以上。主动脉夹层病情发展快，一旦破裂死亡率高达80％；主动脉瘤则发病隐匿，多数病人出现临床症状时病情已十分凶险。所以早期预防和及时治疗对主动脉夹层和主动脉瘤来说尤为重要。

主动脉夹层和主动脉瘤的传统治疗方法是经胸腹开放手术，但手术创伤大，围手术期死亡率高(25％)，术后并发症多。除手术治疗外，腔内修复术(tevar)和药物干预也是治疗主动脉瘤和主动脉夹层的常见方式。实际上大部分低危患者仅仅使用药物治疗就可以很好的控制病情。所以，内科药物治疗既可成为独立治疗方法，也是主动脉覆膜支架腔内隔绝术或外科手术的基础治疗，并且是长期预防再发的重要治疗手段。

目前临床上治疗主动脉瘤和主动脉夹层的常用药物包括肾上腺素β受体阻滞药(β受体阻滞药)、血管紧张素ⅱ受体1拮抗药、血管紧张素转换酶抑制药、他汀类药物等。主要是通过控制血压、降低心率、稳定血流动力学等效应发挥作用，没有从主动脉夹层和主动脉瘤本身的发病机制来进行预防和治疗。例如，β受体阻滞药通过降低血压与心肌收缩力，从而降低血管壁张力来延迟胸主动脉瘤的扩张、减少血管破裂和胸主动脉夹层的发生率。血管紧张素ⅱ受体1拮抗药是一类常用的降压药物，可抑制血管紧张素ⅱ和其受体1的结合。上述药物还存在一些不良反应和副作用，例如β受体阻滞剂可能会产生尿潴留、肠麻痹、视力模糊等交感麻痹的不良反应，他汀类药物存在一定的肝肾毒性，等等。因此，我们需要更为安全有效的能够预防和缓解主动脉瘤和主动脉夹层的药物。

针对这一问题，本申请发明人通过动物模型对常见的植物来源的传统中药成分或化合物进行筛选，获得了能够针对主动脉瘤和主动脉夹层的新的药物。

技术实现要素：

本发明首先涉及青藤碱对胸主动脉夹层/胸主动脉瘤的治疗应用，所述的应用为，对于临床确诊的胸主动脉夹层/胸主动脉瘤患者，通过注射给药的方式施用青藤碱。优选的，所述的青藤碱为盐酸青藤碱。

本发明还涉及青藤碱在制备治疗胸主动脉夹层/胸主动脉瘤的药物中的应用，所述的药物包括但不限于，经胃肠消化道道给药的药物、经静脉注射给药的药物、经皮下包埋给药方式给药。优选的，所述的青藤碱为盐酸青藤碱。

本发明还涉及青藤碱在制备预防胸主动脉夹层/胸主动脉瘤的药物中的应用，所述的药物包括但不限于，经胃肠消化道给药的药物、经静脉注射给药的药物、经皮下包埋给药方式给药的药物。优选的，所述的青藤碱为盐酸青藤碱。

附图说明

图1、青藤碱对小鼠模型的胸主动脉夹层/主动脉瘤的预防效果。

图2、青藤碱对小鼠模型的胸主动脉夹层/主动脉瘤的治疗效果

具体实施方式

实验动物、试剂及试剂盒、仪器

实验动物

胸主动脉夹层/主动脉瘤模型：3周龄雄性野生型小鼠(c57bl/6)均购自北京华阜康生物科技股份有限公司。所有动物均在北京市心肺血管疾病研究所spf级环境动物房进行饲养繁殖。野生小鼠需为达到3周龄，体重在10g左右的雄性小鼠。所有实验操作均根据nih与1996年制定的《实验动物管理及使用指南》和首都医科大学实验动物管理委员会规定的实验流程进行。所有实验动物按照随机方法进行分组。

生化试剂及试剂盒名称及供应商见下表1

表1、生化试剂及试剂盒名称及供应商

实验仪器设备名称及供应商见下表2

表2、实验仪器设备名称及供应商

实施例1、胸主动脉夹层/主动脉瘤小鼠模型(小鼠tad模型)的构建

bapn喂水组小鼠tad模型的构建及评价

取3周龄c57bl/6背景雄性小鼠给予正常饮食，

bapn喂水组(n＝16)：将bapn以1g/kg/day剂量溶于饮水中。

喂bapn第14天，随机选择5只小鼠进行胸主动脉超声，判断是否已经存在胸主动脉的增宽/夹层。经多次重复实验，14天时部分小鼠已经出现主动脉弓部增粗和轻微夹层，并开始陆续死亡。对模型诱导夹层/动脉瘤的效果评价方案为：

