本发明涉及医药领域，特别涉及一种稀有人参皂苷的混合物及其应用。
背景技术：
癌症在全球范围内发病率高、致死率高，严重威胁到人类的健康。癌症危害之大且难以攻克，原于其自身恶性肿瘤细胞所独有的特征，即持续的血管生成、无限获取能量的生长方式、抵抗细胞凋亡、无限的复制能力、逃避免疫摧毁、组织浸润和转移等特征。其能量代谢异常受到越来越多的关注，成为肿瘤治疗的新靶点。对于细胞来说，能量主要来源于糖代谢，而葡萄糖是细胞糖代谢的主要能量来源。正常细胞在理想状态下，葡萄糖经葡萄糖转运蛋白(glut)进入细胞内，通过己糖激酶(hk)、磷酸果糖激酶(pfk)等一系列糖酵解关键酶的分解作用，生成丙酮酸，丙酮酸再进入线粒体转化为乙酰辅酶a，经过三羧酸循环氧化生成atp。但在缺氧环境下，丙酮酸无法进入线粒体转化为乙酰辅酶a，而是直接被还原为乳酸产生较少的atp。正常组织中大约有90％的atp来源于线粒体的氧化磷酸化途径，而只有10％的atp来源于糖酵解途径。与之相反的是，肿瘤细胞中大约有50％的atp是通过糖酵解途径合成的。而且即便是在有氧环境中，肿瘤细胞仍然偏好通过糖酵解途径提供能量并生成乳酸，这被称为瓦伯格效应(warburgeffect)。
由于肿瘤细胞无限增殖的能力，肿瘤细胞内部常处于缺氧的状态，而选择糖酵解通路可以提高组织细胞对缺氧的耐受性，避免氧化磷酸化诱导的细胞凋亡。其次，肿瘤细胞能够利用糖酵解通路的中间产物为合成代谢提供原料。再次，糖酵解途径导致的乳酸增加可以分解破坏肿瘤细胞周围的细胞基质，促进肿瘤细胞迁移。肿瘤细胞糖酵解增强主要是由于糖酵解关键酶的表达或者活性增强。例如己糖激酶2(hk2)、磷酸果糖酶、m2型丙酮激酶(pkm2)等糖酵解关键酶已经成为肿瘤标志物，它们的表达与活性可以影响肿瘤细胞的糖酵解，进而影响肿瘤的增殖。如果可以调节肿瘤糖酵解酶的活性，控制肿瘤的能量代谢，进而抑制肿瘤增殖，则可以有针对性的治疗恶性肿瘤。因此，近年来人们正在探求通过抑制肿瘤糖酵解通路关键酶的活性来靶向治疗肿瘤。
诸多研究报告提示，缺氧诱导因子(hypoxia-induciblefactors，hifs)是肿瘤糖代谢途径的重要调控因子，在肿瘤细胞的增殖、存活、血管发生、新陈代谢、侵袭和转移等过程中起着重要作用。目前发现缺氧诱导因子家族有3种亚型，分别是hif-1、hif-2及hif-3。其中hif-1可上调葡萄糖转运体glut、己糖激酶、醛缩酶及乳酸脱氢酶而激活糖酵解通路。缺氧诱导因子是由α亚基和β亚基组成的一种异二聚体转录因子，其中hif-1α是广泛存在于人和哺乳动物体内的一种转录因子。缺氧诱导因子与肿瘤的发生、发展关系密切。缺氧条件下，肿瘤细胞内许多基因的转录和表达发生变化，对缺氧作出应激反应，被称为缺氧反应基因(hrg)。hrg中受hif-1a调控的基因称为hif-1α的靶基因，这些靶基因的启动子或增强子内含有一个或多个缺氧反应元件(hre)，活化的hif-1与之结合，形成hif-1、p300/cbp环腺苷酸反应元件结合蛋白(creb)，以及其他转录因子的起始复合物，从而启动靶基因的转录。目前确定受hif-1α调控的hrg编码产物有60余种，包括vegf及血管内皮生长因子受体(vegfr)、腺苷酸激酶3、促红细胞生成素(epo)、诱导型一氧化氮合酶(inos)等，涉及参与肿瘤细胞的能量代谢、增殖、凋亡、转移、耐药及血管新生等多个方面。hif-1α调控糖酵解中的多个步骤。研究显示，hif-1α参与涉及葡萄糖转运、糖酵解、三羧酸循环以及谷氨酰胺基因表达的调控。细胞外葡萄糖通过葡萄糖转运蛋白1(glut1)导入细胞，其表达是由hif-1α调节。hk2，一个己糖激酶亚型和有氧糖酵解的关键调节子，为hif-1α的靶基因，可将葡萄糖磷酸化生成g-6-p。hif-1α与c-myc结合，诱导丙酸脱氢酶激酶1(pdk1)并通过阻断丙酮酸进入三羧酸循环抑制氧化磷酸化。