一种4-苯基丁酸的应用的制作方法

本发明属于化合物应用领域，具体涉及到4-苯基丁酸的全新用途。

背景技术

急性肾损伤(acutekidneyinjury，aki)是一种常见的肾脏疾病，其特点是肾脏功能快速下降甚至丧失。aki的病理特征是肾小管上皮细胞的损伤和死亡。在损伤发生后，存活的肾小管细胞经历去分化，增殖，以取代受损的肾小管上皮细胞并恢复肾小管的完整性。

过去aki被认为是一种完全可逆的疾病。然而，最近大量流行病学和动物实验研究表明，在严重aki的情况下，肾小管上皮修复不完全或发生适应不良的修复，使aki转归为ckd(chronickidneydisease，ckd)。所以aki是ckd发生和发展的重要危险因素。

ckd是各种原因引起的慢性肾脏结构和功能障碍(肾脏损害病史大于3个月)，包括肾小球滤过率正常和不正常的病理损伤、血液或尿液成分异常，及影像学检查异常，或不明原因肾小球滤过率下降(＜60ml/min·1.73m²)超过3个月。其主要病理特点是肾小管萎缩，肾小管间质纤维化和慢性炎症。打断aki转归为ckd是降低aki对患者伤害的一个有利途径，这就需要一种良好的aki形成后的处理办法。然而，aki目前的防治主要为生物标志物预警来尽早识别并纠正可逆病因，以及采用维持体液平衡，营养支持，防止并发症及肾脏替代治疗的对症支持治疗方案；现有的这些生物标志物预警准确性不高，实用性并不强，导致aki诊出率低，漏诊率高；目前仍无特异治疗方法，导致aki死亡率高。

目前，仍缺乏有效防治aki向ckd转化的药物；发现能有效治疗aki，阻止aki向ckd进展的药物具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明提供了一种4-pba在制备治疗aki的药物的全新用途。

4-苯基丁酸(4-phenylbutyricacid，4-pba)是一种低分子量脂肪酸，由芳香环和丁酸组成。现有研究报道了4-苯基丁酸的一些应用方法，例如：(1)作为氨螯合剂，其片剂或粉末通过口服或鼻胃管插管用于临床治疗尿素循环障碍；(2)由于其活化胚胎血红蛋白转录的能力，用于治疗镰状细胞贫血和地中海贫血；(3)在脊髓性肌萎缩患者中也具有有益效果；(4)可在与神经炎性反应有关的某些疾病(如多发性硬化和缺血)中发挥保护作用；(5)可以缓解阿尔茨海默病小鼠认知缺陷等。本发明通过研究发现，4-pba在阻止aki向ckd转变中具有有效性，故提供以下技术方案：

一种4-苯基丁酸的应用，将其用于制备治疗急性肾损伤的药物。

本发明创新地发现，在急性肾损伤已经形成后，施用4-pba，可以恢复急性肾损伤后受损的部分肾功能；改善急性肾损伤后肾小管萎缩、肾间质纤维化、肾脏慢性炎症和小管细胞死亡。动物模型研究证实，4-pba可有效缓解急性肾损伤形成后的进一步恶化至ckd。

现有技术公开了一些在aki形成前施用一些药物用于预防aki形成的方法，这些方法对于一些可预测的aki是有效的，例如移植，心血管手术和肾毒性药物等引起的aki。但对于其他不可预测的aki，例如创伤(包括缺血再灌注损伤)，败血症，心力衰竭和过敏性休克等引起的aki，这些预防方法存在较多不确定性，临床适用性以及实用性差。不同于现有的aki预防方法，本发明处理对象为aki已经形成的对象。本发明创新地发现4-pba在aki形成后可有效缓解其进一步的损伤，还可修复受损肾的部分功能，具有临床实用价值。

作为优选，所述的应用，将其用于制备治疗肾前性和/或肾性急性肾损伤的药物。

研究发现，4-苯基丁酸可有效缓解肾前性和/或肾性急性肾损伤已经形成后的肾损伤。

本发明人发现，在所述的急性肾损伤形成后施用本发明所述的4-苯基丁酸具有有效性。本发明中，可采用现有方法以及指标来指证急性肾损伤是否形成，从而确定施用本发明所述的4-苯基丁酸的时机。例如，在以下症状下施用所述的4-苯基丁酸：(1)缺血侧肾重/体重的比值明显上升，肉眼见肾脏肿大，苍白，切面皮质苍白，髓质呈暗红色。或在b超下探查到肾脏变大。(2)对侧肾重/体重的比值尚无明显变化，表明对侧肾脏尚未发生代偿性肥大；(3)血清肌酐(serumcreatinine，scr)显著上升，表明出现肾功能损伤；(4)he染色显示肾小管细胞大量损伤和坏死等。

