本发明涉及一种疫苗的制备方法，更具体地说涉及用一种细胞系生产鸭坦布苏病毒病灭活苗的方法，属于生物技术领域。
技术背景
我国鸭存栏量每年约40亿只。从2010年春季开始，我国浙江、江苏、山东、河北和北京等地区相继暴发了一种以鸭产蛋下降为主要特征的疫病，雏鸭发病后期出现精神沉郁、体重减轻、仰翻、侧翻和死亡等临床症状，若细菌继发感染，出现肝周炎、心包炎和气囊炎等，死淘率增加。2010年，根据产蛋下降和卵泡出血，将该病命名鸭出血性卵巢炎（duckhemorrhagicovaritis,dho），后经病原学研究证实该病是由黄病毒科坦布苏病毒（ducktembusuvirus,dtmuv）引起，将该病命名为鸭坦布苏病毒病。北京鸭、樱桃谷鸭、金定鸭、麻鸭和康贝尔鸭等均可发病，该病给养鸭业造成了巨大的经济损失。疫苗免疫是预防传染病有效和经济的方法之一，疫苗制备方法与疫苗的质量和成本密切相关，能够生成出抗原含量高、批间差异小、低成本和易放大等工艺是研究的重点，是行业发展方向。
在疫苗研究方面，研究人员就全病毒灭活疫苗和致弱活疫苗进行了大量的研究工作，鸭坦布苏病毒病灭活疫苗（hb株）和活疫苗（wf100）先后获得新兽药注册证书。目前资料表明，研究人员或疫苗生产企业主要利用鸭胚、鸡胚、鸡胚成纤维细胞、鸭胚成纤维细胞、bhk－21、vero细胞、df-1细胞等细胞增殖病毒。我们的研究结果表明，利用无血清全悬浮bhk-21细胞反应器培养的鸭坦布苏病毒含量低，利用微载体灌流法悬浮培养vero细胞培养的病毒液，其病毒含量可达到制备疫苗的标准，但是由于微载体和血清昂贵，存在成本高和不易放大的缺点，不适合养鸭企业适用。采用无血清全悬浮何种细胞培养病毒含量高、培养成本低的鸭坦布苏病毒培养工艺，是我们多年来一直研究和摸索的工作。
eb66细胞来源于鸭胚干细胞，经驯化后形成的一种遗传稳定、纯净、可在无血清培养基中大规模悬浮培养、广泛用于人或动物疫苗生产用细胞系。国内外尚未见建有利用鸭胚干细胞eb66和无血清全悬浮反应器培养鸭坦布苏病毒的报道或专利申请。
技术实现要素：
为克服利用鸭胚生产存在的劳动强度大、成本高、工艺复杂、自动化程度低、抗原批间差异大和现有细胞培养的病毒含量低等缺点，提供一种用鸭胚干细胞系eb66生产鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法及其疫苗。
本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。
一种制备鸭坦布苏病毒病出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，所述细胞系为eb66（一株鸭胚胎干细胞衍生细胞株），病毒培养采用生物反应器以无血清全悬浮方式培养。
上述方法，包括如下步骤：
1）选育毒株：将鸭坦布苏病毒鸭胚适应株在eb66细胞系中连续传代至病毒适应细胞，经鸡胚有限稀释克隆法，取病毒含量最高的适应毒株继续经eb66细胞培养，培养出病毒含量高、免疫原性好的毒株作为候选病毒株（基础种毒株）；
2）建立毒种种子批：将步骤1）所得候选株病毒接种eb66细胞，用细胞培养三角摇瓶传代培养至第11代，处理细胞培养液，各代次毒种的病毒含量应≥106.5eld50/1ml。以1～10ml/冻存管的剂量分装，-70℃保存。确定无菌检验、特异性检验、病毒含量检验和外源病毒检验合格的f2～f7代作为毒种种子批，其中f2～f5代病毒为基础毒种，f6～f7代为生成种毒（工作种子）；确定病毒感染复数（moi）：测定f6和f7代生成种毒的病毒含量（eld50，鸡胚半数感染量），通过1个eld50接种10000、1000、100、10、1个细胞后增殖的病毒含量，按照≥107.1eld50/1ml的标准，确定了f6和f7毒种接种eb66细胞的moi为0.1~0.001；
3）制备细胞毒液：在激流式生物反应器中利用无血清培养基全悬浮培养eb66细胞，培养条件为温度30～37℃，ph7.2～7.5；当反应器中利用无血清培养基全悬浮培养的eb66细胞数量达到400～1000万时，接种f6或f7代毒种，作用2h后，加入2倍细胞体积维持液，30～37℃继续培养，30～120h后，当细胞活力下降到80%以下时收获细胞毒液，该细胞毒液病毒含量应≥107.1eld50/1ml；