此外，肿瘤抑制基因lkb1的损失将通过hif-1α促进癌细胞的代谢重编程。idh3异四聚体的一个亚基，即野生型异柠檬酸脱氢酶3α的沉默通过抑制hif-1α介导的瓦伯格效应和血管发生从而显著阻滞肿瘤生长。由于肿瘤内低氧的存在和基因编码的癌蛋白和肿瘤抑制基因突变的结果，hif-1α在大多数常见的癌症及其转移癌中过度表达。hif-1α高表达的恶性肿瘤大多分化差，进展快、血管生成密度高、易发生转移及复发、预后差。因此，hif-1α是肿瘤糖酵解途径的重要调控因子，可用于肿瘤治疗的一个极好的代谢靶标。
综上所述，有必要研发出一种通过降低hif-1α来治疗或预防肿瘤的药物。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种稀有人参皂苷的混合物及其应用，该稀有人参皂苷的混合物具有降低hif-1α的作用，可使包括戊糖磷酸途径在内的肿瘤糖代谢途径受到抑制，从而起到抗肿瘤作用，该稀有人参皂苷的混合物用于恶性肿瘤的预防和治疗，具有广阔的应用前景。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
第一方面，本发明提供的一种稀有人参皂苷的混合物，包括稀有人参皂苷与戊糖代谢途径抑制剂。
优选的，所述稀有人参皂苷为达玛烷型四环三萜稀有人参皂苷单体及其衍生物，所述达玛烷型四环三萜稀有人参皂苷单体及其衍生物包括稀有人参皂苷ynpd1、稀有人参皂苷ynpd2、稀有人参皂苷ynpt1、稀有人参皂苷ynpt2、稀有人参皂苷ynh2、稀有人参皂苷ynh3、稀有人参皂苷yng3、稀有人参皂苷yng5、稀有人参皂苷ynpd、稀有人参皂苷ynpt、稀有人参皂苷ynk1和稀有人参皂苷ynk2中的一种或几种；
其中，所述稀有人参皂苷ynpd1具有如下结构：
所述稀有人参皂苷ynpd2具有如下结构：
所述稀有人参皂苷ynpt1具有如下结构：
所述稀有人参皂苷ynpt2具有如下结构：
所述稀有人参皂苷ynh2具有如下结构：
所述稀有人参皂苷ynh3具有如下结构：
所述稀有人参皂苷yng3具有如下结构：
所述稀有人参皂苷yng5具有如下结构：
所述稀有人参皂苷ynpd具有如下结构：
所述稀有人参皂苷ynpt具有如下结构：
所述稀有人参皂苷ynk1具有如下结构：
所述稀有人参皂苷ynk2具有如下结构：
优选的，所述戊糖代谢途径抑制剂为6-氨基烟酰胺。
优选的，所述稀有人参皂苷与戊糖代谢途径抑制剂的摩尔数比为1～9:9～1。
第二方面，本发明提供的一种如第一方面所述的稀有人参皂苷的混合物在制备用于治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用。
优选的，所述肿瘤为恶性肿瘤、淋巴系统的造血肿瘤、骨髓系统的造血肿瘤、间质成因的肿瘤、中枢和周围神经系统的肿瘤、黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、骨肉瘤、外生性色素颈瘤、甲状腺滤囊癌和卡波氏肉瘤中的一种或几种。
进一步优选的，所述恶性肿瘤包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、头颈癌、食管癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、子宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌和皮肤癌中的一种或几种；
所述淋巴系统的造血肿瘤包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、b-细胞淋巴癌、t-细胞淋巴癌、霍奇金淋巴癌、非-霍奇金淋巴癌、毛细胞淋巴癌、外套细胞淋巴瘤、骨髓瘤和burkett’s氏淋巴癌中的一种或几种；