优选地，所述的急性肾损伤指肾功能在2天内突然减退，表现为血清肌酐绝对值升高＞0.3mg/dl；或7天内血清肌酐增至≥1.5倍基础值。本发明所述的应用，将所述的4-苯基丁酸用于制备治疗2天内血清肌酐绝对值升高＞0.3mg/dl或7天内血清肌酐增至≥1.5倍基础值药物。所述的基础值为患者入院后首次测的肌酐值。

作为优选，所述的应用，所述的急性肾损伤表征为指尿量＜0.5ml/(kg·h)，持续时间＞6小时。也即是，将所述的应用于制备治疗尿量＜0.5ml/(kg·h)，持续时间＞6小时的急性肾损伤的药物。

作为优选，所述的应用，将其用于制备治疗急性肾损伤向慢性肾脏病转换的药物。通过本发明的应用，可显著改善由aki转归至ckd的途径，有助于显著降低aki患者的损伤，改善aki患者的预后。

本发明人研究发现，4-pba在缓解aki向ckd转换中的有益功效。通过动物实验研究发现，4-pba能有效地缓解aki向ckd进展。

所述的应用，将其和药学上可接受的辅料复合，制得所述的药物。

所述的应用，所述的药物以4-pba计，施药量为0.01～0.2克/千克/天；优选为0.02～0.03克/千克/天。

本发明还提供了一种4-苯基丁酸药学上可接受盐的应用，将其用于制备治疗急性肾损伤的药物。所述的4-苯基丁酸药学上可接受盐的应用和4-苯基丁酸的应用方法类似。

例如，所述的4-苯基丁酸药学上可接受盐的应用，将其用于治疗2天内血清肌酐绝对值升高＞0.3mg/dl的急性肾损伤的药物；和/或，将其用于治疗尿量＜0.5ml/(kg·h)，持续时间＞6小时的急性肾损伤的药物。

优选的4-苯基丁酸药学上可接受盐的应用，将其用于制备治疗急性肾损伤向慢性肾脏病转换的药物。

所述的4-苯基丁酸药学上可接受盐为4-苯基丁酸的碱金属盐、铵盐中的至少一种。

本发明还提供了一种治疗急性肾损伤的药物，至少包含4-苯基丁酸及其药学上可接受盐；还选择性包含药学上可接受的辅料。所述的药物的剂型可为胶囊、注射等剂型。

本发明还提供了一种治疗急性肾损伤向慢性肾脏病转换的药物，至少包含4-苯基丁酸及其药学上可接受盐；还选择性包含药学上可接受的辅料。所述的药物的剂型可为胶囊、注射等剂型。

有益效果

这些结果表明，4-pba治疗恢复了急性肾损伤后受损的部分肾功能；改善了急性肾损伤后肾小管萎缩、肾间质纤维化、肾脏慢性炎症和小管细胞死亡。表明4-pba能延缓aki向ckd转换。

附图说明：

图1实施例1展示了急性肾损伤向慢性肾脏病转换的过程；

图2为实施例2的急性肾损伤后肾功能障碍，4-pba能恢复部分肾功能的测试结果图；

图3为实施例3的急性肾损伤后肾小管萎缩，4-pba能改善肾小管萎缩的测试结果图；

图4为实施例4的急性肾损伤后肾间质纤维化，4-pba能改善肾间质纤维化的测试结果图；

图5为实施例5的急性肾损伤后肾间质炎症，4-pba能改善肾间质炎症的测试结果图；

图6为实施例6的急性肾损伤后肾小管细胞死亡，4-pba能改善肾小管细胞死亡的测试结果图。

具体实施方案：

1，c57bl/6小鼠(雄性，8-10周龄)购买自长沙斯莱克景达实验动物有限公司。我们以单侧缺血再灌注(unilateralrenalischemia-reperfusion，uir)对侧不切除诱导从aki到ckd转换的动物模型。具体操作如下：进行假手术(sham)或30分钟左肾单侧局部缺血，然后再灌注。在2或7或14天时处死小鼠。收集肾脏组织用于生化和组织学分析。

2，c57bl/6小鼠(雄性，8-10周龄)购买自长沙斯莱克景达实验动物有限公司。进行假手术或30分钟左肾单侧局部缺血，然后再灌注。由于对侧肾的代偿作用无法直接测量出肾功能真实水平，所以在单侧缺血再灌注后的第1，6或13天进行右肾切除术，然后在1天后，即在2或7或14天时处死小鼠。收集血液测量血清肌酐以指示左肾的功能。