4）灭活病毒：取步骤3）所得细胞毒液采用反复冻融、高速组织捣碎机处理、超声波处理或高压细胞破碎机处理，加入细胞毒液总量（v/v）0.1～0.2%的灭活剂，2～37℃振荡灭活16～144h；成品检验：取所得灭活病毒，以0.2ml/胚的剂量经cam途径接种10枚易感鸭胚或鸡胚，观察144小时，无特异性鸭胚或鸡胚死亡，判定毒液灭活完全；同时，取样，接种细菌检验用tg、ga和gp培养基，观察10日，无细菌生长，判定灭活毒液无细菌污染；
5）乳化：向步骤4）所得细胞毒液加入（v/v）4%～8%吐温80，搅拌均匀为水相，按照油相与水相的体积比1.5～3：1进行乳化，乳化后即得成品。
上述方法，所述细胞为鸭胚干细胞系（eb66）；
上述方法：所述培养方法为细胞培养三角摇瓶或生物反应器，全悬浮细胞培养工艺；
上述方法：所述培养基为无血清培养基；
上述方法：毒株选育技术为鸡胚有限稀释法纯化技术；
上述方法，所述病毒感染复数（moi）为0.1～0.001；
上述方法，所述培养工艺为接种病毒后，作用2h，再加入2倍体积的细胞维持液，30～37℃继续培养30～120h；
上述方法，细胞毒液采用反复冻融、高速组织捣碎机处理、超声波处理或高压细胞破碎机处理；
上述方法，所述灭活剂为质量浓度37%的甲醛溶液，2～37℃振荡灭活16～144h；
上述方法，所述灭活检验方法为以0.2ml/胚的剂量经cam途径接种10枚易感鸭胚或鸡胚，观察144小时，无特异性鸭胚或鸡胚死亡；
上述方法，所述乳化成疫苗的方法为按照油相与水相的体积比1.5～3:1进行乳化，乳化后即得疫苗成品。
与现有技术相比，本发明具有如下显著的有益效果：
（1）鸭坦布苏病毒用本发明确定的鸭胚干细胞系eb66培养，病毒适应性好和病毒含量高；
（2）经鸡胚有限稀释法筛选出的毒种免疫原性好；
（3）用反应器培养鸭坦布苏病毒，显著降低了病毒的扩散风险，具有更好的安全性；
（4）不采用鸭胚培养病毒工艺，不需要专门饲养种鸭和避免了挑选易感鸭胚的繁琐；
（5）培养的病毒液中仅含有病毒和细胞碎片，与鸭胚增殖病毒方法相比，不需要无害化处理鸭胚组织物，对环境影响小；
（6）利用鸭胚干细胞系eb66无血清全悬浮培养的病毒液，其病毒含量不低于鸭胚，显著高于（10～100倍）bhk-21细胞培养的病毒。由于不使用微载体，成本显著低于微载体灌流法vero细胞培养工艺。
（7）无血清全悬浮工艺培养的病毒液成本不到鸭胚工艺的一半。
（8）由于不需要鸭胚孵化车间、逐枚接种、逐枚收获、组织到随机捣碎等优点，该方法占用空间小，制备流程简单。
用鸭胚干细胞系eb66细胞生产的鸭坦布苏病毒病灭活疫苗，安全，副反应小，免疫效力更高，疫苗批间质量差异小。该生产工艺简单稳定、易操作、产量大、培养的半成品病毒含量高、成本低和外源病原污染几率小等特点，具备工业化大生产的可行性和可放大性，具有很好的经济效益和应用前景。
具体实施方案
实施例1
一种制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法，所述细胞系为鸭胚干细胞系eb66。
上述方法，包括如下步骤：
1）选育毒株：将鸭坦布苏病毒（鸭坦布苏病毒-hb株，北京市农林科学院畜牧兽医研究所分离、鉴定和保存，基因登录号为jf523187）鸭胚适应株在eb66细胞系（该细胞株于2015年由甘肃健顺生物购自法国valneva公司，并拥有中国独家代理权）中连续传代至病毒适应细胞，经鸡胚有限稀释克隆法（即将病毒液进行10倍系列稀释，取最高稀释度毒液接种鸡胚后收获的病毒），取病毒含量最高的适应毒株继续经eb66细胞培养，培养出病毒含量高、免疫原性好的毒株作为候选病毒株（基础种毒株）；