1.对死亡后的小鼠主动脉进行he或者弹力纤维染色(具体方法见实施例2)，测量脉管直径是否增粗(夹层)；或者观察是否出现弹力板的紊乱或出现动脉瘤；

2.对活体小鼠进行主动脉弓部超声，计算直径，观察是否增粗或出现夹层。

4周后bapn喂水组小鼠加aii灌注：以1μg/kg剂量皮下灌注24小时，如在aii灌注24h后仍未死亡，统一处死。

实施例2、给予青藤碱对主动脉夹层/主动脉瘤的预防效果

青藤碱订购来自中农博信(北京)科技有限公司，货号是bp1314，具体名称是盐酸青藤碱(sinomeninehydrochloride)

使用如实施例1所述的bapn喂水法构建tad小鼠模型。

将诱导tad的小鼠随机分为两组，

一组为青藤碱实验组：从喂bapn的水的首日起，按照150mg/kg的剂量腹腔注射青藤碱，每两天一次；

另一组为对照组：与青藤碱治疗组同样的频率，经腹腔注射给予同样体积的生理盐水。

四周后，两组小鼠都给予血管紧张素ii(aii)灌泵，24h。

给药后观察指标包括：

1.体重：每天对两组小鼠进行称重。观察药物是否影响体重对增长。

2.bapn摄取量：大致每天观察两组小鼠的饮水情况，判断药物是否影响小鼠体重的变化

3.血压变化：自第三周开始，每3天进行一次血压的测定，以排除血压变化对小鼠动脉瘤\夹层破裂风险及生存情况的影响

观察终点：

1.造模期间自然死亡小鼠：纪录死亡时间和死亡原因(是否因夹层/动脉瘤破裂而死)；

2.未死亡小鼠：在灌泵24h前对活体小鼠进行主动脉弓部超声，统计血管直径；灌泵24h后将小鼠处死，收集所有小鼠的血管进行染色，统计夹层发生率。

组织冰冻切片制备：

在实验结束时用戊巴比妥(100mg/kg)麻醉处死小鼠，采用肝素化生理盐水进行心脏灌流，去除心脏残留血液。用4％多聚甲醛继续灌注，使血管组织形态原位固定。在体视显微镜下分离剪取主动脉弓部和降部，在4％多聚甲醛中浸泡固定2小时，后转移至30％蔗糖溶液中4℃过夜，充分脱水。第二天从蔗糖溶液中取出血管，用滤纸充分吸干组织水分，将血管竖直包埋于oct包埋剂中，锡箔纸包绕后于液氮中缓慢冻凝，可贮存于-80℃冰箱。进行连续冰冻组织切片，厚度5μm，用多聚赖氨酸涂层玻片贴片。

组织石蜡切片制备

在实验结束时用戊巴比妥(100mg/kg)麻醉处死小鼠，采用肝素化生理盐水进行心脏灌流，去除心脏残留血液。在体视显微镜下分离剪取主动脉弓部，放于10％甲醛溶液中固定；将正常主动脉和tad组织放于10％甲醛溶液中固定。至少24小时后取出血管进行脱水处理，并用石蜡包埋组织(血管竖直向下)。切片时采用连续切片，厚度5μm，用多聚赖氨酸涂层玻片贴片。

组织病理学检测：

i.通过弹力纤维染色观察弹力板情况，

具体操作如下：

1.冰冻切片：

(1)冰冻切片pbs中洗去oct；

(2)加入1滴(100μl)lugol碘液(试剂a)孵育5分钟，稍加水洗；

(3)加入1滴(100μl)硫代酸钠(试剂b)处理5分钟；

(4)用流水冲洗5分钟，70％酒精稍洗；

(5)加入1滴(100μl)醛品红染液(试剂c)，进行染色10分钟，用70％酒精浸洗2次(每次约30秒，至切片不再脱色为止)，稍水洗；

(6)加入1滴(100μl)橙黄g染液(试剂d)染色10秒，稍水洗；

(7)95％酒精脱水5min；

(8)无水酒精脱水5min；

(9)二甲苯透明5min，封片；

2.石蜡切片：

(1)石蜡切片常规用二甲苯脱蜡，经各级不同浓度的乙醇将石蜡切片脱蜡至水：二甲苯i(20min)→二甲苯ii(20min)→二甲苯iii(20min)→100％酒精(5min)→95％酒精(5min)→80％酒精(5min)→自来水洗去酒精。