3，c57bl/6小鼠(雄性，8-10周龄)购买自长沙斯莱克景达实验动物有限公司。进行假手术或30分钟左肾单侧局部缺血，然后再灌注。从单侧缺血再灌注的第3天开始腹腔注射4-pba20毫克/千克/天或等量的生理盐水(normalsaline，ns)。在单侧缺血再灌注后的第6或13天进行右肾切除术，然后在1天后，即在第7或14天时处死小鼠。收集血液测量血清肌酐以指示左肾的功能。

4，c57bl/6小鼠(雄性，8-10周龄)购买自长沙斯莱克景达实验动物有限公司。进行假手术或30分钟左肾单侧局部缺血，然后再灌注。从单侧缺血再灌注的第3天开始腹腔注射4-pba20毫克/千克/天或等量的ns。在第7或14天时处死小鼠。收集肾脏组织用于生化和组织学分析。

实施例1

对c57bl/6小鼠(雄性，8-10周龄)进行假手术或30分钟左肾单侧局部缺血，然后再灌注。在2或7或14天时，收集肾脏组织用于生物化学和组织学分析(a，b，d，e，f，g，h，i)。在uir后的第1，6或13天进行右肾切除术，然后在1天后，即在2或7或14天时处死小鼠。收集血液测量血清肌酐以指示左肾的功能(c)。(检测uir2d的目的是为了说明2天时aki已经形成，这样在第3天加药就属于治疗aki而不是预防或者干预aki形成。uir7d和uir14d均代表ckd)

测试结果见图1：单侧肾缺血再灌注(unilateralrenalischemiareperfusion，uir)模拟人体内肾脏从急性肾损伤进展为慢性肾脏病。

(a)缺血侧肾脏重量/体重(mg/g)：当单侧缺血再灌注2天(uir2d)时，此时与假手术组(sham)相比，缺血侧肾重/体重的比值明显上升，***p＜0.001，代表缺血侧肾脏发生了水肿。当单侧缺血再灌注7天(uir7d)时，与sham组相比，缺血侧肾重/体重的比值无明显变化。当单侧缺血再灌注14天(uir14d)时，与sham组相比，缺血侧肾重/体重的比值明显下降，**p＜0.01，代表缺血侧肾脏发生了萎缩。(b)对侧肾脏重量/体重(mg/g)：当uir2d时，与sham组相比，对侧肾重/体重的比值无明显变化。但当uir7d和uir14d时，与sham组相比，对侧肾重/体重的比值均明显上升，***p＜0.001，代表对侧肾脏发生代偿性肥大。

(c)血清肌酐(mg/dl)：在三个时间点中，手术组血清肌酐的浓度均显著高于对照组小鼠，***p＜0.001，表明uir导致肾功能持续障碍。

(d)肾组织石蜡切片苏木素-伊红(he)染色：当uir2d时，肾小管细胞大量损伤和坏死，小管扩张伴大量管型形成。当uir7d和uir14d时，部分肾小管脱落，剩余的肾小管结构紊乱，大多数肾小管发生萎缩，表现为肾小管和肾间质间隙明显扩张伴小管腔内大量坏死碎片。此外，uir14d时，肾小球明显萎缩。

(e)肾小管萎缩的病理评分。萎缩小管的百分比评分标准：0无损伤；1，＜25％；2，25-50％；3，50-75％；4，＞75％。定量分析显示uir后肾小管萎缩进行性加重。

(f)胶原蛋白1(collagen1)，α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)和波形蛋白(vimentin)的免疫印迹分析。

(g)collagen1，α-sma和vimentin的免疫印迹的定量分析：与假手术组相比，缺血组细胞外基质组分标记物(collagen1)和肌成纤维细胞活化标记物(α-sma和vimentin)的表达明显增加。

(h)肾组织石蜡切片masson三色染色：sham组无明显胶原沉积；当uir7d时，蓝色的i，iii和iv型胶原纤维主要分布在皮髓交界处；当uir14d时，胶原纤维已从皮髓交界处扩散到肾皮质。

(i)masson三色染色的定量分析：肾间质纤维化进行性加重。

数据表示为平均值±标准误。n＝4。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；ns，无明显差异。

实施例2

对c57bl/6小鼠(雄性，8-10周龄)进行30分钟的左肾单侧局部缺血，然后再灌注。从uir的第3天开始腹腔注射20毫克/千克/天或等量的生理盐水(ns)。在uir后的第6天或第13天进行右肾切除术，然后在1天后，即在7或14天时处死小鼠，收集血液测量血清肌酐以指示左肾的功能。

