本发明属于中药技术领域，具体涉及一种具有抑菌作用的五味子提取物的制备方法。
背景技术：
细菌可引起局部化脓感染、心包炎、肺炎，导致较高的死亡率。抗生素的发现与使用使人类在治疗感染性疾病病人时拥有了强大武器。然而，抗生素的过度使用甚至滥用导致院内和院外的抗生素耐药菌日益增多。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantstaphylococcusaureus，mrsa)临床上表现出高死亡率和高致病率，治疗已经相当棘手。随着抗生素的滥用，细菌多药耐药现象日益严重，导致了β-内酰胺类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类等常用抗生素不同程度的耐药。糖肽类抗生素万古霉素是临床治疗耐药细菌感染的“最后防线”，然而万古霉素的毒副作用以及已经出现了耐万古霉素金黄色葡萄球菌使得情况未见明朗。近年来研发的利奈唑胺和达托霉素等抗耐药细菌药物也相继发现耐药，使得抗耐药菌药物可能面临无药可用，开发有效的抗耐药菌感染的新药迫在眉睫。
中药在感染性疾病的治疗方面有着传统历史，我国的中草药资源为天然抗菌药物的开发提供了丰富来源。现代药理学研究表明，五味子具有一定的抑菌活性，对不同的耐药菌有不同程度的抑制作用，对耐药金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌活性。五味子为木兰科植物五味子schisandrachinensis(turcz.)baill.的干燥成熟果实，习称“北五味子”，是一味常用中药。其味酸、甘，性温。有收敛固涩、益气生津、补肾宁心之功效。多用于久咳、梦遗、久泻不止、月经不调、自汗、盗汗、心悸失眠、津伤口渴、内热消渴等症状。
目前对五味子的药理活性研究主要集中于小极性木脂素成分，对于五味子抑菌活性的有效部位并未明确。
技术实现要素：
本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种具有抑菌作用的五味子提取物的制备方法。
本发明的目的是通过以下方式实现的：
一种具有抑菌作用的五味子提取物的制备方法，该方法包括以下步骤：
1)取五味子药材，干燥后粉碎，采用乙醇提取得到提取液，提取液浓缩得到五味子醇提物浸膏；
2)取上述步骤1)中五味子醇提物浸膏，加纯化水混悬得到纯化水混悬液，将纯化水混悬液依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取液，浓缩至干，得到乙酸乙酯萃取物；
3)取上述步骤2)中乙酸乙酯萃取物混悬于纯化水中，配制成上样液，上ab-8型大孔吸附树脂，上样速率为1-3ml·min-1，静置吸附3h，用纯化水进行洗脱，洗脱流速为3-5ml·min-1，收集水洗脱组分，浓缩至干，得到具有抑菌作用的五味子提取物。
步骤1)中干燥采用的温度为60℃-70℃，优选为65℃。
优选步骤1)中采用乙醇提取条件为：乙醇浓度70％-80％，提取时间2-3h，料液比为1：10，提取温度80℃提取次数为2-3次。最优选70％乙醇回流提取。该浓度的乙醇提取一方面提取极性物质，另一方面把脂溶性物质提取出来，特别有利于五味子成分的初步提取，经过预实验表明，70％的乙醇提取物具有最强的体外抑菌活性，要显著强于单独用无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚以及水提取。并且，通过大量的创造性劳动筛选用70％的乙醇提取，提取时间2-3h，料液比为1：10，提取温度80℃提取次数为2-3次，得到的浸膏得率最高。
步骤3)所述的ab-8型大孔吸附树脂经过前处理，具体步骤如下：首先用0.5倍柱体积的无水乙醇浸泡10h，再用2倍柱体积的无水乙醇浸泡10h，上柱后用4-5倍的柱体积95％乙醇淋洗，至流出液加纯化水不发生浑浊为合格，用水冲洗至流出液无醇味。
优选步骤2)中萃取使用的石油醚、氯仿、乙酸乙酯均等量，且与纯化水混悬液等体积。
优选步骤3)中洗脱用纯化水的用量为3倍柱体积。
优选步骤3)中上样速率为2ml·min-1。优选步骤3)中洗脱流速为4ml·min-1。
优选步骤3)中上样液的浓度为10-15g·l-1，最优选步骤3)中上样液的浓度为10g·l-1。