(2)加入1滴(100μl)lugol碘液(试剂a)孵育5分钟，稍加水洗；

(3)加入1滴(100μl)硫代酸钠(试剂b)处理5分钟；

(4)用流水冲洗5分钟，70％酒精稍洗；

(5)加入1滴(100μl)醛品红染液(试剂c)，进行染色10分钟，用70％酒精浸洗2次(每次约30秒，至切片不再脱色为止)，稍水洗；

(6)加入1滴(100μl)橙黄g染液(试剂d)染色10秒，稍水洗；

(7)95％酒精脱水5min；

(8)无水酒精脱水5min；

(9)二甲苯透明5min，封片；

采用nikoneclipse90i显微镜观察，弹力纤维呈蓝紫色，背景呈不同程度黄色。弹力板内侧为新生内膜部分。

ii.通过he染色观察血管壁结构破坏情况，

具体操作如下：

1.冰冻切片：

(1)冰冻切片pbs中洗去oct；

(2)4％的多聚甲醛固定10min，pbs洗3遍。

(3)苏木素染色(1-2min)，自来水冲三遍去除浮色。

(4)盐酸乙醇分化液2秒(沾两下)，自来水小流速度冲洗进行返蓝(5min)。

(5)伊红液染色(1-2min)染胞浆，自来水冲洗去除浮色(30秒)。

(6)常规脱水、透明、封片：80％酒精(5min)→95％酒精(5min)→100％酒精(5min)→100％酒精(5min)→二甲苯i(5min)→二甲苯ii(5min)→中性树胶封片。

(7)显微镜下观察标本形态。

2.石蜡切片：

(1)石蜡切片常规用二甲苯脱蜡，经各级不同浓度的乙醇将石蜡切片脱蜡至水：二甲苯i(20min)→二甲苯ii(20min)→二甲苯iii(20min)→100％酒精(5min)→95％酒精(5min)→80％酒精(5min)。

(2)自来水冲洗，洗去酒精。

(3)苏木素染色(3-5min)，自来水冲三遍去除浮色。

(4)盐酸乙醇分化液2秒(沾两下)，自来水小流速度冲洗进行返蓝(5min)。

(5)伊红液染色(2-3min)染胞浆，自来水冲洗去除浮色(30秒)。

(6)常规脱水、透明、封片：80％酒精(5min)→95％酒精(5min)→100％酒精(5min)→100％酒精(5min)→二甲苯i(5min)→二甲苯ii(5min)→中性树胶封片。

(7)显微镜下观察标本形态。

结果显示，青藤碱预防组的小鼠较对照组的小鼠生存情况明显改善(图1a)，动脉破裂率和夹层发生率也明显降低(图1b，c)。超声结果显示血管直径扩张率降低明显(图1d)。小鼠模型的血管染色结果显示青藤碱预防组的小鼠动脉管腔相对完整圆润，未发生扩张，对照组小鼠血管内壁弹力板紊乱，血管直径增粗超过150％(明显的主动脉瘤症状)，同时部分血管内壁弹力板破口，动脉血管壁中出现大量夹层血栓(图1e)。

实施例3、给予青藤碱对主动脉夹层/主动脉瘤的治疗效果

使用如实施例1所述的bapn喂水法构建tad小鼠模型。

将诱导tad的小鼠随机分为两组，

一组为青藤碱实验组：从喂含bapn的水的第14日起，按照150mg/kg的剂量腹腔注射青藤碱，每天一次；

另一组为对照组：与青藤碱治疗组同样的频率，经腹腔注射给予同样体积的生理盐水。

四周后，两组小鼠都给予血管紧张素ii(aii)灌泵，24h。

给药后观察指标包括：

1.体重：每天对两组小鼠进行称重。观察药物是否影响体重对增长。

2.bapn摄取量：大致每天观察两组小鼠的饮水情况，判断药物是否影响小鼠体重的变化

3.血压变化：自第三周开始，每3天进行一次血压的测定，以排除血压变化对小鼠动脉瘤\夹层破裂风险及生存情况的影响。

观察终点：

1.造模期间自然死亡小鼠：纪录死亡时间和死亡原因(是否因夹层破裂而死)；

2.未死亡小鼠：在灌泵24h前对活体小鼠进行主动脉弓部超声，统计血管直径；灌泵24h后将小鼠处死，收集所有小鼠的血管进行染色，统计夹层发生率。

冰冻切片、石蜡切片、组织病理学检测方法同实施例3。

结果显示，青藤碱治疗组的小鼠较对照组的小鼠生存情况明显改善(图2a)，动脉破裂率和夹层发生率也明显降低(图2b，c)。超声结果显示血管直径扩张率降低明显(图2d)。小鼠模型的血管染色结果显示青藤碱治疗组的小鼠动脉管腔相对完整，未发生扩张，对照组小鼠血管内壁弹力板紊乱，血管直径增粗超过150％(明显的主动脉瘤症状)，同时部分血管内壁弹力板破口，动脉血管壁中出现大量夹层血栓(图2e)。

最后需要说明的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明技术方案的实质，不用做对本发明保护范围的限定。