黄独素B在制备治疗结节性甲状腺肿药物中的应用的制作方法

本发明涉及黄独素b新应用领域，尤其涉及黄独素b在制备治疗结节性甲状腺肿药物中的应用。

背景技术

甲状腺疾病是一种高发的内分泌系统病症，其中甲状腺结节是甲状腺肿的第三阶段，有转变成甲状腺癌的风险。亟需寻找低毒高效的药物达到治愈这种疾病的目的。近年来，我国甲状腺疾病发病率越来越高，普通人群中患病率约为4%，与10年前相比发病率增长了接近4倍。

结节性甲状腺肿又可分为两个阶段，单发结节一般认为是结节性甲状腺肿的初期症状，多发则被认为是其晚期表现且有癌前病变的可能。西医对甲状腺结节一般是通过服用甲状腺药物、激素或通过手术的方法来治疗，但是复发率高，毒副作用大，治疗效果不理想。中医药治疗结节性甲状腺肿治疗效果显著且毒副作用少，引起了研究者们的重视。中医认为主要病机是由于素体虚弱，正气亏虚，饮食不得正化，停聚而成痰。痰、气、瘀壅结于颈前而成瘿。因痰瘀结聚日久而成，故瘿肿坚硬。

黄药子(dioscoreabulbiferal.)始载于《唐本草》。《本草图经》名黄药子,《日华子本草》名黄药,《开宝本草》名黄药根,《本草纲目》名大苦、木药子。《湖南药物志》名毛肾子、毛睾丸、牛卵子、野脚板薯^[10]。黄药子为薯蓣科薯蓣属植物黄独dioscoreabulbiferal.的干燥块茎，主要具有化痰散结、解毒消肿、凉血止血这三大功能。

技术实现要素：

本发明通过建立丙基硫氧嘧啶（ptu）致大鼠结节性甲状腺肿的模型，考察黄药子提取物黄独素b对模型大鼠的治疗作用。黄独素b能较好的改善大鼠甲状腺激素及抗体水平，减轻甲状腺组织结节程度，对结节性甲状腺肿具有良好的治疗作用。

黄独素b在制备治疗结节性甲状腺肿药物中的应用。

所述的黄独素b是从中药黄药子提取的活性物质，又称黄独乙素、黄药子素b，为二萜类物质，其分子式为c19h20o6，分子量344.36，结构式如下：

黄独素b结构式。

所述的制备治疗结节性甲状腺肿的药物为：黄独素b和药学上可接受的载体制备成注射液、片剂、粉针剂、颗粒剂、胶囊、膏剂、霜剂或口服液剂型的药物。

所述的黄独素b的提取方法，包括以下步骤：

（1）将黄药子加入5倍量的75%乙醇中，回流提取2次，每次提取2-3h，合并提取液待用；

（2）将上述提取液浓缩至无醇味，得浸膏，然后浸膏加入硅藻土拌样，干燥；浸膏和硅藻土的质量比为1:1；

（3）将干燥后的硅胶加入3倍量的石油醚，回流提取3次，每次1h，过滤将滤渣减压蒸干，然后加入6倍量的二氯甲烷回流提取6次，每次1h，过滤、合并滤液，将滤液蒸干得二氯甲烷提取物；

（4）将二氯甲烷提取物用乙醇溶解，与等量硅胶拌样，上硅胶柱，用氯仿-甲醇体积比为98:2的混合液洗脱，分段收集洗脱液；

（5）将分段收集的洗脱液分别回收溶剂至干，然后用丙酮溶解、静置析晶，将有结晶析出的洗脱液进行抽滤，滤饼洗涤得结晶，得黄独素b。

ptu（丙基硫氧嘧啶）通过抑制甲状腺过氧化物酶所介导的酪氨酸的碘化及偶联，使氧化碘无法与甲状腺球蛋白结合，使甲状腺激素的合成受阻，进而减少甲状腺激素的生成，又由于体内的负反馈作用产生了大量的tsh(促甲状腺激素，简称tsh)，甲状腺在各种激素的影响下会增生有结节性样变。

