本发明涉及胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球材料，本发明还涉及这种cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球材料的制备方法，这种cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球材料可应用于癌症的光热治疗和免疫治疗的联合治疗。
背景技术：
近年来，纳米材料的制备以及在癌症治疗中的应用引起了广泛关注。金纳米材料由于具有良好的生物相容性和低毒性，表面易修饰，并且具有诊断和光热性质，成为癌症治疗研究中常用的纳米材料。金纳米材料的一些应用已经处于临床试验阶段中。金纳米材料包括金纳米棒、金纳米笼、实心金纳米粒子以及空心金纳米球(hgns)等。hgns作为一种新型的金纳米材料，形貌类似球体，相比较金纳米棒，具有更规整的形态，更利于传递和透过细胞膜；且比金纳米笼的制备方法简单；与实心金纳米粒子相比较具有更高的比表面积，并且表面等离子体共振吸收可调节到近红外波段，显示出表面增强的拉曼散射(sers)，在光热消融(pta)治疗中，近红外光可以渗透到组织深处，对于正常组织具有减弱的副作用。
但是空心金纳米球介导的光热治疗只能消除原发部位的局部肿瘤，不能有效的控制转移性肿瘤。理想的癌症疗法不仅能消除原发肿瘤，而且还能诱导全身抗肿瘤免疫，治疗远端转移的肿瘤。目前，最有潜力的策略是将光热治疗与免疫治疗联合。肿瘤细胞自身不能有效的诱导免疫应答，为此，我们利用可用于癌症免疫治疗的免疫佐剂来增强抗原呈递细胞的摄取和呈递，从而诱导有效的免疫应答。
已经证明含有非甲基化胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)基序的寡脱氧核苷酸(odns)是先天免疫系统的有效刺激剂，其侧翼为5ˊ嘌呤和3ˊ嘧啶，有潜力引发强烈的细胞免疫反应和体液免疫反应。这些序列在抗原呈递细胞(apc)中结合toll样受体9(tlr9)，从而促进如肿瘤坏死因子-α(tnf-α)，白介素-6(il-6)，白介素-12(il-12)等炎症细胞因子的表达和cd8+t细胞应答，并且这些序列对巨噬细胞和骨髓来源的抑制细胞(mdsc)具有重要作用。然而cpgodns刺激细胞反应的主要渠道是细胞摄取，但是单独的odns的水溶性和稳定性较差，很难透过细胞膜，而且易被血清和细胞质中的核酸酶清除，这大大的阻碍了odns的免疫应用。据报道，硫醇化的cpgodns可以在金纳米粒子表面进行自组装，这些功能化的纳米材料在生理环境中高度稳定，抗核酸酶降解，可以增加cpgodns的递送能力和增强cpgodns的免疫刺激作用。
因此，我们利用hgns作为cpgodns的载体，硫醇化的cpgodns在hgns的表面通过au-s键形成自组装单层，这种cpg修饰的空心金纳米球可以同时发挥光热消融作用和免疫刺激作用，实现光热治疗和免疫治疗的联合治疗。
技术实现要素：
作为第一方面，本发明的第一个目的是提供cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球材料。它不仅能消除原发肿瘤，而且还能诱导全身抗肿瘤免疫，治疗远端转移的肿瘤。空心金纳米球的表面等离子体共振吸收可调节到近红外波段，近红外光可以渗透到组织深处。cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球通过增强渗透滞留(epr)效应到达肿瘤组织，用近红外光照射肿瘤部位，空心金纳米球的光热效应消融原发肿瘤，在原位生成肿瘤相关抗原。在肿瘤相关抗原和cpg寡脱氧核苷酸的双重作用下，激活树突细胞(dc)以增加对肿瘤特异性t细胞的刺激来促进转移肿瘤的消退。
本发明的第二个目的是提供上述cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球材料的制备方法。
本发明cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球材料是发明人通过大量的实验经对比筛选总结出来的。首先用硼氢化钠还原氯化钴，得到钴纳米粒子，然后以钴纳米粒子还原氯金酸，制备空心金纳米球。然后在空心金纳米球溶液中加入cpg寡脱氧核苷酸、表面活性剂以及缓冲液，振荡培养，得到cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球材料。
