i.发明领域
本发明涉及用于注射至眼内的眼科冲洗液的酮咯酸和苯肾上腺素的稳定的、不含防腐剂和不含抗氧化剂的液体药物制剂。
ii.发明背景
眼科手术通常需要生理冲洗液的使用以保护和维持眼内组织的生理完整性。典型地需要冲洗液的眼科外科手术的实例包括白内障摘除术（cataractextraction）和晶状体置换术（lensreplacement）和屈光性晶状体置换术（refractivelensexchange），角膜移植手术和玻璃体视网膜手术（vitreoretinaloperation）和青光眼小梁切除术（trabeculectomyproceduresforglaucoma）。在眼内手术期间，患者的瞳孔必须是充分地扩张的，以允许清晰的手术范围并且限制可能与手术相关的创伤。
瞳孔扩张（瞳孔散大）典型地通过瞳孔散大剂的局部施用在术前扩张眼来实现。可以典型地施用的术前应用瞳孔散大剂包括拟交感神经药，诸如α-1肾上腺素受体激动剂，和抗胆碱能药剂，诸如抗毒蕈碱药剂。抗胆碱能药剂可以在期望较长作用时选择，因为它们同时提供睫状肌麻痹（睫状肌的麻痹）和瞳孔散大，例如，托品酰胺展示了约4-6小时的半衰期。然而，对于很多手术，α-1肾上腺素将是优选的，因为它们提供瞳孔散大但是没有睫状肌麻痹。因此α-1肾上腺素是较短作用的，导致在外科手术期间的瞳孔散大并且允许瞳孔在手术完成后立即恢复至其正常状态。
在手术期间，当手术工具的尖端插入至眼前房中时，虹膜括约肌趋于收缩（瞳孔收缩），减少了由瞳孔界定的窗口。如果瞳孔直径在手术期间不能充分地维持，眼中结构受伤的风险将增加并且通常会延长需要的手术时间。在瞳孔直径中临床地显著缩小与手术相关的并发症的增加有关，包括后囊膜破裂（posteriorcapsuletear）、晶状体碎片保留（retainedlensfragment）和玻璃体渗漏（vitreousleak）。
很多眼科医生可以将肾上腺素掺入眼内冲洗液中以帮助瞳孔散大的维持。眼前节毒性综合征（tass）是眼前段的急性的、非传染性炎症。tass是严重的并发症，其可以与眼前段手术有关，最通常地是白内障手术。已经暗示多种污染物是导致tass的原因。眼内冲洗液中包括防腐剂的肾上腺素的使用是在白内障手术后发生tass相关的一些因素之一。见，例如，2012年7月9日存取的http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm5625a2.htm。甚至“不含防腐剂的”肾上腺素（意为不包括抗微生物剂的肾上腺素），仍包括焦亚硫酸钠作为抗氧化剂，其同样被眼科医生认为与对角膜内皮的潜在毒性有关联（slack，等，abisulfite-freeintraocularepinephrinesolution，amjophthalmol.；110（1）:77-82（1990））。
苯肾上腺素是另一种α-1肾上腺素药剂，有时在手术前将其局部施用以促进瞳孔散大，但是其在美国没有批准以不含防腐剂和不含抗氧化剂的形式用于一次性注射。批准的苯肾上腺素hcl溶液的实例包括0.01%苯扎氯铵（来自akorn的ak-dilate™，可以以2ml和5ml塑料滴瓶获得；来自falconpharmaceuticalsandalconlaboratories的多用途3ml和5ml滴瓶）和不包括抗微生物防腐剂但是仍包括2mg焦亚硫酸钠作为抗氧化剂的“不含防腐剂的”制剂（来自intermedmedicalltd.的neo-synephrine®，可以以喷雾瓶获得）。
为了患者舒适，对术后疼痛和刺激的减轻同样是期望的。因此，患者可以在手术前或手术后使用非甾类抗炎药（nsaid）治疗。虽然（例如）白内障手术典型地与高度术后疼痛无关，但是存在使那些占少数的经历更严重术后疼痛的患者的数量最小化的需要。这是意义重大的，因为这样的患者经历了不适并且可能担心他们的手术进展不顺利，还因为患者作为预防可能需要复查以确保没有严重的并发症导致该疼痛。
眼部药物，诸如通常使用的nsaid的递送的多种方法每个均具有局限性。这些局限性可以包括角膜和结膜毒性、组织损伤、眼球贯穿（globeperforation）、视神经创伤、视网膜中央动脉和/或静脉堵塞、直接视网膜药物毒性和全身性副作用。例如，由于眼的天然保护表面，逐滴应用的局部药物治疗在要到达眼的目标部位时经常受到阻碍。在很多情况中，应用于眼表面的相当小的百分比的药物会实际上到达期望作用的治疗部位。
为实现递送至眼后部的药物的充分浓度，药物诸如nsaid经常地以非常高的浓度全身施用。为克服保护眼后部免于来自血流的所选药物分子的血-视网膜屏障，这些水平是必要的。对于外科手术，有时将可注射的药物溶液直接注射至眼后部。当需要更高的局部浓度和具有低渗透特征的药物需要递送时，使用结膜下的和眼球周的眼周注射。在白内障手术中使用直接地进入眼前房中的前房注射。
酮咯酸是可以商购获得的以保存形式的用于眼部使用的nsaid。来自allergan的acular®是酮咯酸氨丁三醇溶液，其包括作为防腐剂的0.01%苯扎氯铵，可以以3ml和6ml滴瓶获得。bedfordlaboratories同样供应以浓缩形式的酮咯酸氨丁三醇（1ml中15mg或30mg，或10ml中60mg或300mg）用于血管内的或肌肉内施用的注射。allergan提供了以acuvail®的商标名的在个别使用小瓶中的不含防腐剂的0.45%酮咯酸氨丁三醇眼用溶液，其使用羧甲基纤维素钠、氯化钠、无水柠檬酸钠制备。
虽然前房注射提供了达到某浓度的快速方法，但是它可以伴随角膜毒性。然而，该方法面临这些药物通过眼的天然的循环过程而快速移除的现实。因此，可注射溶液迅速失去了它们的治疗益处，通常迫使使用可以导致毒性风险的频繁的、大剂量注射。持续释放制剂，诸如含有微囊剂的粘弹剂凝胶，可以进行眼内注射以获得更长的作用持续时间。然而，在到达药物的局部治疗浓度上可以有一些延迟。因此，存在对于在眼科手术期间对眼部递送的受控的方法的需要。
已经用于眼科手术冲洗的溶液包括生理盐水、乳酸盐ringer氏溶液和hartmann氏乳酸盐ringer氏溶液，但是这些溶液由于潜在的角膜和内皮的不利影响而不是最优的。其它水溶液包括试剂诸如电解液、用于ph调节的缓冲剂、谷胱甘肽和/或能源诸如右旋糖，它们能更好的保护眼组织，但是不参与其它与手术有关的生理过程。一种常用的眼科冲洗溶液是公开于授予garabedian等的美国专利4，550，022的两部分缓冲的电解液和谷胱甘肽溶液，在此其公开内容明确地通过引用并入本文。该溶液的两部分在施用前刚刚混合以确保稳定性。这些溶液是以在手术期间维持眼部组织的健康的目标进行配制。
改进的溶液的另一个实例公开于gan等发明人的国际pct申请wo94/08602，其公开在此通过引用并入本文。该申请公开了在眼部冲洗液中包含瞳孔散大剂，诸如肾上腺素。还另一个实例由cagle等发明人的国际pct申请wo95/16435提供，其公开了在眼科冲洗液中的非甾抗炎药物（nsaid）的包含。