所述骨髓系统的造血肿瘤包括急性和慢性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征和前髓细胞性白血病中的一种或几种；
所述间质成因的肿瘤包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤中的一种或几种；
所述中枢和周围神经系统的肿瘤包括星形细胞瘤、成纤维神经瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤中的一种或几种。
优选的，所述治疗和/或预防肿瘤的药物包括稀有人参皂苷的混合物，还包括任选的药学可接受的稀释剂、载体、赋形剂、辅料、媒介物中的一种或几种。
优选的，所述治疗和/或预防肿瘤的药物的剂型为液体制剂、片剂、栓剂、颗粒剂、冲剂、胶丸、胶囊剂、缓释剂、滴丸剂、软膏剂、口崩制剂中的任意一种。
第三方面，本发明提供的一种如第一方面所述的稀有人参皂苷的混合物在制备保健品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明研究发现：在缺氧状态下，肝癌plc细胞系细胞内hif-1α(缺氧诱导因子1α)的含量升高，给予稀有人参皂苷单体(如ynpd2)后，稀有人参皂苷单体通过蛋白酶体促进缺氧诱导因子hif-1α泛素化降解；使得肿瘤细胞内的hif-1α含量降低，理论上可使包括糖酵解及戊糖磷酸途径在内的肿瘤糖代谢途径受到抑制，从而起到抗肿瘤作用。
本发明开创性地将包括稀有人参皂苷ynpd2在内的11种稀有人参皂苷单体与戊糖磷酸途径抑制剂6-氨基烟酰胺(6-an)联合应用在体外作用于人肝癌细胞系(hepg2)，稀有人参皂苷单体与戊糖磷酸途径抑制剂6-氨基烟酰胺(6-an)有显著的协同抗癌作用。因此，将具有对糖代谢通路起调控作用的稀有人参皂苷与肿瘤糖代谢途径抑制剂联合应用以增强其抗肿瘤效果，用于恶性肿瘤的治疗，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为稀有人参皂苷ynpd2(d2)降低缺氧条件下hif-1α含量的示意图；
图2为稀有人参皂苷ynpd2(d2)促进hif-1α降解的示意图；
图3为稀有人参皂苷ynpd2(d2)通过蛋白酶体促进hif-1α降解的示意图；
图4为稀有人参皂苷ynpd2(d2)通过泛素化促进hif-1α降解的示意图；
图5为加样的示意图；
图6为a组的稀有人参皂苷ynpd2(d2)的src染色结果以及ci值的检测结果；
图7为b组的稀有人参皂苷ynpd2(d2)的src染色结果以及ci值的检测结果；
图8为c组的稀有人参皂苷ynpd2(d2)的src染色结果以及ci值的检测结果；
图9为d组的稀有人参皂苷ynpd2(d2)的src染色结果以及ci值的检测结果；
图10为稀有人参皂苷ynpd1(d1)的src染色结果以及ci值的检测结果；
图11为稀有人参皂苷ynpt1(t1)的src染色结果以及ci值的检测结果；
图12为稀有人参皂苷yng3(rg3)的src染色结果以及ci值的检测结果；
图13为稀有人参皂苷ynk1(k1)的src染色结果以及ci值的检测结果；
图14为稀有人参皂苷ynh3(h3)的src染色结果以及ci值的检测结果；
图15为稀有人参皂苷ynh2(h2)的src染色结果以及ci值的检测结果；
图16为稀有人参皂苷ynpd(pd)的src染色结果以及ci值的检测结果；
图17为稀有人参皂苷ynpt(pt)的src染色结果以及ci值的检测结果；
图18为稀有人参皂苷yng5(rg5)的src染色结果以及ci值的检测结果；
图19为稀有人参皂苷ynpt2(t2)的src染色结果以及ci值的检测结果；