在上述技术方案中，所述原料组分的浓度为：空心金纳米球5.0×10-9～0.1mol/l，cpg寡脱氧核苷酸1.0×10-8～1.0mol/l，表面活性剂1.0×10-5～1.0mol/l，缓冲液(ph6.0～8.5)5.0×10-3～1.0mol/l。
作为第二个方面，在上述技术方案中，所述的空心金纳米球溶液的具体制备方法为：
步骤101，将20～1000ml水及1.0×10-2～2.0mol/l柠檬酸盐溶液和5.0×10-2～10.0mol/l氯化钴溶液混合制备混合液；将上述混合液在氩气中进行脱氧，至少1分钟，并向上述混合液中快速加入制备的1.0×10-2～6.0mol/l硼氢化钠，同时持续进行振荡；
步骤102，待振荡反应1～60分钟后注入1.0×10-3～2.0mol/l柠檬酸溶液，持续进行振荡；
步骤103，振荡反应至少进行1分钟后，将钴溶液移至进行脱氧操作的1.0×10-4～1.0mol/l氯金酸溶液中，继续在氩气流中进行振荡至少1分钟；
步骤104，停止脱氧，以至少1000g的离心力离心至少1分钟得到空心金纳米球材料，并制成所述空心金纳米球溶液。
作为第三个方面，在上述技术方案中，所述的cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球的具体制备方法，包括以下步骤：
步骤201，将1.0×10-8～1.0mol/lcpg寡脱氧核苷酸加入到5.0×10-9～0.1mol/l空心金纳米球溶液中，将混合物在一定温度(0～30℃)中持续轻微振荡1小时以上；
步骤202，将混合物中加入1.0×10-5～1.0mol/l表面活性剂和5.0×10-3～1.0mol/l缓冲液(ph6.0～8.5)，进一步恒温(0～30℃)振荡培养1小时以上；
步骤203，混合物以至少1000g的离心力离心，上清液倾析及用5.0×10-3～1.0mol/l缓冲液(ph6.0～8.5)进行冲洗，重复多次除去未结合的cpg寡脱氧核苷酸，得到cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球。
上述技术方案中，所述的氯化钴溶液为下述氯化钴化合物中的一种或几种制备而成：①氯化钴·六水合物(分子量237.93)；②无水氯化钴(分子量129.84)。
上述技术方案中，所述的氯金酸溶液为下述氯金酸化合物中的一种或几种制备而成：①氯金酸·四水合物(分子量411.85)；②氯金酸·三水合物(分子量393.85)；③氯金酸钠·二水合物(分子量397.8)。
上述技术方案中，所述的柠檬酸溶液为下述柠檬酸化合物中的一种或几种制备而成：①柠檬酸·一水合物(分子量210.14)；②无水柠檬酸(分子量192.13)；③柠檬酸·二水合物(分子量228.14)。
上述技术方案中，所述的柠檬酸盐溶液为下述柠檬酸盐中的一种或几种制备而成：①柠檬酸三钠·二水合物(分子量294.1)；②柠檬酸三钾·一水合物(分子量324.41)；③柠檬酸三铵(分子量243.22)；④柠檬酸钙·四水合物(分子量570.49)；⑤无水柠檬酸钠(分子量258.07)；⑥柠檬酸铁(分子量244.94)；⑦柠檬酸镁·十四水合物(分子量703.4)；⑧柠檬酸镁(分子量451.11)；⑨柠檬酸铜(分子量360.22)；⑩柠檬酸锌(分子量574.37)。
上述技术方案中，所述的cpg寡脱氧核苷酸为下述硫醇化的cpg寡脱氧核苷酸序列中的一种或几种：
(1)cpg1826(5′-tccatgacgttcctgacgtt-sh-3′)；
(2)cpg-t20(5′-tccatgacgttcctgacgtt-t20-sh-3′)；
(3)bi-cpg(5′-tccatgacgttcctgacgtttccatgacgttcctgacgtt-sh-3′)；
(4)cpgt8(5′-tcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcg-sh-3′)；
(5)cpg1(5′-acgcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgt-sh-3′)；
(6)cpg2(5′-tcgtcgatcgatcgacgagggggg–sh-3′)；
(7)cpg3(5′-tgtgcatcgatgcagggggg-sh-3′)；
(8)cpg4(5′-tcgacaacgttaacgtcgtt-sh-3′)；
(9)cpg5(5′-acgacgacgacgacgacgtt-sh-3′)；
(10)cpg6(5′-gacgttcgaacgtagacgtt-sh-3′)；
(11)cpg7(5′-acgtcgacgtcgacgtcgacgtcg-sh-3′)；