iii.发明概述
本发明提供了用于注射的，瞳孔散大剂苯肾上腺素和抗炎剂酮咯酸的无菌的、无防腐剂的和无抗氧化剂的液体制剂。制剂可以合适地注射至眼内冲洗载体并且用于在手术期间冲洗眼组织。所述制剂避免了可以与防腐剂和抗氧化剂有关的潜在毒性还具有足够的稳定性。
本发明的一个实施方案提供了不含防腐剂和不含抗氧化剂的无菌液体药物制剂，其包括在水载体中的苯肾上腺素、酮咯酸和缓冲系统，当其贮存在5+/-3℃至25+/-2℃的温度时稳定至少6个月。优选地，当贮存在5+/-3℃至25+/-2℃的温度时制剂稳定至少24个月。
在本发明的一个方面中，缓冲系统选自磷酸钠缓冲系统和柠檬酸钠缓冲系统。优选地缓冲系统是柠檬酸钠缓冲系统，诸如约20mm柠檬酸钠缓冲系统。在本发明的另一个方面中，制剂具有5.8至6.8的ph。
在本发明的另一个方面中，制剂包含于一次性容器中，诸如可以通过注射取出的使用密封物封闭的小瓶和预填充注射器。本发明合适的制剂包括从46至76mm的苯肾上腺素和从8.5至14mm的酮咯酸，和作为一个实例可以含有的约60.75mm苯肾上腺素和约11.25mm酮咯酸。本发明的制剂可以包括苯肾上腺素比酮咯酸摩尔比例为1：1至13:1的苯肾上腺素和酮咯酸，并且合适地可以包括苯肾上腺素比酮咯酸摩尔比例为3:1至10:1的这些药剂。
本发明的另一个实施方案提供了不含防腐剂和不含抗氧化剂的无菌液体药物制剂，其包括在水载体中的苯肾上腺素、酮咯酸和缓冲系统，和制剂注射进入的眼内冲洗载体，使得在注射后苯肾上腺素以30至720µm的浓度存在并且酮咯酸以44至134µm的浓度存在。在本发明的另一个方面，在注射至眼内冲洗载体后苯肾上腺素以240至720µm的浓度存在并且酮咯酸以10至270µm的浓度存在。
本发明的另一个实施方案提供了无菌液体药物制剂，其基本上由在水载体中的苯肾上腺素、酮咯酸和缓冲系统组成，其中当贮存于5+/-3℃至25+/-2℃的温度时制剂稳定至少6个月。优选地，当贮存于5+/-3℃至25+/-2℃的温度时制剂稳定至少24个月。
在本发明的一个方面中，缓冲系统选自磷酸钠缓冲系统和柠檬酸钠缓冲系统。优选地缓冲系统是柠檬酸钠缓冲系统，诸如约20mm的柠檬酸钠缓冲系统。在本发明的另一个方面中，制剂具有5.8至6.8的ph。
在本发明的另一个方面中，制剂包含于一次性容器中，诸如使用注射物可以经过其吸出的密封物封闭的瓶和预填充注射器。
本发明的另一个方面提供了用于注射的无菌液体药物剂量形式，包括苯肾上腺素、酮咯酸、缓冲系统和水载体，包装于用于注射的一次性容器中。
在本发明的另一个方面中，提供了包括苯肾上腺素、酮咯酸、缓冲系统和眼内冲洗载体的无菌液体药物制剂，其中包括以30至720µm的浓度的苯肾上腺素，并且包括以10至270µm的浓度的酮咯酸，或优选地包括以90至720µm的浓度的苯肾上腺素并且包括以44至134µm的浓度的酮咯酸。该制剂可以同样是不含防腐剂和不含抗氧化剂的。
同样公开的是制备包括在水载体中的苯肾上腺素、酮咯酸和缓冲系统的，不含防腐剂并且不含抗氧化剂的无菌液体药物制剂的方法，当贮存于5+/-3℃至25+/-2℃的温度时制剂稳定至少6个月。优选地，当贮存于5+/-3℃至25+/-2℃的温度时制剂稳定至少24个月。
进一步公开了制备包括苯肾上腺素、酮咯酸、缓冲系统和眼内冲洗载体的无菌液体药物制剂的方法，其中包括以30至720µm的浓度的苯肾上腺素，并且包括以10至270µm的浓度的酮咯酸，或优选地包括以90至720µm的浓度的苯肾上腺素并且包括以44至134µm的浓度的酮咯酸。制剂可以同样是不含防腐剂和不含抗氧化剂的。
iv.附图简述
现在本发明将通过实例的方式，根据相应的附图进行更详尽的描述：
图1-12提供了当贮存于2-8℃至60℃的受控温度时，苯肾上腺素和酮咯酸组合制剂经过12个月的时期在不同时间点的稳定性的研究结果，其通过测量来自活性药物成分降解的相关物质的百分比，与活性药物成分浓度的浓度、不同缓冲系统、edta防腐剂的添加和edta防腐剂+焦亚硫酸钠抗氧化剂的添加的变量来确定。
图13-14提供了当贮存在4℃至60℃的受控温度时，评估氮气覆盖对两种苯肾上腺素和酮咯酸组合制剂使用或不使用edta保护剂的情况下、在经过一年时期的不同时间点上稳定性的效果的研究结果。
图15-18提供了在2-8℃至60℃的温度范围贮存样品后经过1个月的时间点上评估不同抗氧化剂对苯肾上腺素和酮咯酸组合制剂稳定性效果的研究结果。
图19提供了当贮存在4℃至40℃温度时，在经过4个月的时期评估高浓度苯肾上腺素制剂的稳定性的研究结果。
图20a和20b分别地证明了当贮存在2-8℃30个月时，在苯肾上腺素和酮咯酸组合制剂中苯肾上腺素和酮咯酸的效能。
图21-25说明了在晶状体乳化晶状体摘除和置换手术期间，当个别地给予和当在平衡盐溶液（bss）中通过眼内冲洗组合时，使用观察到的瞳孔散大（图21和22）和闪光（图23-25）的量度来评估苯肾上腺素和酮咯酸的非人灵长动物浓度范围功效研究的结果。
图26-28说明了在晶状体乳化术晶状体摘除和置换手术期间，当在bss中通过眼内冲洗递送时，评估苯肾上腺素和酮咯酸组合制剂在瞳孔散大（图26）和闪光（图27-28）上的效果的非人灵长动物研究的结果。
图29说明了当在非人灵长动物中的晶状体乳化术晶状体摘除和置换手术期间，在bss中递送时，评估苯肾上腺素和酮咯酸组合制剂的不同浓度在瞳孔散大上的剂量范围研究的结果。
v.发明详述
本发明提供了用于围手术期对眼组织局部应用（包括眼内和局部应用）的冲洗液的无菌制剂，其包括作为瞳孔散大剂的苯肾上腺素和作为抗炎药剂的酮咯酸。这些试剂均不含防腐剂和抗氧化剂，仍展示出意想不到的良好稳定性。优选地将它们包装于用于注射的一次性容器中并且可以在眼内手术（诸如白内障摘除术和晶状体置换术和屈光性晶状体置换术）前注射至更大体积的眼内冲洗载体中并且在眼内手术期间使用。
定义
如本文使用的“防腐剂”指的是添加至药物产品中以维持稳定性并防止由微生物生长而变质的抗微生物剂。常用的抗微生物防腐剂可以包括在药物组合物中，包括山梨酸及其盐、苯甲酸及其盐、丙酸钙、亚硝酸钠（以及硝酸钠，其在“原位”转变为亚硝酸钠）、亚硫酸盐（二氧化硫、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾等）和金属螯合剂乙二胺四乙酸钠，同样指的是乙二酸四乙酸二钠，edta或na2edta。
如本文使用的“抗氧化剂”指的是优先与氧反应并由此保护添加其的药物产品免于由于氧化变性的降解的物质。可以包含在药物组合物中的水或油可溶的抗氧化剂的实例包括亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、甲醛化次硫酸氢钠、l-和d-抗坏血酸、乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、硫代甘油、硫代乙醇酸、硫代乳酸、硫脲、dihithreitol、谷胱甘肽、没食子丙酸酯、叔丁基羟基茴香醚、丁羟甲苯、叔丁基对苯二酚、抗坏血酸棕榈酸酯、去甲二氢愈创木酸、α-生育酚。