大鼠给予丙基硫氧嘧啶造模后，血清中甲状腺激素水平及抗体水平都有变化，给予大鼠黄药子活性成分黄独素b三个剂量灌胃后，升高模型大鼠血清的t3、t4值，降低血清中的抗体tm-ab、tg-ab、tpo-ab值。对甲状腺组织观察方面，通过肉眼观察，模型组大鼠甲状腺肿大，表面有不规则的结节突起，结节周围无包膜或包膜不明显，这是和腺瘤的不同之处，可有继发性出血、坏死、囊性病变，也可伴有钙化。光学显微镜下观察甲状腺充满着胶质的滤泡，部分形成了囊腔（充满胶质），部分钙化程度较重以及导致滤泡上皮增生而形成巨乳头状结构^[18]。给予黄独素b后均能改善甲状腺结节病理变化。实验结果表明，黄独素b能升高丙基硫氧嘧啶致结节性甲状腺肿的大鼠血清中的甲状腺激素水平，降低大鼠体内的抗体水平，说明黄药子活性成分黄独素b对大鼠的甲状腺激素和抗体水平都有一定程度的作用。

从作用机制分析，黄药子活性成分hd-b具有促进碘离子活化的作用或者可以减弱ptu（丙基硫氧嘧啶）对甲状腺过氧化物酶的抑制作用，血清中甲状腺激素水平升高以后减弱其负反馈作用，从而达到治疗结节性甲状腺肿的目的，为开发一种治疗甲状腺结节的新药打下实验基础。

有益效果

1.通过体外实验验证黄独素b能较好的改善大鼠甲状腺激素及抗体水平，减轻甲状腺组织结节程度，对结节性甲状腺肿具有良好的治疗作用。

2.黄药子活性成分黄独素b具有促进碘离子活化的作用或者可以减弱ptu（丙基硫氧嘧啶）对甲状腺过氧化物酶的抑制作用，血清中甲状腺激素水平升高以后减弱其负反馈作用，从而达到治疗结节性甲状腺肿的目的。

3.为开发一种治疗甲状腺结节的新药打下实验基础。

附图说明

图1黄药子活性成分黄独素b对实验大鼠甲状腺组织的病理学影响（he染色，×200）；

a.正常组b.模型组c.黄独素b高剂量组d.黄独素b中剂量组e.黄独素b低剂量组f.阳性药对照组；

图2黄独素b核磁共振碳谱与氢谱图（cdcl3，600mhz）。

具体实施方式

实施例1黄独素b的提取

取黄药子药材1.75kg，加入6倍量的75%乙醇，水浴加热回流提取3次，每次2小时，提取液过滤，滤液合并浓缩至无醇味，得浸膏315g，加入等量硅藻土拌样，50℃减压干燥。将干燥后的硅胶样品加入3倍量的石油醚，水浴加热回流提取3次，每次1小时，提取液过滤。将滤渣减压蒸干，加入6倍量二氯甲烷，加热回流提取6次，每次1小时，提取液过滤，滤液合并蒸干，得二氯甲烷提取物21g，用少量95%乙醇加热溶解，加入等量柱层析硅胶拌样。将氯仿部位上硅胶柱（4cm×13cm），氯仿-甲醇（98:2体积比）洗脱，因为洗脱过程中不同成分会依次被洗脱下来，所以采用小体积分段收集洗脱液的方式来进行洗脱，以确保分离效果，然后依照薄层层析色谱确定目标物在那一段。本次试验以每150ml为一段，分段收集洗脱液，所得洗脱液共1950ml。各洗脱液分别回收溶剂至干得残留物，因为黄独素b易溶于丙酮中，所以残留物用丙酮溶解、静置析晶，随着丙酮的挥发，有些洗脱液中析出大量的无色结晶，将这些洗脱液进行抽滤、丙酮洗涤，共得结晶2.94g。

用薄层层析色谱法（氯仿-甲醇（13:1））观察分离结果，所得结晶均为同一物质，香草醛-硫酸显色为单一紫红色斑点，rf值为0.5。测得其熔点为285-288℃，核磁共振波谱数据（见表1）与二萜化合物diosbulbin-b的一致，确定该化合物为黄独素b。

表1黄独素b的核磁共振波谱数据(cdcl3，600mhz)