(12)cpg8(5′-tcgtcgtcgtcgacgacgacgacg-sh-3′)；
(13)cpg9(5′-tcgcgatcgtcgtcgtcgacgcgt-sh-3′)；
(14)cpg10(5′-ttttcatcgatgcagcgcgc-sh-3′)；
(15)cpg11(5′-tcctccgtcgttttgtcgtt-sh-3′)；
(16)cpg12(5′-gtcgtcgtcgtcgtcgtccgcgcg-sh-3′)；
(17)cpg13(5′-tcggtcgttttgtcgttgcgcgc-sh-3′)；
(18)cpg14(5′-tcggtcgttgtcgtcgcgcgc-sh-3′)；
(19)cpg15(5′-ggtgcatcgatgcagggggg-sh-3′)；
(20)cpg16(5′-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-sh-3′)；
(21)cpg17(5′-tgctgcttttgtgcttttgtgctt-sh-3′)；
(22)cpg1911(5′-tccaggactttcctcaggt-sh-3′)；
(23)cpg2216(5′-gggggacgatcgtcgggggg-sh-3′)；
(24)cpgm362(5′-tcgtcgtcgttcgaacgacgttgat-sh-3′)；
(25)cpgm383(5′-tgctgctgcttgcaagcagcttgat-sh-3′)；
(26)cpg2006(5′-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-sh-3′)；
(27)cpg1585(5′-ggggtcaacgttgagggggg-sh-3′)；
(28)cpg2118(5′-ggggtcaagcttgagggggg-sh-3′)；
(29)cpg2197(5′-gmggtcaacgttgagggmggg-sh-3′)；
(30)cpg2198(5′-ggggagttcgttgagggggg-sh-3′)；
(31)cpg2204(5′-ggggtcatcgatgagggggg-sh-3′)；
(32)cpg2216(5′-gggggacgatcgtcgggggg-sh-3′)；
(33)cpg2243(5′-gggggagcatgctcgggggg-sh-3′)；
(34)cpg2217(5′-gggggtcgtacgacgggggg-sh-3′)。
上述技术方案中，所述的表面活性剂为下述表面活性剂化合物中的一种或几种制备而成：①十二烷基硫酸钠(分子量288.38)；②烷基多苷(分子量320.22)。
在上述技术方案中，所述缓冲液(ph6.0～8.5)为氯化钠、氯化钾、柠檬酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、氢氧化钠中的一种或多种在室温下的均匀混合物。
cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球材料的制备方法，还包括如下步骤：以硼氢化钠还原钴离子，得到钴纳米粒子，然后以钴纳米粒子还原氯金酸，制备空心金纳米球。然后在空心金纳米球溶液中加入cpg寡脱氧核苷酸、表面活性剂以及缓冲液，振荡培养，得到cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球材料。
有益效果：
本发明cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球材料具有如下特点：①此cpg功能化的纳米材料具有高负载量的寡脱氧核苷酸，并具有低毒性、良好的生物相容性；②cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球材料具有近红外等离子体共振吸收效应，能发挥光热治疗的作用；③cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球材料可通过增强渗透滞留(epr)效应到达肿瘤组织，具有增强cpg寡脱氧核苷酸摄取能力；④cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球材料的近红外光热效应能够消融原发肿瘤，在原位生成肿瘤相关抗原，在cpg寡脱氧核苷酸的促进下，激活树突细胞(dc)以增加对肿瘤特异性t细胞的刺激来促进转移肿瘤的消退。
附图说明
图1是胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)寡脱氧核苷酸(odns)修饰的空心金纳米球(hgns)的合成流程示意图。