“不含防腐剂”的溶液指的是不包括苯扎氯铵或其它抗微生物药剂的溶液。
“不含抗氧化剂”的溶液指的是不包含焦亚硫酸钠或其它试剂（其已被包括用于单一功能或充当抗氧化剂）的溶液，虽然不含抗氧化剂的溶液可以包含ph缓冲系统，所述系统的一种组分可以具有抗氧化剂活性。
“酮咯酸”意为盐形式的酮咯酸，诸如酮咯酸氨丁三醇[（+/-）-5-苯甲酰-2，3-二氢-1h-吡咯嗪-1-羧酸：2-氨基-2（羟甲基）-1，3-丙二醇（1：1）]。
“苯肾上腺素”意为盐形式的苯肾上腺素，诸如苯肾上腺素hcl[（-）-间羟基-a-[（甲基氨基）甲基]苯甲醇盐酸盐]。
关于给出的药物成分的“相关物质”指的是由于成分的降解产生的物质，表示为在所述制剂中药物成分的总浓度的百分比。关于本发明如本文使用的“总相关物质”指的是由于在所述制剂中的活性药物成分酮咯酸和苯肾上腺素的降解产生的全部相关物质的总和，表示为在所述制剂中药物成分的总浓度的百分比。任何低于用于测量相关物质的测定的定量下限，例如在0.1%，存在的相关物质都不包括在确定总相关物质的合计中。在本文实施例的附图中，对于成分提及0%的相关物质意为对于测定的物质，没有所述成分的相关物质以高于定量下限，例如0.1%的水平存在。
“稳定的”指的是在特定的贮存时期结束时，液体药物制剂含有低于5%的总相关物质。在一个实施方案中，稳定的液体制剂在5+/-3℃（即，2-8℃）至25+/-2℃（即，23-27℃）的温度下稳定至少6个月的时期。在优选的实施方案中，稳定的液体制剂在5+/-3℃至25+/-2℃的温度稳定至少1年的时期。在优选的实施方案中，稳定的液体制剂在5+/-3℃至25+/-2℃的温度下稳定至少24个月的时期。在优选的实施方案中，稳定的液体制剂在5+/-3℃至25+/-2℃的温度下稳定至少30个月的时期。在本发明优选的实施方案中，本发明的稳定制剂在给定的贮存时期后具有小于1.0%的总相关物质。
术语“约”理解为意指所述制剂组分的浓度中可以存在变化，其可以达到给定值的5%、10%、15%或至多并包括20%。例如，将短语“具有约20mm柠檬酸钠的制剂”理解为意为制剂可以具有16mm至24mm的柠檬酸钠。
术语“无菌的”指的是已经经过无菌地加工并且没有活细菌、真菌或其它微生物的药物产品。
药剂
本发明提供了两种活性药物成分（api）的组合的稳定的、液体的不含防腐剂并且不含抗氧化剂的药物制剂，其中苯肾上腺素作为瞳孔散大剂并且nsaid酮咯酸作为抗炎剂。
酮咯酸
在本发明优选的制剂中的“酮咯酸”作为酮咯酸氨丁三醇盐[（+/-）-5-苯甲酰-2，3-二氢-1h-吡咯嗪-1-羧酸：2-氨基-2（羟甲基）-1，3-丙二醇（1：1）]被包括。酮咯酸是非甾类抗炎药的吡咯并吡咯基团的成员。酮咯酸hcl是r-（+）和s-（-）对映异构体的外消旋混合物，其可以以三种晶型存在，它们全部同样可溶于水中。在延长的对光暴露后该试剂会褪色，并且因此避光包装（例如，装箱（over-boxing）或使用琥珀色小瓶）可以适合用于本发明的制剂的包装。
苯肾上腺素
“苯肾上腺素”意为盐形式的苯肾上腺素，诸如苯肾上腺素hcl[（-）-间羟基-a-[（甲基氨基）甲基]苯甲醇盐酸盐]。苯肾上腺素是α受体交感神经激动剂。苯肾上腺素hcl可任意地溶解于水和醇中。
水载体
将所述api添加至作为载体的水溶剂中，并且发明人已经确定不需要增溶剂。所述水载体合适地是注射用水（wfi），其是无菌的、不含溶质的蒸馏水制备物。可选地，可以使用对眼内组织没有伤害并且对所述制剂的稳定性没有不利影响的其它水载体，诸如去离子水，或（在首先评估对稳定性的潜在影响后）诸如下文描述的盐水或平衡盐溶液。
缓冲系统
本发明的制剂调节至ph5.8至6.8，并且优选地至约6.3。氢氧化钠和盐酸可以按需要添加以调节制剂至该ph。期望的ph通过缓冲系统的使用合适地维持。一种这样的合适的系统是柠檬酸盐缓冲剂，包括一水合柠檬酸钠和无水柠檬酸钠，以及另一个合适的系统是磷酸钠缓冲剂，包括磷酸二钠和磷酸氢钠。任一缓冲系统可以在10mm至100mm范围内的合适浓度使用并且合适地可以是20mm。如在下文的实施例1中描述的，柠檬酸钠是在不含防腐剂的制剂中使用的优选的缓冲剂。在柠檬素钠盐缓冲剂中的柠檬酸，具有螯合二价阳离子的能力并且可以因此同样防止氧化，提供了抗氧化作用以及缓冲作用。然而，它的存在不降低稳定性（其它抗氧化剂则会）（下文的实施例3）。如本文使用的，术语“不含抗氧化剂的”排除了其它抗氧化剂的使用但是不排除缓冲剂诸如柠檬酸的使用，其被包括作为缓冲系统的一部分。
无其它赋形剂
在本发明进一步的方面中，除了不含有任何防腐剂或抗氧化剂外，根据本发明的制剂同样不包括除了缓冲系统的任何赋形剂。例如，不使用增溶剂，诸如乙醇或乙醇（即，所述制剂是不含增溶剂的）。本发明优选的制剂基本上由两种api和所述缓冲系统在注射用水中组成，产生了具有潜在减少的对眼内组织毒性的非常纯净的制剂。
一次性容器
在本发明进一步的方面中，本发明的苯肾上腺素和酮咯酸组合制剂以对眼内手术期间一次性使用足够的量包含于容器中，所述容器有利于这样的一次性使用并且不利于多次使用的施用。因此根据本发明配制的足够量的药物组合物与期望添加至眼内冲洗载体的标准容器的药物组合物的量相等或只是略多于（即超过不多于25%），包含于有利于通过注射的药物组合物分配的一次性容器中。例如，苯肾上腺素和酮咯酸组合药物组合物期望的一次性用量可以包装于使用塞子或其它密封物封闭的玻璃小瓶中，所述小瓶包括皮下注射针可以通过其插入以抽取药物组合物的隔片，或可以包装在预装注射器中。合适的容器和密封系统的一个实例是具有west20-mm灰色丁基橡胶塞和20-mm易拉密封盖（flip-offseal）的5mlusptype1硼硅酸盐火石玻璃小瓶。
基于下文实施例2中描述的结果，在关闭所述容器前，可以期望将根据本发明配制的药物组合物暴露于氮气覆盖层（即在密封小瓶之前将小瓶液面上空间的空气使用氮气替换）。同样可以使用其它排除空气并使用惰性气体将其置换的方法，诸如将惰性气体喷射通过溶液。
眼内冲洗载体
在通过眼内或局部冲洗或灌洗施用前，苯肾上腺素和酮咯酸组合药物组合物（即组合药物产品）合适地通过注射添加至眼内冲洗液的袋、瓶或其它容器中。合适的眼内冲洗液包括盐水、乳酸盐ringer氏平衡盐溶液或与水制剂相容并且不伤害眼组织的任何其它冲洗溶液。一种合适的眼内冲洗载体包括以下佐剂的一种或多种，并且优选全部：提供生理平衡盐溶液的足够的电解质、细胞能源、缓冲剂和自由基清除剂。一种合适的溶液（指的是在下文实例中作为“平衡盐溶液”或“bss”）包括：50至500毫摩尔钠离子、0.1至50毫摩尔钾离子、0.1至5毫摩尔钙离子、0.1至5毫摩尔镁离子、50至500毫摩尔氯离子和0.1至10毫摩尔磷酸盐的电解质；作为缓冲剂以浓度为10至50毫摩尔的碳酸氢钠；浓度为1至25毫摩尔的选自右旋糖和葡萄糖的细胞能源；和浓度为0.05至5毫摩尔的作为自由基清除剂（即抗氧化剂）的谷胱甘肽。