测试结果见图2：体内实验证明了4-pba改善了急性肾损伤后肾功能障碍。血清肌酐(mg/dl)：与sham组相比，手术组血清肌酐的浓度显著高于对照组，表明uir导致了肾功能障碍。在uir7天和uir14天时，与注射ns组相比，注射4-pba组血清肌酐值浓度均显著下降，**p＜0.01，***p＜0.001，表明4-pba能恢复急性肾损伤后部分肾功能。

血清肌酐具体数值如下：

7duir+ns组″3.997±0.3131″，uir+4-pba组″2.205±0.04976″

14duir+ns组″3.437±0.2449″，uir+4-pba组″1.841±0.09460″

数据表示为平均值±标准误。n＝4。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；ns，无明显差异。

实施例3

c57bl/6小鼠(雄性，8-10周龄)购买自长沙斯莱克景达实验动物有限公司。进行假手术或30分钟左肾单侧局部缺血，然后再灌注。从单侧缺血再灌注的第3天开始腹腔注射4-pba20毫克/千克/天或等量的ns。在第7或14天时处死小鼠。收集肾脏组织。

测试结果见图3：体内实验证明了4-pba减轻了急性肾损伤后肾小管萎缩。

(a)肾组织石蜡切片he染色：与sham组相比，当uir7天和uir14天时，部分肾小管脱落，剩余的肾小管结构紊乱，大多数肾小管发生萎缩，表现为肾小管和肾间质间隙明显扩张伴小管腔内大量坏死碎片。当uir7d和uir14d时，与注射ns组相比，注射4-pba组萎缩小管数量减少。

(b)肾小管萎缩的病理评分：萎缩小管的百分比评分标准：0无损伤；1，＜25％；2，25-50％；3，50-75％；4，＞75％。定量分析显示：与sham组相比，uir后肾小管发生明显萎缩。当uir7天时，与注射ns组相比，注射4-pba组萎缩小管显著减少，*p＜0.05。当uir14天时，与注射ns组相比，注射4-pba组萎缩小管显著减少，*p＜0.05。

肾小管萎缩评分具体数值如下：

7duir+ns组″2.300±0.2603″，uir+4-pba组″1.500±0.2236″

14duir+ns组″3.400±0.2211″，uir+4-pba组″2.500±0.2236″

数据表示为平均值±标准误。n＝4。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；ns，无明显差异。

实施例4

c57bl/6小鼠(雄性，8-10周龄)购买自长沙斯莱克景达实验动物有限公司。进行假手术或30分钟左肾单侧局部缺血，然后再灌注。从单侧缺血再灌注的第3天开始腹腔注射4-pba20毫克/千克/天或等量的ns。在第7或14天时处死小鼠。收集肾脏组织。

测试结果见图4：体内实验证明了4-pba减轻了急性肾损伤后肾间质纤维化。

(a)胶原蛋白1(collagen1)，α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)和波形蛋白(vimentin)的免疫印迹图像。

(b)collagen1和α-sma的免疫印迹的定量分析：与sham组相比，uir7天和uir14天时，细胞外基质组分标记物collagen1和肌成纤维细胞活化标记物α-sma的表达显著上升。当uir7天时，与注射ns组相比，注射4-pba组细胞外基质组分标记物collagen1和肌成纤维细胞活化标记物α-sma的表达均明显降低。当uir14天时，与注射ns组相比，注射4-pba组细胞外基质组分标记物collagen1和肌成纤维细胞活化标记物α-sma的表达也都明显降低。

collagen1定量分析的具体数值如下：

7duir+ns组″2.839±0.4726″，uir+4-pba组″0.9561±0.1542″

14duir+ns组″2.808±0.5764″，uir+4-pba组″1.022±0.1858″

α-sma定量分析的具体数值如下：

7duir+ns组″3.698±0.4911″，uir+4-pba组″2.141±0.3457″

14duir+ns组″5.177±0.3866″，uir+4-pba组″3.305±0.4714″

(c)肾组织石蜡切片masson三色染色。

(d)masson三色染色的定量分析：与sham组相比，uir7天和uir14天时，胶原沉积百分比显著上升。表明uir导致肾间质纤维化。当uir7天和uir14天时，与注射ns组相比，注射4-pba显著减轻了胶原沉积百分比，表明4-pba可以减轻肾间质纤维化。

masson三色染色的定量分析的具体数值如下：

7duir+ns组″11.40±1.656″，uir+4-pba组″6.177±1.263″

14duir+ns组″20.26±3.255″，uir+4-pba组″9.882±2.077″

数据表示为平均值±标准误。n＝4。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；ns，无明显差异。

实施例5

c57bl/6小鼠(雄性，8-10周龄)购买自长沙斯莱克景达实验动物有限公司。进行假手术或30分钟左肾单侧局部缺血，然后再灌注。从单侧缺血再灌注的第3天开始腹腔注射4-pba20毫克/千克/天或等量的ns。在第7或14天时处死小鼠。收集肾脏组织。