图2是cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球(cpg-hgns)的透射电镜图。
图3是cpgodns和cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球(cpg-hgns)分别与raw264.7细胞共培养24小时后的细胞毒性实验结果。
图4是含有hgns的溶液在808nm激光器照射10分钟时的温度变化图。
图5是cy5标记的cpg-hgns和cy5标记的cpgodns分别与raw264.7细胞共培养后的共聚焦激光扫描显微镜图；其中(a)为与cpg-hgns培养的raw264.7细胞核染色荧光图，(b)为cy5标记的cpg-hgns染色荧光图，(c)为raw264.7细胞核染色荧光图与cy5标记的cpg-hgns染色荧光图的叠合图，(d)为cpgodns培养的raw264.7细胞核染色荧光图，(b)为cy5标记的cpgodns染色荧光图，(c)为raw264.7细胞核染色荧光图与cy5标记的cpgodns染色荧光图的叠合图。
图6是骨髓树突细胞(mdcs)与4t1乳腺肿瘤细胞、hgns、cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球(cpg-hgns)近红外光热(laser)消融4t1乳腺肿瘤细胞的残留物共培养12小时后的成熟情况图。
具体实施方式
下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的部分实施例。
为了进一步了解本发明，下面结合实施例对本发明的实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明专利要求的限制。
tem实验：
本实验所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。为了直观地观察cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球的形貌和大小，我们选择一实例得到的功能化纳米材料作为观察对象。cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球样品用双蒸水的1％磷钨酸预处理，然后将样品置于格栅上，在室温下干燥，并通过tem(jem-2100(hr)，200kv)成像。
功能化的纳米材料的细胞毒性实验
通过mtt法测定cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球(cpg-hgns)对raw264.7细胞的体外细胞毒性。将100μldmem培养基中的细胞稀释，然后直接接种在96孔板的孔中，37℃孵育24小时。然后吸出废液，用100μl含有特定试剂的新鲜培养基，其中含有不同浓度的cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球(2.5×10-6μmol/ml,5.0×10-6μmol/ml)以及5.0×10-6μmol/ml的游离cpg。将细胞与特异性试剂在37℃下共温育24小时。然后弃去培养基并用100μl新鲜培养基代替，在每孔中加入20μlmtt，然后在37℃下孵育4小时。此后，小心地除去上清液，并在每孔中加入200μldmso。使用酶标仪(bio-rad550)在570nm处测定溶液的吸光度以确定od值。细胞活性计算如下：
细胞活性＝od加材料/od对照×100％
其中od加材料表示由特定试剂处理过的细胞获得的od值，od对照表示没有经过任何处理的细胞获得的od值。
空心金纳米球的光热实验
检测空心金纳米球的光热效应。通过808nm激光以3wcm-2的功率密度照射空心金纳米球的悬浮液。将激光探针放置在含有hgns溶液的试管上以诱导释放行为，以悬浮液的温度作为照射时间的函数。用激光照射预定时间间隔的制剂,照射悬浮液2,4,6,8,10分钟,记录样品温度随照射时间的变化。其中用水样作为对照组。
功能化的纳米材料的细胞摄取实验：