稀释和施用使用本发明的组合药物组合物的合适方法的一个实例利用如下表2中配方2所述的本发明的制剂。4.5ml该溶液的等分试样，包括4.0ml作为用于一次性使用的预定量和0.5ml的过量填充，包含于无菌封闭的一次性的小瓶中并且意在与用于眼内手术期间施用的冲洗液混合。通过所述小瓶，4ml通过注射器抽出并且通过注射至500mlbss包或瓶中与500mlbss混合，以提供在冲洗液中终浓度为483μm的苯肾上腺素和89μm的酮咯酸，用于对眼的局部递送。
在本发明的另一个方面中，用于冲洗的无菌液体药物制剂可以以苯肾上腺素和酮咯酸已经混合于其中的眼内冲洗载体提供，使得其已经稀释至期望在手术期间用于眼内组织局部递送的各活性药物成分的浓度，并且包含于无菌包、瓶或其它一次性冲洗容器中。例如，这样的用于冲洗的制剂可以包括在浓度为30至720µm的苯肾上腺素和浓度为10至270µm的酮咯酸，或优选地可以包括浓度为90至720µm的苯肾上腺素和浓度为44至134µm的酮咯酸。在一个实施方案中，苯肾上腺素和酮咯酸组合混合于诸如上文描述的，作为眼内冲洗载体的平衡盐溶液中。用于冲洗的该药物制剂可以合适地完全不含防腐剂和抗氧化剂，或任选地可以只包括典型地包括在非药物眼内冲洗载体的抗氧化剂（诸如在上文描述的平衡盐溶液中的谷胱甘肽），但是无防腐剂。
示例性制剂
如上文描述的，本发明的稳定的液体药物组合物包括在缓冲水载体中的苯肾上腺素和酮咯酸。本发明的组合药物组合物中的苯肾上腺素的合适浓度为从10mm至500mm的范围，并且优选地从45mm至112mm。本发明的组合药物组合物中的酮咯酸的合适浓度为从2mm至75mm的范围，并且优选地从8.5mm至24mm。所述缓冲系统，诸如柠檬酸钠缓冲系统，合适地以10至100mm的浓度被包括，并且优选地约20mm。根据本发明的两个示例性制剂列举于下文的表1和表2中。在各情况中，如果需要调节ph至约6.3，当制备制剂时可以添加氢氧化钠和/或盐酸。
表1
实例制剂1
*对应于20mm柠檬酸盐缓冲剂。
**对应于10mm至100mm柠檬酸盐缓冲剂。
表2
实例制剂2
*对应于20mm柠檬酸盐缓冲剂。
**对应于10mm至100mm柠檬酸盐缓冲剂。
包括在制剂中的药物活性成分的量可以以摩尔比例表达。苯肾上腺素对酮咯酸的摩尔比例可以在1：1至13：1的范围，并且更合适地可以在3：1至10：1的范围。如通过上文表1中配方1代表的苯肾上腺素和酮咯酸的示例性的摩尔比例是苯肾上腺素比酮咯酸为8:1。如通过上文表2中配方2代表的苯肾上腺素和酮咯酸的另一个示例性的摩尔比例是苯肾上腺素比酮咯酸为5.4:1。
将本发明制剂稀释至用于局部递送的眼内冲洗载体中后，苯肾上腺素的剂量浓度可以是3至7200µm、更合适地30至720µm、更优选地90至720µm、还更优选地240至720µm和最优选地约483µm。将本发明制剂稀释至用于局部递送的眼内冲洗载体中后，酮咯酸的剂量浓度可以是3至900µm、更合适地10至270µm、更优选地44至134µm、还更优选地30至90µm和最优选地约90µm。
使用方法
本发明的稳定液体制剂可以在多种眼科手术中与眼内冲洗载体混合后使用。这些手术包括包括白内障摘除术和晶状体置换术和屈光性晶状体置换手术，角膜移植手术和玻璃体视网膜手术和青光眼小梁切除术。
稀释和施用本发明的组合药物组合物的合适方法的一个实例使用如上文表2中配方2描述的本发明制剂。含有提供的4.5ml组合物的无菌的一次性的5ml小瓶，从其中通过注射器抽出4ml组合物，并且通过注射至bss的500ml袋或瓶中与500mlbss混合以提供483μm苯肾上腺素和89μm酮咯酸的终浓度。该溶液在手术过程中以恒定浓度通过眼前房冲洗。同样地，在该实例中，所述药物产品在手术期间只进行前房内施用。
活性药剂以稀释的浓度包括于所述眼内冲洗载体中。根据本发明的教导确定所述药剂的浓度用于外科手术期间对眼组织直接、局部的应用。溶液的应用可以围手术期地实施，即：手术中地；手术前地和手术中地；手术中地和手术后地；或手术前地、手术中地和手术后地。
必须注意的是如本文和在所附权利要求中使用的，除非上下文有明确的另外指示，单数形式“一个（a）”、“和（and）”和“所述（the）”包括复数引用。因此，例如，提及“一个赋形剂”包括多种这样的赋形剂和本领域技术人员已知的其同等物等。
本文讨论的出版物以它们在本申请提交日期前的公开单独地提供。在本文中没有任何情况应理解为承认本发明无权先于这些凭借在先发明的出版物。进一步的，所提供的出版物的日期可以与实际出版日期不同，其可以需要单独确认。全部引用通过引用并入本文。
实施例
实施例1-5
在以下实施例1-5描述的研究中，通过具有紫外检测器的高效液相色谱（hplc-uv）测量相关物质（rs）的存在和效能作为稳定性的指示，并且检测到的相关物质百分比的增加指示了降解产物的存在。在这些研究中，所述hplc-uv使用了具有1.2ml/分钟流速的zorbaxxdb-c8，5µm，4.6mmx150mm柱。流动相a和b如下：流动相a：1.1mg/ml1-辛基磺酸650ml，ph3.0：50mlmilli-q水：300ml甲醇。milli-q水：300ml甲醇；流动相b：300ml1.1mg/ml1-辛基磺酸，ph3.0：50mlmilli-q水：650ml甲醇。使用的稀释液是流动相a。在40分钟内使用100%a至100%b的梯度。使用了280nm紫外检测器。
实施例1
依赖防腐剂和抗氧化剂的使用和使用不同缓冲剂的制剂的稳定性的比较
进行研究以比较两种活性药物成分（api），苯肾上腺素hcl（pe）和酮咯酸氨丁三醇（ke）的组合的不同制剂，它们各自以5mm或1mm的相等浓度处于水溶液中。使用了两种不同缓冲系统以将所述溶液维持在三个不同ph：20mm磷酸钠缓冲剂（磷酸氢二钠和磷酸二氢钠）用于ph7.4；20mm柠檬酸钠缓冲剂（一水合柠檬酸钠和无水柠檬酸钠）用于ph6.5；和20mm柠檬酸钠缓冲剂用于ph5.5。发展了这些api的四种不含防腐剂和不含抗氧化剂的制剂，按如下每种作为等分试样装入多个1ml小瓶中用于贮存和取样：
表3
其它制剂随后通过不添加防腐剂或抗氧化剂（对照组），或通过添加防腐剂乙二胺四乙酸二钠（同样指的是乙二胺四乙酸钠或edta）或edta+抗氧化剂焦亚硫酸钠进行制备，如下：
表4
随后在避光条件下将每个这些组中多种制剂的样品在2-8℃、25℃、40℃或60℃的受控温度下贮存。各制剂的样品经过12个月的时期在多个时间点取出并对api的降解进行分析，如通过对各api测量相关物质来确定。该研究的结果在图1-12的表中陈述，并且获得了以下结论。
基于贮存1个月后的稳定性评价：
1.对照组（g1）证明在ph7.4的磷酸钠缓冲剂和ph6.5和ph5.5的柠檬酸钠缓冲剂中两种api均是稳定的。对照组在60℃展示出一些降解，在ph4.5（柠檬酸钠）中显示的最多。