图20为稀有人参皂苷ynpd2(d2)的src染色结果以及ci值的检测结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
第一方面，本发明提供的一种稀有人参皂苷的混合物，包括稀有人参皂苷与戊糖代谢途径抑制剂。
在本发明实施方式中，所述稀有人参皂苷为达玛烷型四环三萜稀有人参皂苷单体及其衍生物，所述达玛烷型四环三萜稀有人参皂苷单体及其衍生物选自稀有人参皂苷ynpd1、稀有人参皂苷ynpd2、稀有人参皂苷ynpt1、稀有人参皂苷ynpt2、稀有人参皂苷ynh2、稀有人参皂苷ynh3、稀有人参皂苷yng3、稀有人参皂苷yng5、稀有人参皂苷ynpd、稀有人参皂苷ynpt、稀有人参皂苷ynk1和稀有人参皂苷ynk2中的一种或几种；
其中，其中，所述稀有人参皂苷ynpd1具有如下结构：
所述稀有人参皂苷ynpd2具有如下结构：
所述稀有人参皂苷ynpt1具有如下结构：
所述稀有人参皂苷ynpt2具有如下结构：
所述稀有人参皂苷ynh2具有如下结构：
所述稀有人参皂苷ynh3具有如下结构：
所述稀有人参皂苷yng3具有如下结构：
所述稀有人参皂苷yng5具有如下结构：
所述稀有人参皂苷ynpd具有如下结构：
所述稀有人参皂苷ynpt具有如下结构：
所述稀有人参皂苷ynk1具有如下结构：
所述稀有人参皂苷ynk2具有如下结构：
在本发明实施方式中，所述戊糖代谢途径抑制剂为6-氨基烟酰胺。
在本发明实施方式中，所述稀有人参皂苷与戊糖代谢途径抑制剂的的摩尔数比1～9:9～1。
进一步地，在该实施方式中，所述稀有人参皂苷与戊糖代谢途径抑制剂的的摩尔数比1～3:3～1。
更进一步的，在该实施方式中，所述稀有人参皂苷与戊糖代谢途径抑制剂的的摩尔数比1:1。
第二方面，本发明提供的一种如第一方面所述的稀有人参皂苷的混合物在制备用于治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用。
在本发明实施方式中，所述肿瘤为恶性肿瘤、淋巴系统的造血肿瘤、骨髓系统的造血肿瘤、间质成因的肿瘤、中枢和周围神经系统的肿瘤、黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、骨肉瘤、外生性色素颈瘤、甲状腺滤囊癌和卡波氏肉瘤中的一种或几种；
进一步地，在该实施方式中，所述恶性肿瘤包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、头颈癌、食管癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、子宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌和皮肤癌中的一种或几种；
所述淋巴系统的造血肿瘤包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、b-细胞淋巴癌、t-细胞淋巴癌、霍奇金淋巴癌、非-霍奇金淋巴癌、毛细胞淋巴癌、外套细胞淋巴瘤、骨髓瘤和burkett’s氏淋巴癌中的一种或几种；
所述骨髓系统的造血肿瘤包括急性和慢性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征和前髓细胞性白血病中的一种或几种；
所述间质成因的肿瘤包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤中的一种或几种；
所述中枢和周围神经系统的肿瘤包括星形细胞瘤、成纤维神经瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤中的一种或几种。