通过共聚焦激光扫描显微镜观察cy5标记的cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球(cpg-hgns)的细胞摄取情况。在含有10％fbs的1ml培养基中的raw264.7细胞接种在玻璃底培养皿中，37℃孵育24小时。然后除去培养基，并用pbs缓冲溶液洗涤细胞3次，再加入1ml含有特定试剂(cy5标记的cpgodns和cy5标记的cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球(cy5-cpg-hgns)的新鲜培养基(10％fbs)。在37℃下共培养4小时后，用pbs缓冲溶液仔细洗涤细胞多次以除去未被细胞摄取的试剂，温育12分钟。然后细胞用pbs缓冲溶液洗涤三次，再用3％多聚甲醛固定，温育13分钟。之后细胞核使用3μg/mlhoechst33342(molecularprobes)染色,最后用pbs缓冲溶液洗涤三次去除多余的染料。通过共聚焦激光扫描显微镜(nikonni-ec2+)在400倍放大下观察细胞。
体外树突细胞刺激实验：
使用transwell共培养系统将经hgns或cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球(cpg-hgns)光热消融4t1乳腺肿瘤细胞后的残余物加入到mdcs中培养12小时。mdcs用anti-cd11cfitc，anti-cd86pe和anti-cd80apc染色，然后通过流式细胞仪(bdfacscalibur)分选。
实验结果:
1)tem实验
通过透射电子显微镜观察的cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球的形貌和大小结果见图2。
从图2可以清晰地看到cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球的中空和薄壁结构，核尺寸较小，金壳完整存在，这说明自组装的cpg没有影响空心金纳米球的形貌，且功能化的纳米材料能够单独稳定存在。而且从图2中观察到空心金纳米球周边结合了一层寡脱氧核苷酸，进一步证明cpg寡脱氧核苷酸成功地结合在空心金纳米球表面。
功能化的纳米材料的细胞毒性分析
cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球(cpg-hgns)对raw264.7细胞的毒性结果见图3。
从图3中可以看出，raw264.7细胞经过不同浓度的cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球处理后细胞存活率在80％以上。这说明cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球具有较低的毒性，良好的生物相容性。
2)空心金纳米球的光热效应
空心金纳米球的光热效应结果见图4。
从图4中可以看出近红外激光照射引起了hgns本体溶液温度升高，在10分钟时温度已经增加了18℃，根据图4观察到，在前8分钟温度升高速率较高，随后温度升高较缓慢。而水样在近红外激光照射下温度几乎不变。这些数据表明空心金纳米球是一种有效的光热介体，当在肿瘤部位进行局部近红外光照射时，能够利用空心金纳米球的光热效应杀死肿瘤细胞。
3)细胞摄取
cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球和cpgodns分别与raw264.7细胞共培养后的细胞摄取结果见图5，其中(a)为cy5标记的cpg-hgns培养的raw264.7细胞的细胞核经hoechst染色，实际效果呈现为蓝色；(b)为cy5标记的cpg-hgns，实际效果呈现为红色；(c)为(a)和(b)这两个图层的叠加；(d)为cy5标记的cpgodns培养的raw264.7细胞的细胞核经hoechst染色，实际效果呈现为蓝色；(e)为cy5标记的cpgodns，实际效果呈现为红色；(f)为(d)和(e)这两个图层的叠加。
在图5中(a)、(b)、(c)三个图可知，cy5标记的cpg-hgns培养的细胞中聚集了红色荧光，这些红色荧光分散比较均一，说明cy5标记的cpg-hgns进入到了细胞内。而结合(d)、(e)、(f)三个图可知，cy5标记的cpgodns培养的raw264.7细胞中没有检测到明显的红色荧光，只有很少的红色荧光在细胞外围，这也证实了单独的cpgodns很难穿透细胞膜。这表明hgns是一种有效的载体，能够将cpgodns有效地运输到raw264.7细胞内，增强了cpg寡脱氧核苷酸的细胞摄取能力，进而提升了cpgodns的免疫刺激作用。
4)体外树突细胞刺激实验：
体外树突细胞刺激实验的结果见图6。
从图6中可以看出，右边用cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球(cpg-hgns)进行近红外光(laser)诱导的光热消融后，4t1乳腺肿瘤细胞的残留物可显著增强mdcs成熟度，远高于中间通过hgns进行近红外光诱导的光热消融4t1细胞的残留物增强mdcs成熟度的水平。