2.g2组与g1组比较证明了在更高温度下edta抑制了pe的降解。
3.g3组令人惊讶地证明了焦亚硫酸钠在评估的温度下显著地增加了api特别是ke的降解。此外，在1个月，在40℃和60℃贮存的一些g3样品变为浅黄色。
基于贮存6个月后的稳定性评价：
4.edta令人惊讶地没有显示出对任何api的稳定性具有显著的效果，特别是在ph6.5的柠檬酸盐缓冲剂中。
5.在6个月相关物质百分比最大的增加出现在保持在60℃的样品中。
6.两种api在4℃和25℃显示稳定，在40℃相关物质的百分比有小的增加，特别在ph6.5的柠檬酸盐缓冲剂中。
7.在6个月，在40℃和60℃的样品显示出亮黄色但是没有可见的沉淀或结晶。
实施例2
氮气覆盖在稳定性上的效果
随后进行研究以确定氮气覆盖的效果（即在密封所述小瓶之前使用氮气替换瓶中液面上部空间的空气）。评估了来自实施例1的配方f2（5mm酮咯酸、5mm苯肾上腺素在ph调节至6.5的柠檬酸钠缓冲剂水溶液中），不添加任何防腐剂或抗氧化剂（组1，g1）或添加0.05%w/vedta作为防腐剂（组2，g2）。在4℃至60℃的温度范围内贮存样品经过1年的时期的时间点测量各api的相关物质。
该研究的结果在图13和14中显示，并且证明了相比于存在含有氧气的空气，氮气覆盖的使用显著地减少了两种api的降解，特别地在40℃和60℃的升高的温度下。当使用氮气覆盖时，edta的存在或缺失对api的稳定性造成很小的差异。
实施例3
不同抗氧化剂在稳定性上的效果
随后进行研究以评估将可选的抗氧化剂添加至同样包括0.05%w/vedta（组2，g2）作为防腐剂的的实施例1的配方f2（在水溶液中ph调节至6.5的柠檬酸钠缓冲剂中的5mm酮咯酸、5mm苯肾上腺素）中的效果。评估的抗氧化剂是0.1%抗坏血酸（a1）、0.1%一水合l-半胱氨酸hcl（a2）、还原的0.1%l-谷胱甘肽（a3）和0.1%单硫代甘油酸酯（a4）。在样品贮存于2-8℃至60℃的温度范围经过1个月时期的时间点测量各api的相关物质。
该研究的结果显示于图15-18中，并且证明了，在1个月的时间点，这四种抗氧化剂各自令人惊讶地增加了每种api的降解，特别地在40℃和60℃的升高的温度下。
实施例4
更高浓度的苯肾上腺素的稳定性的评估
为评估在苯肾上腺素hcl和酮咯酸氨丁三醇组合制剂中苯肾上腺素的浓度是否能够增加而对苯肾上腺素稳定性无有害影响，制备了没有添加防腐剂、抗氧化剂或其它赋形剂的，在调节ph至6.5的柠檬酸钙缓冲剂中的450mm苯肾上腺素的水制剂，并在当样品在4℃和40℃之间的温度下贮存经过4个月的时期时进行评估。
该研究的结果在图19中提供。该高浓度苯肾上腺素制剂在4℃和30℃之间稳定4个月。
实施例5
苯肾上腺素和酮咯酸组合的延长的稳定性的评估
对不添加任何防腐剂或抗氧化剂的，在调节ph至6.5的20mm柠檬酸钠缓冲剂中的苯肾上腺素hcl（12.37mg/ml）和酮咯酸氨丁三醇（4.24mg/ml）的固定组合的制剂进行延长的稳定性研究。所述制剂的样品以等分试样分装于5mlusptype1玻璃小瓶中，使用daikod777-1flurotec®包覆的20mm塞封闭，并且倒置贮存并且用铝箔包裹用于避光，并且随后保持在长期（5±3℃）和加速贮存条件（25±2℃/60±5%rh）下。各小瓶含有4.5ml溶液，包括0.5ml过量填充。
当在这些条件下贮存30个月后测量时，在产品外观、溶液ph或效能上没有可测量的变化。在此30个月的时间点，在5℃和25℃贮存分别产生1.17%和1.36%的相关物质。图20a或图20b分别提供了对于保持在2℃至8℃的标记的贮存温度下的试剂的苯肾上腺素hcl和酮咯酸氨丁三醇的测量的效能的图形展示。如在这些图中证实的，在30个月期间没有观察到效能的显著降低（在各时间点测定三小瓶）。
实施例6-9
以下的实施例6-9提供了根据本发明的苯肾上腺素hcl和酮咯酸氨丁三醇组合制剂体内研究的结果，其已通过注射至随后用于晶状体置换和替换手术期间的眼内冲洗的冲洗溶液而被稀释。以下制剂在该系列研究中评估：（a）单独的苯肾上腺素hcl（pe）、（b）单独的酮咯酸氨丁三醇（ke）、（c）苯肾上腺素hcl和酮咯酸氨丁三醇的组合（pe-ke）或（d）无活性药物成分（媒介物对照），在每种情况下配制在包含调节ph至6.5的20mm柠檬酸钠缓冲剂的水溶液中，不添加任何防腐剂或抗氧化剂，在每种情况下以2.5ml等分试样提供。在每种情况下将所述制剂的等分试样注射至作为冲洗媒介物载体的平衡盐溶液（bss，baxterhealthcare，生产代码1a7233）中达到如下文描述的特定的最终给药浓度。该研究还在如下文所述程度上使用了丙美卡因hcl（0.5%，bausch&lomb）、托品酰胺（1.0%，bausch&lomb）和环丙沙星hcl（3%，alcon）。
所述检验剂的瞳孔散大和抗炎性能在人晶状体乳化手术的非洲绿猴模型中评估。在手术前，在每只猴的双眼上执行基线测量和评价以确定瞳孔直径、晶状体和虹膜完整性、角膜厚度和眼前房闪光和通过或组织显微镜检查下定性评分的细胞计数和使用kowafm-500仪器的定量闪光光度测定。使用storzpremier前房晶状体乳化机执行使用聚甲基丙烯酸甲酯（pmma）人工晶状体将晶状体置换的晶状体乳化手术。所述方法只在右眼执行以最小化手术位置变化，允许左眼作为对照，并且最小化任何诱导的可能视力丧失的结果。
将试验动物在使用一滴局部丙美卡因增强的氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下卧姿放置。使用mvr20g矛型刀刃在右眼角膜中制造小切口，通过粘弹剂注射器将0.4-0.6ml粘弹剂（2%羟丙基甲基纤维素，eyecoat，eyekonmedical）引入眼前房中。使用2.65mm直清晰角膜双斜面刀片（straightclearcorneabi-beveledblade）在角膜缘前部制造1.0mm的角膜切口。冲洗使用晶状体乳化手持件进行以移除粘弹剂并且导入试验灌洗液。在总共4分钟的冲洗后，停止冲洗并且使用粘弹剂重新填充眼前房。执行撕囊术并且将晶状体乳化尖重新导入眼前房，施加晶状体乳化能量以破坏晶状体并且允许抽吸和晶状体碎片移除。冲洗在晶状体移除后延长一段时间以标准化全部治疗组的眼内灌洗液递送（在冲洗的该晶状体乳化部分期间总共14分钟）。按照晶状体乳化和冲洗程序，将pmma眼内晶状体（iol）插入并且执行额外2分钟的冲洗，之后使用两个12.0尼龙缝合线封闭角膜切口。如下文描述的，使用试验流体或媒介物对照在晶状体乳化和晶状体置换之前、之间和之后以20ml/分钟的流速进行冲洗总共20分钟。