在本发明实施方式中，所述治疗和/或预防肿瘤的药物包括稀有人参皂苷的混合物，还包括任选的药学可接受的稀释剂、载体、赋形剂、辅料、媒介物中的一种或几种。
进一步地，在该实施方式中，所述辅料包括防腐剂、湿润剂、乳化剂、分散剂、抗菌剂、等渗剂、悬浮剂中的一种或几种。
更进一步地，在该实施方式中，所述抗菌剂包括但不限于尼泊金酯类、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸中的一种或几种。可确保防止微生物的作用。
更进一步地，在该实施方式中，所述等渗剂包括但不限于糖类、氯化钠中的一种或几种。
更进一步地，在该实施方式中，所述悬浮剂包括但不限于单硬脂酸铝、明胶中的一种或几种，可达到延长药物吸收的效果。
在本发明一实施方式中，所述治疗和/或预防肿瘤的药物的剂型为口服剂型、注射剂型和局部用药剂型中的中的任意一种。
进一步地，在该实施方式中，所述口服剂型为片剂、丸剂、粉剂、悬浊液、乳浊液、胶囊剂、颗粒剂、糖衣丸剂、药丸、溶液剂、醑剂和糖浆剂中的任意一种。
本发明所述片剂、糖衣丸剂(dragees)、胶囊剂、丸剂和颗粒剂为固体剂型，可与包衣和壳料如肠溶衣材和医药制剂领域公知的其它衣材一起制备。所述固体剂型可任选含有遮光剂，且其组成还可只是或优先地在肠道的某个部位任选以延迟方式释放活性成分；所述固体剂型可以使用包括高分子物质和蜡类的包埋组合物。如果适合，所述稀有人参皂苷的混合物也可与所述赋形剂配成微囊形式。
进一步地，在该实施方式中，所述注射剂型包括水剂、悬浊液和溶液中的任意一种。
进一步地，在该实施方式中，所述局部用药剂型包括软膏、固体、悬浊液、水剂、醑剂、粉剂、糊剂、栓剂、气溶胶、泥敷剂、涂抹剂、洗剂、灌肠剂和乳剂中的任意一种。
供直肠或阴道给药的组合物优选是栓剂。栓剂可通过将本发明化合物与合适的非刺激性赋形剂或载体例如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合来制备，它们在室温下为固体，但在体温下则为液体，因此可在直肠腔或阴道腔内熔化而释放出活性化合物。
第三方面，本发明提供的一种如第一方面所述的稀有人参皂苷的混合物在制备保健品中的用途。
在本发明实施方式中，所述保健品包括稀有人参皂苷的混合物及保健品中可接受的载体。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1稀有人参皂苷ynpd2促进hif-1α(缺氧诱导因子1α)泛素化降解抗缺氧的研究
1、细胞处理
生长状态良好的肝癌plc细胞接种至96孔细胞培养板中，置于co2培养箱37℃培养。次日，待细胞达到70-80％汇合度时，进行加药处理，加药后将培养板放回培养箱37℃培养。本试验分4组，即对照组、低氧(hypoxiα)组、稀有人参皂苷ynpd2+低氧(hypoxiα)组。具体方法如下：对照组不做处理，每1-2天更换培养液一次；低氧组在培养基中加入150μm氯化钴溶液模拟缺氧环境；ynpd2+低氧组，在培养基中同时加入150μm氯化钴溶液和40μm稀有人参皂苷ynpd2溶液。
2、蛋白的提取
依照细胞蛋白抽提试剂盒说明书进行蛋白提取：细胞进行胰酶消化后，收集悬液，800rpm离心5分钟；pbs(磷酸缓冲盐溶液)洗涤细胞一次，离心后弃上清；细胞沉淀中加入ripα冰上裂解30分钟，10000rpm离心5分钟，取上清液按1:1加入2倍上样缓冲液，100℃煮样5分钟，进行westernblot(蛋白质免疫印迹)检测。
3、westernblot检测
①sds-pαge电泳：配制12％分离胶和4％浓缩胶，上样，进行sds-pαge电泳(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)，浓缩胶电压180v，分离胶电压220v，至溴酚蓝跑到下缘1cm处停止。