实施例1:
cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球(表面等离子体共振吸收波长为746nm)的制备方法：
在含有20～1000ml水的双颈圆底烧瓶中加入1.0×10-2～2.0mol/l无水柠檬酸钠溶液和5.0×10-2～10.0mol/l无水氯化钴溶液。将此混合液在氩气中脱氧20～30分钟。向该溶液中快速加入新鲜制备的1.0×10-2～6.0mol/l硼氢化钠溶液，边加入边振荡。待反应3～5分钟后注入1.0×10-3～2.0mol/l柠檬酸·一水溶液，持续振荡，让硼氢化钠充分水解。10～45分钟后，取20～40ml钴溶液迅速移至氩气吹扫的量筒中，然后将其快速倒入正在脱氧的1.0×10-4～1.0mol/l氯金酸·三水溶液中，继续振荡并在氩气流中保持50～60分钟。然后停止脱氧，将溶液暴露于空气中，氧化45～60分钟。最后以4000g的离心力离心30～50分钟除去额外的物质，然后将沉积物重悬在超纯水中，即可得到空心金球溶液。
本发明加入氯金酸溶液，诱发如下化学反应，参见式(i)
3co+2aucl4-→2au+3co2++8cl-(i)。
通过离心将hgns浓缩至5.0×10-9～0.1mol/l。随后，1.0×10-8～1.0mol/l硫醇化cpg寡脱氧核苷酸加入到hgns中。将混合物在一定温度(26～29℃)下温育并轻微振荡8～10小时，并调节至1.0×10-5～1.0mol/l十二烷基硫酸钠和5.0×10-3～1.0mol/lpbs缓冲溶液(ph6.0～8.5)。然后通过逐滴加入nacl，使溶液中nacl浓度在3～5小时内缓慢升至5.0×10-2～1.0mol/l。将最终混合物进一步恒温(26～29℃)振荡培养25～30小时，以3000～5000g的离心力离心，并用5.0×10-3～1.0mol/lpbs缓冲液(ph6.0～8.5)冲洗，重复多次离心—漂洗过程以除去未结合的硫醇化cpg寡脱氧核苷酸，最终得到硫醇化cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球。
通过激光粒径电位仪和紫外-可见光谱仪测定，此cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球的平均粒径大约为82nm,平均表面电势为-19.2±0.5mv，表面等离子共振吸收波长为746nm。
实施例2:
cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球(表面等离子体共振吸收波长为961nm)的制备方法：
在含有20～1000ml超纯水的双颈圆底烧瓶中加入1.0×10-2～2.0mol/l柠檬酸钠·二水溶液和5.0×10-2～10.0mol/l氯化钴·六水溶液。将此混合液在氩气中脱氧40～50分钟。向该溶液中快速加入新鲜制备的1.0×10-2～6.0mol/l硼氢化钠溶液，边加入边振荡。待反应5～7分钟后注入1.0×10-3～2.0mol/l柠檬酸·二水溶液，持续振荡，让硼氢化钠充分水解。5～10分钟后，取10～30ml钴溶液迅速移至氩气吹扫的量筒中，然后将其快速倒入正在脱氧的1.0×10-4～1.0×10-2mol/l氯金酸·三水溶液中，继续振荡并在氩气流中保持60～80分钟。然后停止脱氧，将溶液暴露于空气中，氧化30～50分钟。最后以7000g的离心力离心20～40分钟除去额外的物质，然后将沉积物重悬在超纯水中，即可得到空心金球溶液。
通过离心将hgns浓缩至5.0×10-8～0.1mol/l。随后，1.0×10-8～1.0mol/l的硫醇化cpg寡脱氧核苷酸加入到hgns中。将混合物在一定温度(26～29℃)下温育并轻微振荡10～20小时，并调节至1.0×10-5～1.0mol/l十二烷基硫酸钠和5.0×10-3～1.0mol/lpbs缓冲溶液(ph6.0～8.5)。然后通过逐滴加入nacl，使溶液中nacl浓度在1～3小时内缓慢升至5.0×10-2～1.0mol/l。将最终混合物进一步恒温(26～29℃)振荡培养25～30小时，以7000～9000g的离心力离心并用5.0×10-3～1.0mol/lpbs缓冲液(ph6.0～8.5)冲洗，重复多次离心—漂洗过程以除去未结合的cpg寡脱氧核苷酸，最终得到cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球。