在这些研究中，使用kowafm-500（kowacompany，tokyojapan）在外科手术开始的基线、4.5、24、48小时和1周后执行激光闪光光度测定。kowafm-500测量激光散射以量化眼前房闪光。将激光定向进入眼前房并且在炎症反应期间释放进入眼前房的蛋白质分子通过焦点散射激光。该光散射通过光电倍增管作为每毫秒光子计数进行量化。在每个观察点，收集测量值直到获得7个可接受的读数（两背景测量值之间差异<15%）并且删除最低和最高的读数并且计算平均值+/-标准差，如制造商所指定。
瞳孔散大效果的时间进程通过在灌注程序期间对瞳孔的视频录像进行记录。瞳孔直径和盖窥器的固定宽度（11mm）从屏幕图像测量以允许按照毫米计算瞳孔直径。在输注程序进程期间以根据对每个记录的程序的视频时间记录的周期性间隔进行测量。
主要功效变量是瞳孔直径和激光闪光光度计测量。使用单因素、重复的测量anova方法与事后比较的使用sas（sasinstituteinc.）的studentnewman-keuls检验，在方案修正的群体（全部完成该研究的主体，其没有主要方案偏差）中分析主要功效变量。anova分析的项目包括时序（=时间，受延滞效应干扰）、眼、猴和治疗。使用了合适的基于模型的比较以检测在对于瞳孔直径p<0.05的显著水平上和在全部时间点的闪光测量的治疗差异。
实施例6
根据晶状体乳化手术模型中手术中的冲洗的苯肾上腺素和酮咯酸的浓度-范围研究
进行了非glp研究作为浓度-范围功效研究以评估当在白内障手术期间在bss中通过眼内冲洗单独和组合的给出时pe和ke。目的是评估每种试剂在瞳孔散大和炎症端点上的益处。
在实验的第一个系列中，将指定的1期、16期动物分至四个组中并且研究以建立在在该晶状体乳化手术的模型中、在bss冲洗液中苯肾上腺素的最大有效浓度。在1期群体中的4只猴接受了托品酰胺（毒蕈碱瞳孔散大剂），以作为阳性对照使用，并且允许通过标准局部术前递送路线测定在适当瞳孔扩张下的目标终点量度。苯肾上腺素治疗组接受低（3um）、中（10um）、高（30um）和最高（90um）浓度的含苯肾上腺素bss灌流液。所述低和最高治疗组如所决定的，各自由2只动物组成以评估如1期部分进行的苯肾上腺素的更高浓度。苯肾上腺素功效的主要终点是瞳孔散大。同样测定了根据手术的炎症终点。
bss灌流液通过晶状体乳化针在没有苯肾上腺素或含有浓度为3.0m、10m、30m或90m（见表1）的苯肾上腺素的情况下下进行递送。应用第1阶段冲洗（0:00-2:00分钟）以移除粘弹剂并且评价苯肾上腺素的瞳孔散大效果，并且继续通过第2阶段冲洗（2:00-4:00分钟），之后将粘弹剂再次引入眼前房并且执行撕囊术。在撕囊术后开始进行并且持续14分钟后进行第3阶段冲洗（4:00-18:00分钟），在其早期阶段，通过应用晶状体乳化能量将晶状体碎片化并吸出。第4阶段冲洗在导入pmma晶状体后发生，以排出用于手术而导入的粘弹剂材料和为移除任何额外的晶状体碎片。在单独使用bss冲洗眼前房开始前20分钟使用两滴1%托品酰胺对托品酰胺对照动物预治疗。
在最初的数个动物手术后，起始的预晶状体乳化冲洗的持续时间从2分钟延长至4分钟以获得最大瞳孔扩张。
实验的第二个系列，称为2期，评估晶状体乳化手术后的瞳孔散大和炎症，其中使用了含有低、中、高浓度的酮咯酸或不使用酮咯酸（阴性对照）的bss灌流液。使用没有瞳孔散大剂的冲洗液起始眼前房灌注以评价酮咯酸和bss单独使用的瞳孔散大效果。在2分钟的冲洗和瞳孔散大的评价后，将在1期实验中发现有效实现瞳孔散大的苯肾上腺素的浓度（30um）包含于灌流溶液中，为执行的晶状体乳化方法提供充分的扩张。对酮咯酸功效的次要终点是瞳孔散大，并且主要终点是激光闪光光度测定、眼前房炎症验证测量。
bss灌流液通过晶状体乳化针在没有酮咯酸或含有浓度为3.0m、10m、30m（见表1）的酮咯酸的情况下进行递送。应用第1阶段冲洗（0:00-2:00分钟）以移除粘弹剂并且评价酮咯酸的瞳孔散大效果。随后将高浓度苯肾上腺素添加至灌流液瓶（以达到30m浓度），冲洗角膜线（line）并且在整个第2阶段（2:00-4:00分钟）继续冲洗，之后将粘弹剂再次引入眼前房并且执行撕囊术。在撕囊术后开始第3阶段冲洗（4:00-18:00分钟）并且继续总共14分钟，在其早期阶段期间施加晶状体乳化能量。第4阶段冲洗在导入pmma晶状体后发生。
结果
在眼前房灌注开始第一分钟内1-2mm的初始瞳孔扩张后，对具有对直径显著的时间效应（f=2.75，p<0.0001）的全部治疗组（见图21和22）在约5分钟内瞳孔直径渐进地达到最大扩张。在第一组实验中，趋势表明苯肾上腺素在bss灌流液中的存在导致了瞳孔直径的浓度依赖性增加。在对照组中展示的初始扩张（0-2分钟）（其在单独使用bss冲洗前20分钟接受局部的托品酰胺治疗），似乎不是药理效果并且反映了在全部组中眼前房冲洗开始后前2分钟内测量的扩张的分量，涉及导入以允许角膜切口形成的粘弹剂的清理和冲洗/抽吸可能的流体效应。然而，需要注意的是，在托品酰胺对照组中由基线开始的早期的额外扩张在手术的开始比全部其它治疗组（f=7.73，p<0.0001）更高，并且导致比由中、高、最高浓度苯肾上腺素组展示的更低的最大扩张。最高、高和中苯肾上腺素组和低苯肾上腺素组之间的差异在6:00、8:00、10:00、14:00、18:00和19:00分钟时间点显著（分别地；f=2.41，p<0.043；f=2.66，p<0.0315；f=3.24，p<0.0136；f=6.62，p<0.0002；f=9.26，p<0.0001；f=3.79，p<0.005；studentnewman-keuls检验，α=0.05，df=23，见图21），确认了在术中瞳孔散大幅度上的苯肾上腺素灌流液的浓度依赖效应。最高、高和中浓度苯肾上腺素组相比低浓度苯肾上腺素和托品酰胺对照组之间的差异在14:00和18:00分钟时间点显著（分别地；f=6.62，p<0.0002；f=9.26，p<0.0001；studentnewman-keuls检验，α=0.05，df=23，见图21），指示在延长的术中瞳孔散大中的苯肾上腺素的浓度依赖效应。全部其它组在全部其它时间点之间的差异按照studentnewman-keuls标准不显著，但是在组中平均瞳孔直径中观察到的趋势显示了苯肾上腺素组之间发生速度和瞳孔散大效果幅度上的浓度依赖。在稍后的时间点在高苯肾上腺素治疗组中的平均扩大接近了在该物种成年眼睛中8.3mm的瞳孔散大的解剖学限制（对应于角膜缘的内径）。
在实验的第二组中，其中在导入30μm苯肾上腺素前使用含有3-30μm酮咯酸的bss或单独的bss冲洗眼前房2分钟，在灌注开始的30秒内瞳孔直径有迅速的1-2mm增加，随后在30秒和2分钟之间有较不迅速的不依赖浓度的提升。在最初2分钟期间在酮咯酸治疗组和bss治疗动物之间没有观察到统计学差异。如通过在第一组实验中的苯肾上腺素和托品酰胺对照组的表现证实的，考虑到通过bss对照组证明了相同的表现，可能该初始扩张涉及粘弹剂清除和冲洗/抽吸的流体效应。在2分钟在全部酮咯酸和bss治疗动物中导入30m苯肾上腺素后，在4分钟时在全部达到最大扩张的组中瞳孔直径有进一步的快速增加。在4分钟初始灌注和当执行撕囊术时晶状体乳化的起始之间的间隔瞳孔直径轻微的减少后，最大扩张在剩余的灌注时期维持。没有统计学显著的组差异，除了低和中浓度酮咯酸组相比bss和高浓度酮咯酸组在14:00和18:00分钟时间点之间（低和中>bss和高；分别地；f=6.62，p<0.0002；f=9.26，p<0.0001；studentnewman-keuls检验，α=0.05，df=23，见图2）。然而，该差异的治疗分组暗示差异不是由酮咯酸效果导致的，并且可能涉及有限的样本量，并反映动物间和方法间的差异。在两个实验研究集合的全部治疗组中，瞳孔在手术结束时放置晶状体后收缩。