②转膜：将蛋白胶根据预染mαrker条带切下含有目的条带的部分，并按照胶块大小剪出同等大小pvdf膜(聚偏二氟乙烯膜)和滤纸，pvdf膜甲醇活化后同滤纸、海绵一起用转膜液浸湿在转膜夹负极一侧依次铺上：海绵、四层滤纸、胶块、pvdf膜、四层滤纸、海绵，过程中尽量排尽气泡，然后置于印迹槽中，150mα恒流，在冰浴中转膜1h。
③封闭：pvdf膜转移至杂交袋中，加入封闭液，置于摇床上，室温封闭1h或4℃封闭过夜。
④一抗孵育：用封闭液配制hif-1α一抗，室温振摇孵育1h或4℃过夜。
⑤洗膜：1×tbst缓冲溶液洗膜，5min/次，洗5次。
⑥二抗孵育：封闭液配制相应种属的二抗，室温振摇孵育1h。
⑦洗膜：1×tbst缓冲溶液洗膜，5min/次，洗5次。
⑧曝光：将辣根过氧物酶α、b底物按1:1混合，在暗盒内平铺一层保鲜膜，加上发光底物，覆上pvdf膜，膜上再滴加发光底物，盖上上层保鲜膜，于pvdf膜的位置覆盖上相应大小胶片，关闭暗盒曝光数分钟，取出胶片置于显影液内显影，清水冲洗，再置于定影液，最后用清水冲洗胶片晾干。
4、实验结果
①肿瘤组织内部缺氧是肿瘤细胞产生耐药、血管生成及启动戊糖代谢途径的重要原因之一。细胞缺氧可致缺氧诱导因子1α(hif-1α)含量升高。如图1中的实验结果显示，缺氧状态下，肝癌plc细胞内hif-1α的含量明显升高，给予稀有人参皂苷ynpd2后，hif-1α含量下降，从而缓解肿瘤缺氧的微环境。
5、为进一步确定hif-1α蛋白含量的减少是由合成减少引起还是由降解引起，我们使用蛋白合成抑制剂放线菌酮chx抑制蛋白合成。在培养基中加入的chx终浓度为20μg/ml。chx事先用dmso配制使用浓度1000倍母液，使用时加入培养基体积1/1000体积的母液即可。结果如图2所示，在缺氧条件下，稀有人参皂苷ynpd2仍然可以降低细胞内hif-1α的含量。结果提示，细胞内hif-1α的含量降低是通过稀有人参皂苷ynpd2促进hif-1α的降解引起的。
6、为了进一步确定稀有人参皂苷ynpd2促进hif-1α降解的具体机制，我们使用蛋白酶体抑制剂mg132处理细胞。在培养基中加入的mg132终浓度为5μm。mg132事先用dmso配制使用浓度1000倍母液，使用时加入培养基体积1/1000体积的母液即可。如图3中的结果显示，经蛋白酶体抑制剂mg132处理细胞后，hif-1α蛋白降解现象消失，表明ynpd2通过蛋白酶体促进hif-1α降解。
7、在缺氧条件下，采用蛋白酶体抑制剂mg132处理细胞。在培养基中加入的mg132终浓度为5μm。mg132事先用dmso配制使用浓度1000倍母液，使用时加入培养基体积1/1000体积的母液即可。coip实验结果显示，ynpd2处理组细胞内hif-1α蛋白结合的泛素明显增多，这说明ynpd2是通过促进hif-1α泛素化从而促进其在细胞内降解。
实施例2稀有人参皂苷单体对肿瘤糖代谢具有调节作用
1、材料和仪器
(1)人肝癌细胞系
hepg2(人肝癌细胞系)：购自南京凯基生物科技发展有限公司。
(2)供试品
11种稀有人参皂苷(ynpd1、ynpd2、ynpt1、ynpt2、ynh2、ynh3、yng3、yng5、ynpd、ynpt和ynk1)由加拿大皇家以诺植物药有限公司提供。
(3)实验试剂
二甲基亚砜(dmso)细胞培养级：购自北京索莱宝科技有限公司，货号：d8370-500，批号：2p005970，级别：细胞培养级，规格500ml，用于细胞冻存，及药物配制。
dmem培养基(低糖)：购自赛默飞世尔科技有限公司，hyclone品牌，货号：11885092，规格：500ml。
dmem培养基(无糖)：购自invitrogen，货号：11885-084，规格：500ml。