通过激光粒径电位仪和紫外-可见光谱仪测定，此cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球的平均粒径大约为54nm,平均表面电势为-14.6±0.8mv，表面等离子共振吸收波长为961nm。
实施例3:
cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球(表面等离子体共振吸收波长为806nm)的制备方法：
在含有20～1000ml超纯水的双颈圆底烧瓶中加入1.0×10-3～1.0mol/l柠檬酸钠·二水溶液和5.0×10-1～5.0mol/l无水氯化钴。将此混合液在氩气中脱氧50～80分钟。向该溶液中快速加入新鲜制备的1.0×10-2～6.0mol/l硼氢化钠溶液，边加入边振荡。待反应5～10分钟后注入1.0×10-3～2.0mol/l柠檬酸·一水溶液，持续振荡，让硼氢化钠充分水解。30～60分钟后，取20～40ml钴溶液迅速移至氩气吹扫的量筒中，然后将其快速倒入正在脱氧的1.0×10-4～0.1mol/l氯金酸·四水溶液中，继续振荡并在氩气流中保持50～60分钟。然后停止脱氧，将溶液暴露于空气中，氧化45～80分钟。最后以6000g的离心力离心30～50分钟除去额外的物质，然后将沉积物重悬在超纯水中，即可得到空心金球溶液。
通过离心将hgns浓缩至5.0×10-9～0.1mol/l。随后，1.0×10-8～1.0mol/l硫醇化cpg寡脱氧核苷酸加入到hgns中。将混合物在一定温度(26～29℃)下温育并轻微振荡5～20小时，并调节至1.0×10-5～1.0mol/l十二烷基硫酸钠和5.0×10-3～1.0mol/lpbs缓冲溶液(ph6.0～8.5)。然后通过逐滴加入nacl，使溶液中nacl浓度在1～3小时内缓慢升至5.0×10-2～1.0mol/l。将最终混合物进一步恒温(26～29℃)振荡培养25～30小时，以3000～5000g的离心力离心，并用5.0×10-3～1.0mol/lpbs缓冲液(ph6.0～8.5)冲洗，重复多次离心—漂洗过程以除去未结合的cpg寡脱氧核苷酸，最终得到cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球。
通过激光粒径电位仪和紫外-可见光谱仪测定，此cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球的平均粒径大约为65nm,平均表面电势为-15.4±0.6mv，表面等离子共振吸收波长为806nm。
本发明还提供了上述技术方案任意一项所述的cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球材料或上述技术方案任意一项所制备的cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球材料在肿瘤治疗的应用。
本发明对所述应用的具体方面没有特别限制，以本领域技术人员熟知的常规类似应用即可，本领域技术人员可以根据实际情况、产品要求和功能用途进行调整和选择，本发明所述应用包括肿瘤治疗，具体可以为用于增强cpg寡脱氧核苷酸的免疫刺激作用，同时发挥空心金纳米球的光热效应。本发明利用空心金纳米球通过自组装作用负载cpg，合成方法简单，适合于规模化生产应用；空心金纳米球负载能力大，可增强cpg寡脱氧核苷酸的细胞摄取能力，且生物相容性良好；cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球具有近红外表面等离子体吸收效应，能够利用光热消融作用消除原发肿瘤；同时，cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球可增强cpg寡脱氧核苷酸的免疫刺激活性，在光热治疗的同时发挥免疫治疗作用，诱导全身抗肿瘤免疫，进一步治疗远端转移的肿瘤。
以上对本发明提供的cpg寡脱氧核苷酸修饰的空心金纳米球的制备、应用进行了详细的介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，包括最佳方式，并且也使得本领域的任何技术人员都能够实践本发明，包括制造和使用任何装置或系统，和实施任何结合的方法。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。本发明专利保护的范围通过权利要求来限定，并可包括本领域技术人员能够想到的其他实施例。如果这些其他实施例具有不是不同于权利要求文字表述的结构要素，或者如果它们包括与权利要求的文字表述无实质差异的等同结构要素，那么这些其他实施例也应包含在权利要求的范围内。