在全部治疗组的治疗（右）眼中，基线术前眼前房闪光测量范围从3.0至12.7光子单位/ms（平均值=6.0+/-2.4sd）。在对照（左）眼中的闪光测量在研究的持续时间内维持在该范围中。这些测量与通过裂隙灯活组织显微镜检查执行的眼前房闪光评价匹配，验证了激光闪光光度计在眼静止的自然状态下，在眼前房中蛋白质密度定量中的实用性。在全部治疗组中，在治疗眼中闪光测量有显著的时间效应（f=2.16，p<0.0034），进一步确认了闪光光度计在涉及炎症的量化干预中的实用性（见图23、24和25）。在治疗眼中闪光测量在基线相比4.5和24小时，相比48和168小时在全部治疗组中显著地不同（f=2.16，p<0.0034；studentnewman-keuls检验，α=0.05，df=75）。对照和治疗眼之间的差异在全部主体的全部术后检验时间点均不同（f=236.64，p<0.0001；studentnewman-keuls检验，α=0.05，df=195）。
在第一组实验中，随着理想参数被精细化，晶状体乳化持续时间在治疗组中各不相同。已确定在前4个外科手术中，晶状体乳化时间导致严重的炎症反应并且同意减少晶状体乳化。较长的晶状体乳化持续时间（45-55秒）相比较短的持续时间（15-25秒）组的分析在4.5小时和24小时时间点显示了在晶状体乳化持续时间闪光测量中统计学地显著增加（f=4.42，p<0.0018；studentnewman-keuls检验，α=0.05，df=14；见图24），确认了激光闪光光度计在定量眼前房损伤和炎症程度中的实用性。该差异通过48小时和1周时间点消除。
排除高晶状体乳化能量主体的分析，其中包括每个高苯肾上腺素和托品酰胺组中的2只猴，相对于在全部时间点的托品酰胺对照，在苯肾上腺素的闪光测量上没有治疗效果展现（studentnewman-keuls检验，α=0.05，df=7）。
在第二组实验中，不管小的组大小，对于中和高酮咯酸组中闪光测量的减少存在一致的趋势。在bss对照组与中和高浓度酮咯酸组的闪光测量之间存在统计学显著性差异，其在4.5小时时间点实现显著性，此时将这两个治疗组组合以有利于分析（f=5.17，p<0.0223；studentnewman-keuls检验，α=0.05，df=13；见图25）。相比于对照组，在高和低剂量酮咯酸组中闪光测量在24和48小时时间点保持较低，但是这些差异没有实现统计学显著，不论高和低剂量酮咯酸组组合地或分别地分析，考虑到分析的能力。在1周时任何治疗组之间没有统计学显著差异，但是高浓度酮咯酸组维持了相似的趋势。
结论
非洲绿猴晶状体乳化模型允许关于人临床终点的瞳孔散大和炎症测量的定量。这些测量中，视频瞳孔直径评价和眼前房闪光光度测定在评价的时间点对治疗效果是最敏感的。视频瞳孔数据证明在眼前房灌流液中苯肾上腺素的术中递送导致了迅速发生的瞳孔散大，其在外科手术期间维持。获得的最大瞳孔散大是浓度依赖的，在评估的全部浓度对于执行的晶状体乳化手术具有充足的瞳孔散大。浓度等于或大于10m导致超过通过术前局部1%托品酰胺（白内障手术的标准治疗）获得的瞳孔散大。闪光光度测定和厚度测量没有指示眼前房炎症或角膜水肿的减少与苯肾上腺素向眼前房灌流液添加有关。
视频瞳孔数据证明在眼前房灌流液中酮咯酸的术中递送没有导致与单独使用bss观察到的瞳孔散大实质上不同的变化。然而，一旦将浓度为30m的苯肾上腺素添加至灌流液中，则发生迅速的扩张，证实了先前证明的苯肾上腺素的术中递送的实用性。闪光光度测定量度指示了术后立即在4.5小时，酮咯酸对眼前房炎症的积极效果。
实施例7
在晶状体乳化手术模型中苯肾上腺素和酮咯酸组合的研究
使用含有90µmpe和30µmke的冲洗液进行非glp研究以评估当在白内障手术期间通过眼内冲洗施用时组合对瞳孔散大和炎症终点的影响。在该实验系列中，将14只猴按7只分组并进行研究以建立单独的bss相比含有pe和ke组合的bss灌流液的功效。功效终点包括瞳孔散大和作为眼前房炎症量度的激光闪光光度测定。对照组额外地术前地接受毒蕈碱瞳孔散大剂托品酰胺以允许充分的扩张以使用晶状体乳化手术的非洲绿猴模型。
结果
用pe-ke组合冲洗的动物在冲洗约60秒内实现了6.0-6.5mm的瞳孔扩张（见图26）。这些值与在术前使用托品酰胺治疗后获得的那些相等。在眼前房灌流开始的第一分钟内初始瞳孔扩张3.0-4.0mm后，瞳孔直径对于托品酰胺对照和pe-ke治疗组分别地在约2.5和3.5分钟内进入稳定状态（见图1），在瞳孔直径上具有显著的时间效应（f=86.69，p<0.0001；studentnewman-keuls检验，α=0.05，df=12）。在对照组中展示的初始扩张（0-2分钟，在单独使用bss冲洗前20分钟接受局部托品酰胺），似乎不是药理效应并且反映了冲洗/抽吸的流体效应和/或与导入以允许形成角膜切口的粘弹剂的清理有关的扩张。然而，应当注意的是，在从基线扩张起始的托品酰胺对照组中的早期额外的扩张在手术开始时比治疗组大（f=86.69，p<0.0001；见图26），并且导致了比由pe-ke治疗组展示的更小的最大扩张。pe-ke介导的瞳孔扩张超过了由托品酰胺的术前施用在眼前房冲洗起始的90秒内实现的扩张。对照组和接受pe-ke的治疗组之间的差异在0:00、3:30、4:00、4:30、5:00、5:30、6:00、8:00、10:00、12:00、12:30和13:00分钟时间点是显著的（分别地；f=25.08，p<0.003；f=5.61，p<0.0355；f=9.95，p<0.0083；f=14.71，p<0.0024；f=18.01，p<0.0011；f=9.93，p<0.0084；f=10.39，p<0.0073；f=14.77，p<0.0023；f=14.77，p<0.0023；f=28.65，p<0.0002；f=20.51，p<0.0007；f=8.66，p<0.0134；f=5.48，p<0.0391；studentnewman-keuls检验，α=0.05，df=12；见图26）。
观察到的组差异证实了含有苯肾上腺素和酮咯酸的pe-ke灌流液在术中瞳孔散大幅度和术中瞳孔散大延长上的治疗效果。按照studentnewman-keuls标准，两组在早期时间点之间的差异不显著，反映了组内可变性，但是在平均瞳孔直径中观察到的趋势表明了对发生速率和瞳孔散大效果幅度的治疗效果。在较晚的时间点pe-ke治疗组中一些主体中平均扩张接近了在该物种中成年眼~10.5mm的瞳孔散大的解剖学限制（对应于角膜缘的内直径）。