胰蛋白酶：购自上海生工生物工程有限公司，货号：t0458-10，批号：0301c314，级别：usp，规格：10g。
三氯醋酸：购自阿拉丁，货号：t131572，规格：100ml。
srb(磺酰罗丹明b)：购自上海生工，货号：α100278，规格：100g。
tris(三羟甲基氨基甲烷)：购自上海生工，货号：c506033，规格：250ml。
6-αn(6-氨基烟酰胺)：购自sigmα，货号：α68203，规格：1g。
(4)仪器耗材
生物安全柜：西班牙泰事达(telstαr)，型号：bioiiα；
co2培养箱：施都凯仪器设备(上海)有限公司，型号：stikil-161hi；
96孔板：购自赛默飞世尔科技有限公司，thermonunc品牌，货号167008；
全自动酶联免疫检测仪：赛默飞世尔科技有限公司，型号multiscαnfc。
台盼蓝：购自碧云天生物技术研究所，货号st798-1g。
2、药物及试剂的配制
(1)稀有人参皂苷溶液的配制：分别称取11种稀有人参皂苷单体，分别溶于1ml的pbs溶液中，配制成1mm/ml溶液，待其充分溶解后，用0.22μm滤膜过滤除菌后使用，每次使用时现用现配。使用时用细胞培养基稀释至所需浓度。溶液的配制及使用均应在无菌生物安全柜中操作。
(2)细胞消化液的配制：称取胰蛋白酶0.25g，edtα(乙二胺四乙酸)0.02g，加入100mlpbs中4℃冰浴，低速搅拌，调ph至7.4，0.22μm的滤膜过滤，分装于离心管中，保存于-20℃冰箱，4℃保存溶液应在短期内用完。
(3)srb染料：以1％的乙酸稀释srb粉末，至浓度为0.4％。
(4)台盼蓝储液的配制：称取台盼蓝粉末4g溶于100ml的pbs中，配制成4％的储液，待其充分溶解后，过滤。分装后保存于4℃冰箱中。使用时稀释至0.4％即可。
3、实验方法
(1)srb染色：
①胰蛋白酶消化后收集细胞，用移液管吹打均匀，取两滴细胞悬液台盼蓝染色，于显微镜下计数活细胞数目(死细胞数目不得超过5％)，用完全培养液调整细胞数目至1×105个细胞。本发明的完全培养液即正常培养细胞的培养基，由基础培养基和10％胎牛血清组成。
②于96孔细胞培养板中每孔加入100μl细胞悬液，将培养板置于co2培养箱中培养24h，取出培养板后于每孔中加入不同浓度的待测样品的完全培养液，每个浓度设3个平行孔，另设1行细胞加入不含药完全培养液作正常对照孔(c)。
③加药完成后，吸出空白孔中培养液，去离子水洗5遍。培养板于微孔板振荡器上振荡混匀，置于co2培养箱中继续培养48h。
④取出培养板，在培养液表面每孔轻轻加入50μl预冷的50％的三氯醋酸(tcα)固定，静置5分钟后，再将培养板移至4度放置1h。
⑤倒掉固定液，每孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。每孔加入100μlsrb液，在室温放置10分钟，未与蛋白质结合的srb用1％醋酸洗5遍，空气干燥。结合的srb用150μl10mmol/l非缓冲tris碱液(ph10.5)振荡溶解。
⑥于酶标仪测定各孔光吸收，测定波长为540nm。根据各孔od值计算药物对细胞增殖抑制率，microsoftexcel7.0统计分析软件计算药物的ic50。
(2)稀有人参皂苷ynpd2与戊糖磷酸途径抑制剂6-αn联用：
在低糖(普通培养基含糖量的50％)和无糖条件下(由于体内肿瘤细胞处于环境胁迫条件下，特别是能源物质不足，故在低糖或无糖条件下更能模拟体内环境)，使用hepg2细胞(经对人肝癌、肺癌、乳腺癌与结肠癌多种细胞系筛选，结果显示稀有人参皂苷单体联合戊糖磷酸途径抑制剂对肝癌细胞系抑制作用强，其中对hepg2细胞系抑制作用最强，故选取hepg2细胞系进行后续实验)，检测了稀有人参皂苷ynpd2与戊糖磷酸途径抑制剂6-αn联用的效果。共做了6大组实验：