实施例2黄独素b对丙基硫氧嘧啶致大鼠结节性甲状腺肿模型外观影响

实验前期准备

将60只sd雄性大鼠随机分成正常对照组、模型对照组、黄药子高、中、低剂量组，左甲状腺钠片组（阳性药对照组），每组10只。

饲养一周后开始造模：每天定时灌胃给予模型组、黄药子高、中、低剂量组及阳性药对照组大鼠丙基硫氧嘧啶(ptu)1.5mg/kg，进行造模，连续15d。随后给药:①正常对照组：每天对大鼠灌胃给予10ml/kg水，持续30天；②模型组：造模成功后按照10ml/kg体重灌胃给予水，持续30天；③黄独素b高剂量组：按照1.62g/kg灌胃，持续30天。④黄独素b中剂量组：按照0.81g/kg灌胃，持续30天。⑤黄独素b低剂量组：按照0.40/kg灌胃，持续30天。⑥阳性对照组（左甲状腺钠片组）：按照0.36mg/kg灌胃给予左甲状腺素钠粉末，持续30天。末次给药后撤食，第二天以70mg/100ml戊巴比妥钠麻醉(腹腔注射麻醉)，经颈静脉采集血液（3ml-5ml）注入5ml含促凝剂的采血管中，3000r/min离心10min，取上层血清。

实验结果：

实验期间，对大鼠外观、饮食、排泄物及活动进行观察可见，正常组大鼠皮毛颜色正常，饮食排泄物及活动一切正常；模型组大鼠造模期间大鼠饮食减少，皮毛颜色发黄晦暗竖立，眼球突出，行动迟缓，前肢有肿胀情况；给予黄药子药物高、中、低剂量组及阳性药对照组随着给药时间的加长大鼠饮食逐渐增多，皮毛变得有光泽，突眼症状减轻，活动自如。

实施例3黄独素b对丙基硫氧嘧啶致大鼠结节性甲状腺肿模型甲状腺激素水平（t3、t4）的影响

实验前期准备同实施例2。

实验结果

测定血清中t3、t4含量。表2结果表明：给大鼠造成结节性甲状腺肿模型后，t3、t4值升高，给予黄独素b治疗后，观察到上述2个指标均降低。其中，t3值与模型对照组相比，黄独素b高、中、低剂量组有极其显著性差异（p<0.001），阳性对照组有极其显著性差异（p<0.001）；t4值与模型对照组相比，黄药子高、中、低剂量组有极其显著性差异（p<0.001），阳性对照组有极其显著性差异（p<0.001）。实验结果表明丙基硫氧嘧啶对甲状腺功能的抑制作用，给予黄独素b后能够改善降低的甲状腺功能。

表2黄独素b对实验大鼠的甲状腺激素水平的影响(x±s，n=10)

*表示与空白对照组相比^*p＜0.05，^**p＜0.01

#表示与模型组相比^#p＜0.05，^##p＜0.01，^###p<0.001；

实施例4黄独素b对丙基硫氧嘧啶致大鼠结节性甲状腺肿模型的tm-ab、tg-ab、tpo-ab自身抗体水平的影响

实验准备同实施例2。

实验结果

测定血清中t3、t4、甲状腺球蛋白抗体(tg-ab)、甲状腺过氧化物酶抗体(tpo-ab)的含量。由表3可见，与正常对照组比较，模型组tm-ab、tg-ab、tpo-ab都有不同程度的提高。给予黄药子活性成分黄独素b治疗后，tm-ab、tg-ab、tpo-ab水平降低。tg-ab、tg-ab、tpo-ab与模型对照组相比，高、中、低剂量无显著性差异（p＞0.05）。

表3黄独素b对实验大鼠自身抗体水平的影响

*表示与正常组相比*p＜0.05，**p＜0.01；

#表示与模型组相比^#p＜0.05

实施例5黄独素b对丙基硫氧嘧啶致大鼠结节性甲状腺肿模型甲状腺组织的病理学影响

实验准备同实施例2

实验结果

在完成血清检测后解剖大鼠，取甲状腺，先用肉眼观察6组大鼠甲状腺形态变化，然后将甲状腺组织用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，做成甲状腺病理切片，he染色后光学显微镜下观察甲状腺组织的病理形态学变化。

图1可见，空白对照组大鼠甲状腺腺体清晰且排列相对整齐，未出现水肿、出血等现象，甲状腺滤泡正常；模型组大鼠腺体不清晰，滤泡大小参差不齐伴有上皮增生，部分甲状腺组织出现坏死，间质充血，部分腺体水肿；黄独素b高剂量组：个别腺上皮细胞增生，并腺体呈实性，未见炎细胞浸润；黄独素b中剂量组:少部分腺上皮细胞增生，并腺体呈实性，未见水肿、出血等现象；黄独素b低剂量组:个别腺上皮细胞增生,部分腺体呈实性增生；阳性对照组（左甲状腺钠片组）：甲状腺部分腺上皮细胞增生，并腺体呈实性。病理组织学检查表明，黄药子对甲状腺间质增生具有改善作用。