测试结果见图5：体内实验证明了4-pba减轻急性肾损伤后肾间质炎症。

(a)显示巨噬细胞的f4/80免疫组织化学染色。箭头指示了一部分典型的巨噬细胞。

(b)巨噬细胞免疫组织化学染色的定量分析：与sham组相比，uir组肾间质中出现大量巨噬细胞浸润。当uir7天和uir14天时，与注射ns组相比，注射4-pba显著减轻急性肾损伤后肾间质巨噬细胞浸润。

巨噬细胞定量分析的具体数值如下：

7duir+ns组″778.6±135.0″，uir+4-pba组″400.0±61.03″

14duir+ns组″523.4±93.68″，uir+4-pba组″268.2±41.27″

(c)单核细胞趋化蛋白-1(mcp-1)和actb(起内部对照作用)的实时定量pcr分析：与sham组相比，uir组mcp-1的表达显著上升。在uir7天时，与注射ns组相比，注射4-pba未能显著降低小鼠肾组织中mcp-1的表达。但在uir14天时，与注射ns组相比，注射4-pba显著的降低了小鼠肾组织中mcp-1的表达。

mcp-1的具体数值如下：

14duir+ns组″281.9±7.342″，uir+4-pba组″177.9±28.31″

(d)白细胞介素6(il-6)和actb(起内部对照作用)的实时定量pcr分析：与sham组相比，uir组il-6的表达显著上升。在uir7天时，与注射ns组相比，注射4-pba未能显著降低小鼠肾组织中il-6的表达。在uir14天时，与注射ns组相比，注射4-pba显著的降低了小鼠肾组织中il-6的表达。

il-6的具体数值如下：

14duir+ns组″61.67±13.58″，uir+4-pba组″22.71±0.8874″

数据表示为平均值±标准误。n＝4。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；ns，无明显差异。

实施例6

c57bl/6小鼠(雄性，8-10周龄)购买自长沙斯莱克景达实验动物有限公司。进行假手术或30分钟左肾单侧局部缺血，然后再灌注。从单侧缺血再灌注的第3天开始腹腔注射4-pba20毫克/千克/天或等量的ns。在第7或14天时处死小鼠。收集肾脏组织。

测试结果见图6：体内实验证明了4-pba减轻了急性肾损伤后肾小管细胞凋亡。

(a)tunel染色的代表性图像。

(b)tunel染色阳性细胞的定量分析：与sham组相比，uir组出现大量凋亡细胞。当uir7天和uir14天时，与注射ns组相比，注射4-pba显著减轻了急性肾损伤后肾小管细胞凋亡。

tunel定量分析的具体数值如下：

7duir+ns组″60.09±6.510″，uir+4-pba组″28.86±4.531″

14duir+ns组″71.33±7.703″，uir+4-pba组″30.72±4.812″

(c)活化的半胱天冬酶12(caspase12)，活化的半胱天冬酶3(caspase3)和gapdh(加载对照)的代表性免疫印迹图像。

(d)活化的半胱天冬酶12和活化的半胱天冬酶3的免疫印迹的定量分析：与sham组相比，uir组活化的caspase3和活化的caspase12显著增高，代表细胞凋亡增加。当uir7天和uir14天时，与注射ns组相比，注射4-pba显著降低活化的caspase3和活化的caspase12含量，证明注射4-pba显著减轻急性肾损伤后肾小管细胞凋亡。

cleavedcaspase12定量分析的具体数值如下：

7duir+ns组″12.88±1.832″，uir+4-pba组″6.790±1.673″

14duir+ns组″24.61±4.748″，uir+4-pba组″7.023±1.941″

cleavedcaspase3定量分析的具体数值如下：

7duir+ns组″38.86±7.046″，uir+4-pba组″8.934±1.777″

14duir+ns组″45.69±5.337″，uir+4-pba组″10.33±2.068”

数据表示为平均值±标准误。n＝4。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；ns，无明显差异。

研究结论

这些结果表明，4-pba治疗恢复了急性肾损伤后受损的部分肾功能；改善了急性肾损伤后肾小管萎缩、肾间质纤维化、肾脏慢性炎症和小管细胞死亡。表明4-pba能延缓aki向ckd转换。