α.正常培养基换为低糖培养基后马上加入药物；
b.低糖培养基预先培养6h后加入药物；
c.低糖培养基预先培养12h后加入药物；
d.正常培养基换为无糖培养基后马上加入药物；
e.无糖培养基预先培养6h后加入药物；
f.无糖培养基预先培养12h后加入药物。
以上每组分为3小组：1.单独ynpd2作用；2.单独6-αn作用；3.ynpd2与6-αn共同作用。使用compusyn计算协同系数(其中2组和3组6-αn的加药时间为加入d2后6h的结果)。使用compusyn软件分析结果，计算两种药物的联合指数ci值。具体加药浓度如图5所示。
4、实验结果
表1协同结果
如表1及图6～9所示，无糖培养或低糖长时间培养会引起细胞大量死亡，无法获得有效数据。本实验采用α组实验条件模拟体内环境。
α组：正常培养基换为低糖培养基后马上加入稀有人参皂苷ynpd2，6h后加入6-αn，培养24h后固定细胞，srb染色后酶标仪检测吸光度。由表1和图6可知，在实验使用的7个浓度作用下，稀有人参皂苷ynpd2和抑制剂6-αn的联合指数ci值均小于1，说明二者具有协同作用。
b组：低糖培养基预先培养6h后加入稀有人参皂苷ynpd2，6h后加入6-αn，继续培养24h。由表1和图7可知，在实验使用的7个浓度作用下，稀有人参皂苷ynpd2和抑制剂6-αn的联合指数ci值均小于1，说明二者具有协同作用。但协同效果不如α组明显。
c组：低糖培养基预先培养12h后加入稀有人参皂苷ynpd2，6h后加入6-αn，继续培养24h。由表1和图8可知，结果显示ynpd2与6-αn不具备协同作用(细胞在低糖环境下连续培养了36h，包括对照组细胞在内的所有细胞状态不佳，影响了检测结果，无法获得有效数据)
d组：正常培养基换为无糖培养基后马上加入ynpd2，6h后加入6-αn，培养24h。由表1和图9可知，长时间无糖培养，使得细胞状态不佳，数据较为混乱，无法获得ci值，没有意义。
e、f组：无糖培养基预先培养6h后加入稀有人参皂苷d2，6h后加入6-αn组和无糖培养基预先培养12h后加入稀有人参皂苷d2，6h后加入6-αn组，细胞无法在无糖条件下长时间存活，无法进行检测。
实施例3
为了进一步说明本发明的有益效果，对11种稀有人参皂苷与戊糖磷酸途径抑制剂6-αn联用对肿瘤糖代谢具有调节作用进行试验。具体地，使用上述实验确定的实验条件，将实验分为6个大组：
a.正常培养基换为低糖培养基后马上加入药物；
b.低糖培养基预先培养6h后加入药物；
c.低糖培养基预先培养12h后加入药物；
d.正常培养基换为无糖培养基后马上加入药物；
e.无糖培养基预先培养6h后加入药物；
f.无糖培养基预先培养12h后加入药物。
以上每组分为3小组：1.单独稀有人参皂苷作用；2.单独6-an作用；3.稀有人参皂苷与6-an共同作用，将11种稀有人参皂苷分别与戊糖磷酸途径抑制剂联用。具体地：低糖培养基加入稀有人参皂苷，6h后加入6-an，培养24h后固定细胞，srb染色后酶标仪检测吸光度。使用compusyn软件计算两种药物的联用指数，结果显示：yng5、ynpd1和ynpd与抑制剂协同作用最为明显。具体结果如表2及图10～20所示。
表211种稀有人参皂苷的ic50值及其协同结果
由表2及图10～20可知，本发明通过dαvid和kegg数据库分析稀有人参皂苷对hif-1α调控增殖、侵袭、凋亡相关的通路及糖酵解、三羧酸循环、戊糖磷酸途径等糖代谢通路的影响，结果显示稀有人参皂苷单体可明显抑制肿瘤细胞戊糖磷酸途径的关键酶。将11种稀有人参皂苷分别与戊糖磷酸途径抑制剂6-氨基烟酰胺(6-αn)联合使用，均有显著的协同作用。
以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。