2）建立毒种种子批：将步骤1）所得候选株病毒接种eb66细胞，用细胞培养三角摇瓶传代培养至第11代（疫苗研究过程中，对生产毒种的传代进行限定，由于传代次数增加，毒种的免疫原性会降低。本发明选择f6和f7作为生产毒种，f8代是疫苗代次。根据疫苗研究要求，一般往后在传3代，即f11代，如果f11代的免疫原性良好，表明f8代疫苗的保护效果会理想。处理细胞培养液，各代次毒种的病毒含量应≥106.5eld50/1ml。以1～10ml/冻存管的剂量分装，-70℃保存。确定无菌检验、特异性检验、病毒含量检验和外源病毒检验合格的f2～f7代作为毒种种子批，其中f2～f5代病毒为基础毒种，f6～f7代为生成种毒（工作种子）；确定病毒感染复数（moi）：测定f6和f7代生成种毒的病毒含量（eld50，鸡胚半数感染量），通过1个eld50接种10000、1000、100、10、1个细胞后增殖的病毒含量，按照≥107.1eld50/1ml的标准，确定了f6和f7毒种接种eb66细胞的moi为0.1~0.001；
3）制备细胞毒液：在激流式生物反应器中利用无血清培养基全悬浮培养eb66细胞，培养条件为温度30～37℃，ph7.2～7.5；当反应器中利用无血清培养基全悬浮培养的eb66细胞数量达到400～1000万时，接种步骤2）f6或f7代毒种，作用2h后，加入2倍细胞体积维持液，30～37℃继续培养，30～120h后，当细胞活力下降到80%以下时收获细胞毒液，该细胞毒液病毒含量应≥107.1eld50/1ml；
4）灭活病毒：取步骤3）所得细胞毒液采用反复冻融、高速组织捣碎机处理、超声波处理或高压细胞破碎机处理，加入细胞毒液总量（v/v）0.1～0.2%的灭活剂（质量浓度37%的甲醛溶液），2～37℃振荡灭活16～144h；成品检验：取所得灭活病毒，以0.2ml/胚的剂量经cam途径接种10枚易感鸭胚或鸡胚，观察144小时，无特异性鸭胚或鸡胚死亡，判定毒液灭活完全；同时，取样，接种细菌检验用tg、ga和gp培养基，观察10日，无细菌生长，判定灭活毒液无细菌污染；
5）乳化：向步骤4）所得细胞毒液加入（v/v）4%～8%吐温80，搅拌均匀为水相，按照油相（油佐剂marcol52+司盘制备而成）与水相的体积比1.5～3:1进行乳化，乳化后即得成品。
实施例2
使用实施例1所用的方法制备得到的鸭坦布苏病毒病灭活疫苗（hb株）（外观乳白色均匀乳剂；剂型油包水型。取一清洁吸管，吸收少量疫苗，滴于清洁冷水表面，除第一滴外，均应不扩散；黏度按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定；稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，应不分层，管底析出的水相应不超过0.5ml；无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长；安全检验取28日龄dhov抗体阴性健康北京鸭（或樱桃谷鸭）5只，每只颈部皮下注射1ml。隔离饲养，观察14日，应不出现由疫苗引起的局部或全身不良反应；效力检验取20只42～120日龄dhov抗体阴性健康北京鸭（或樱桃谷鸭），10只为免疫组，每只胸部肌肉接种0.5ml疫苗，另10只作为非免疫对照。首次免疫14日后，按照同样的剂量和接种途径对免疫鸭进行二次免疫。二次免疫后28日，免疫组和对照组，采血，测定hi抗体效价，且每只鸭各肌肉注射dhov-hb株病毒液0.5ml（100个did50）。攻毒后2日，采集血液，分离血清，进行病毒分离。对照组hi抗体效价应均小于1:10，免疫组应至少7只hi抗体效价不低于1:20。对照组应至少9只鸭病毒分离阳性，免疫组应至少7只鸭病毒分离阴性。
甲醛残留量测定按现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。。
我们在利用鸭胚研制成鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的基础上，将疫苗生产用毒种hb株接种eb66细胞培养，连续培养11代病毒的含量表明，利用eb66细胞可以培养出高滴度的病毒（均不低于106.1eld50/0.1ml）。8个代次病毒制备疫苗免疫鸭的结果表明，经eb66培养的病毒，其抗原性和免疫原性无明显的改变。利用eb66细胞悬浮培养工艺克服了利用鸭胚生产存在的工艺复杂问题，达到了工艺简单稳定、易放大、节省人力和疫苗批次差异小的目的。利用反应器无血清全悬浮eb66细胞工艺培养的鸭坦布苏病毒，制备成的鸭坦布苏病毒病灭活疫苗质量高、价格低，是一种“物美价廉”的防疫用品。