与现有技术比较本发明的有益效果：本发明筛选出了五味子抑菌活性部位及组分，为高极性成分，具有明显的抑菌活性，对耐药菌也具有较强的抑菌活性，且制备工艺简单。本发明通过大量的实验特别选用ab-8型大孔吸附树脂，为弱极性大孔吸附树脂，针对五味子经醇提取乙酸乙酯萃取得到的浸膏具有显著的吸附率和解析率，对抑菌活性大极性组分能够达到很好的分离效果。而且，ab-8型大孔吸附树脂化学性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，加热不溶。对有机物选择良好，不受无机盐的影响，再生处理比较方便，使用寿命长。
本发明制得的五味子抑菌提取物中含有大量大极性有机酸类成分，经uplc-ms分析主要有奎尼酸(1)、苹果酸(2)、柠檬酸(3)、莽草酸(4)、柠檬酸单甲酯(5)、原儿茶酸(6)、富马酸单乙酯(7)、2-羟基-丙基三羧酸-2-乙酯(8)和柠檬酸二甲酯(9)，通过体外抑菌实验表明本制备方法制得的五味子提取物具有明显的抑菌活性以及对耐药菌的较强抑制作用。
附图说明
图1为实施例1五味子抑菌提取物的uplc-ms总离子流图(负离子)。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进行进一步阐述：
实施例1：
1)五味子乙醇提取物的制备
取五味子药材100g，经65℃干燥后粉碎，采用质量浓度70％乙醇冷凝回流提取3h，料液比为1：10，提取温度80℃，提取两次，合并两次提取液，旋转蒸发仪旋蒸至干，得五味子乙醇提取物浸膏备用。
2)五味子不同溶剂分段萃取五味子不同极性部位的制备
取上述步骤1)五味子乙醇提取物，加纯化水混悬，分别依次用等体积石油醚、氯仿、乙酸乙酯各萃取4次，石油醚、氯仿、乙酸乙酯用量与纯化水混悬液等体积，收集乙酸乙酯萃取液，浓缩至干，得到乙酸乙酯萃取物；
3)ab-8型大孔吸附树脂分离五味子乙酸乙酯萃取部位
ab-8大孔吸附树脂前处理：首先用0.5倍柱体积的无水乙醇浸泡10h，再用2倍柱体积的无水乙醇浸泡10h，上柱后用4-5倍的柱体积95％乙醇淋洗，至流出液加纯化水不发生浑浊为合格，用水冲洗至流出液无醇味。
取上述步骤2)中乙酸乙酯萃取物混悬于纯化水中，配制成10g·l-1的上样液，上ab-8型大孔吸附树脂，上样速率为2ml·min-1，静置吸附3h，用3倍柱体积的纯化水进行洗脱，洗脱流速为4ml·min-1，收集水洗脱组分，浓缩至干，得到具有抑菌作用的五味子提取物。
实施例2：
1)五味子乙醇提取物的制备
取五味子药材100g，经65℃干燥后粉碎，质量浓度为70％乙醇冷凝回流提取3h，料液比为1：10，提取温度80℃提取两次，合并两次提取液，旋转蒸发仪旋蒸至干，得五味子乙醇提取物浸膏备用。
2)五味子不同溶剂分段萃取五味子不同极性部位的制备
取上述1.1中五味子醇提物，加纯化水混悬，分别依次用等体积石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水饱和正丁醇各萃取4次，合并各有机相萃取液，浓缩至干，得到石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、水饱和正丁醇萃取物和剩余水组分。
3)ab-8型大孔吸附树脂分离五味子乙酸乙酯萃取部位
ab-8型大孔吸附树脂前处理：首先用0.5倍柱体积的无水乙醇浸泡10h，再用2倍柱体积的无水乙醇浸泡10h，上柱后用4-5倍的柱体积95％乙醇淋洗，至流出液加纯化水不发生浑浊为合格，用水冲洗至流出液无醇味。
取上述1.2中乙酸乙酯萃取物混悬于纯化水中，配制成10g·l-1的上样液，上ab-8大孔吸附树脂，上样速率为2ml·min-1，静置吸附3h，依次用3倍柱体积的纯化水、30％乙醇、50％乙醇和95％乙醇梯度洗脱，洗脱流速为4ml·min-1。分别收集各洗脱组分，浓缩至干，得到ab-8大孔吸附树脂分离五味子乙酸乙酯萃取物各洗脱组分。
试验例1五味子不同萃取极性部位抗体外抑菌活性药效学测定
按照实施例2方法，五味子醇提后依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇分段萃取后，得到五味子不同极性部位，不同极性部位对金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus，sa)atcc25923、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantstaphylococcusaureus，mrsa)atcc43300和临床分离耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mrsa1-mrsa7(临床耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mrsa1-mrsa7分别分离于2016年11月-12月无锡市中医医院临床标本，临床耐药菌株均使用microscanwalkaway96plus西门子细菌鉴定及药敏分析仪鉴定菌种，采用美国临床和实验室标准协会(clsi)判断标准，7株细菌经过培养鉴定及药敏实验证实为mrsa。)显示了不同程度的抑制作用。结果见表1，其中乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用，且对耐药mrsa也具有较强的抑制作用，且较其他各组分抑菌活性最强。水饱和正丁醇萃取物也具有一定的抑菌作用，作用弱于乙酸乙酯萃取物。石油醚萃取物、氯仿萃取物和剩余水组分对金黄色葡萄球菌和耐药mrsa均无抑菌作用或作用很弱。乙酸乙酯萃取物较水饱和正丁醇萃取物体外抑菌作用有极显著性差异(p<0.01)，因此筛选出活性更强的乙酸乙酯萃取部位进一步研究。
表2五味子不同萃取部位对供试菌的抑菌圈直径结果(
注：“—”表示没有抑菌作用。同乙酸乙酯萃取物组相比**p<0.01。
试验例2ab-8大孔吸附树脂分离五味子乙酸乙酯萃取部位各洗脱组分抗mrsa体外抑菌活性
取试验例1方法筛选出的最强抗mrsa活性的五味子乙酸乙酯萃取部位，经过ab-8大孔吸附树脂分离得到各洗脱部位显示了不同的抗mrsa抑菌活性，结果见表3。其中水洗脱组分对标准菌株金黄色葡萄球菌atcc25923、标准菌株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌atcc43300和临床分离耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mrsa1-mrsa7均有不同程度的抑制作用，并且抑菌作用强于其他各洗脱组分，30％乙醇洗脱组分也具有一定的抑菌作用，活性弱于水洗脱组分，水洗脱组分较30％乙醇洗脱组分体外抑菌作用有极显著性差异(p<0.01)。50％乙醇和95％乙醇洗脱组分没有显示抑菌活性或抑菌活性很弱。表明五味子抗mrsa体外抑菌活性部位主要集中在经醇提-乙酸乙酯萃取-ab-8大孔吸附树脂分离水洗脱部位。该部位为本发明中制备的五味子抑菌提取物。
表3ab-8大孔吸附树脂分离各洗脱组分对供试菌的抑菌圈直径结果(
注：“—”表示没有抑菌作用。同水洗脱组分相比**p<0.01。
试验例3
供试品制备：精密称取实施例1五味子抑菌提取物0.0100g，2ml甲醇溶解，进样前经0.22μm微孔滤膜过滤。
uplc色谱条件：色谱柱acquityuplcbehc18(50mm×2.1mm，1.7μm，waters公司)；柱温45℃；体积流量为0.3ml·min-1；进样量为1μl；流动相为乙腈(a)-0.1％甲酸水(b)。a相比例随时间变化：0～0.1min，0％～0％；0.1～11min，0％～14％；11～13min，14％～100％；13～14min，100％～100％；14min～14.1min，100％～0％。
质谱条件：电喷雾电离离子源(esi)，负离子模式扫描质谱响应更强，毛细管电压3.0kv，锥孔电压(samplingcone)20v，离子源温度100℃，脱溶剂气温度400℃，锥孔气流量(conegasflows)为50l·h-1，脱溶剂气流量(desolvationgasflow)700l·h-1。低能量扫描(function1)传输碰撞能量为6ev，高能量扫描(function2)传输碰撞能量为20ev，扫描质量范围为m/z20-1000。
uplc-ms分析鉴定五味子抑菌提取物活性部位化学成分，运用质谱处理软件对负离子模式总离子流图分析处理，五味子抑菌提取物总离子流图见图1。分子式匹配软件计算处理，结合各化合物相对分子质量和相对保留时间，经过文献检索和相关数据库对各主要分子离子峰以及高能量碰撞碎片信号进行归属，对化合物进行识别，相关离子推断见表4，鉴别了9个化合物，这9个化合物分别为奎尼酸(1)、苹果酸(2)、柠檬酸(3)、莽草酸(4)、柠檬酸单甲酯(5)、原儿茶酸(6)、富马酸单乙酯(7)、2-羟基-丙基三羧酸-2-乙酯(8)和柠檬酸二甲酯(9)。
表4五味子抑菌提取物化合物成分鉴定结果