在两治疗组的手术（右）眼中基线术前眼前房闪光测量范围从1.6至9.9光子单位/ms（平均值=5.3+/-2.3）。在两治疗组中在受治疗眼中在闪光测量上有显著的时间效应，进一步证实了闪光光度测定在涉及炎症的量化干预中的实用性（见图27）。在治疗眼中在基线的闪光测量相比2、4.5、24、48小时和1周在两治疗组中均有显著差异（f=4.94，p<0.0008；studentnewman-keuls检验，α=0.05，df=59）。
pe-ke治疗组相对于托品酰胺对照组随时间具有闪光测量的较低值，但是在任何时间点它们均没有实现统计学上的显著（f=3.32，p<0.0935；studentnewman-keuls检验，α=0.05，df=12；见图27），这在某种程度上反映了主体对实验干预应答的大的可变性。一个pe-ke治疗主体在眼前房冲洗期间（伴随晶状体移除）展示了更有限的瞳孔扩张。排除该动物的闪光测量的分析在2-、4.5-、24-和48-小时时间点展示了pe-ke治疗组和托品酰胺对照组之间的统计学显著差异（f=9.74，p<0.0097；studentnewman-keuls检验，α=0.05，df=11；见图28）。在1周时治疗组之间没有统计学显著差异。
结论
非洲绿猴晶状体乳化模型允许对相关人临床终点的瞳孔散大和炎症测量的定量。这些测量中，视频瞳孔直径评价和眼前房闪光光度测定在评价的时间点中是对治疗效果最敏感的。视频瞳孔数据证明在眼前房灌流液中pe-ke的术中递送导致了瞳孔散大的迅速发生，其在手术过程中维持。获得的瞳孔散大足够用于在冲洗起始的60秒内执行的晶状体乳化手术。瞳孔散大的程度超过了通过术前局部1%托品酰胺（白内障手术的标准护理）获得的瞳孔散大。闪光光度测定量度暗示了pe-ke对于在术后立即的眼前房炎症的积极效果。
实施例8
在晶状体乳化手术模型中苯肾上腺素和酮咯酸组合的剂量应答研究
进行该非glp研究以建立含有pe和ke的低-、中-、高-浓度冲洗液对非洲绿猴前房递送后的剂量应答和瞳孔散大的时间进程。在20mm柠檬酸钠缓冲剂（ph6.5）中pe-ke制剂含有固定比例为3:1的45mm苯肾上腺素和15mm酮咯酸。提供额外的浓缩的450mm苯肾上腺素hcl（pe）制剂以提升在高剂量组中的苯肾上腺素浓度。瞳孔散大的时间进程通过在四只猴中低浓度pe和ke（90:30μm）冲洗液前房施用、在四只猴中中浓度pe和ke（268:89μm）冲洗液前房施用后和在四只猴中根据高浓度pe和ke（1165:89μm）冲洗液前房施用后的视频进行评估。全部前房施用的体积为150μl，使用注射器体积喷射至眼前房中，经过约5秒的时间段发生。
为混合低浓度（pe:ke为90:30µm），从1小瓶pe-ke药物组合物中抽取1.0ml并且注射进入500-mlbss冲洗瓶。对于中浓度（pe:ke为268:89µm），使用3小瓶pe-ke药物组合物，从每瓶取出1.0ml并且注射进入500-mlbss冲洗瓶。对于高浓度组（pe:ke为1165:89µm），将额外的盐酸苯肾上腺素添加至bss溶液中的pe：ke。
结果
用前房pe/ke冲洗液注射的猴在冲洗60秒内实现了约6-7mm的瞳孔扩张。如在图29中显示的，在初始的迅速瞳孔扩张后，瞳孔直径在约1分钟时间点达到稳定，在全部治疗组中在瞳孔直径上具有显著的时间效应（f=64.33，p<0.0001）。低剂量组（90:30μm）和高剂量组（1165:89μm）之间的差异在1:30-、3:00-和3:30-分钟时间点统计学显著（studentnewman-keuls检验，α=0.05，df=9）。
结论
非洲绿猴瞳孔散大模型允许相关人临床终点的瞳孔应答的定量。视频瞳孔数据证明pe-ke的前房内递送至眼前房内导致瞳孔散大的迅速发生，其维持10分钟的时间段，在此期间进行视频记录。获得的瞳孔散大对在施用后初始的60秒内执行的晶状体乳化手术方法是充分的。瞳孔散大的程度比在先前功效研究的对照组中通过局部1%托品酰胺（平均瞳孔直径为5.9mm，白内障手术的标准护理）的术前递送获得的瞳孔散大要更大。
实施例9
在晶状体乳化手术模型中苯肾上腺素和酮咯酸组合的安全性研究
在非洲绿猴中实施非临床glp毒性研究。在该研究中12只雄性和12只雌性猴经历了晶状体乳化手术和晶状体置换，以及2周恢复。在手术期间进行了pe-ke冲洗液对眼前房和相关眼部结构的连续冲洗并且代表该产品意向的施用途径。对三种浓度进行了评估：在低浓度组中720μmpe和90μmke（720:90μm），在中浓度组中2160μmpe和270μmke（2160:270μm）和在高浓度组中7200μmpe和900μmke（7200:900μm）。
同样评估了单独的对照组。将相等数量的雄性和雌性动物基于重量排列分配至各组以实现平衡的平均重量。全部动物在第0天经历外科手术以替换眼内晶状体。
结果
全部动物良好地耐受了手术，具有无事件的恢复，并且存活至预定日程的处死和尸体剖检。在呼吸和心血管观察和全部临床实验室参数上没有观察到治疗相关的效应。
每种pe/ke冲洗液的150μl的初始前房内递送导致在30秒内的快速瞳孔扩张，并且扩张以剂量依赖的方式增加至6.76±0.15至7.29±0.15mm（平均值±sd）。150μl单独的bss的前房内递送后30秒，托品酰胺对照组的瞳孔直径为5.18±0.18mm。
低浓度治疗组相比于托品酰胺对照组在4.5小时和14天具有更低的闪光测量值，但是它们在任何时间点没有实现统计学显著，在高浓度治疗组中的闪光应答在全部时间点与对照组的几乎完全相同。中浓度治疗组相比于托品酰胺对照、低浓度和高浓度在全部手术后时间点具有更高的闪光测量，在2、4.5和24小时获得显著性。这些发现认为对在中浓度治疗组中更大的手术创伤是次要的。在闪光上没有观察到浓度依赖效应。在2周时，在治疗组之间没有统计学显著差异。
在对照组、低浓度组和高浓度组中，有随着晶状体乳化手术存在眼内压的减少，但是与基线的差异没有达到显著。在4.5小时时间点，中浓度治疗组的眼内压显著地比其它治疗组高，但是与基线相比没有差异。存在术后眼内压减少的整体趋势。
瞳孔、角膜、晶状体和虹膜的基线临床评估处于全部动物的手术（右）和非手术（左）眼的正常限制内。在24小时时间点瞳孔直径回复至基线，表明最小的残留的治疗相关的瞳孔散大或瞳孔缩小效应。
实施例10
临床研究
2b期人临床研究评估了根据本发明的配方1配制的酮咯酸和苯肾上腺素组合药物组合物，评估了其对维持术中瞳孔散大（瞳孔扩张）和减少由白内障和其它晶状体置换手术导致的术后疼痛和刺激的效果。将组合药物组合物在眼内外科手术期间在眼内施用前稀释于平衡盐溶液冲洗载体中。
主体2b期研究是随机的、平行组、媒介物对照的因子设计研究，并且进行该研究以在经历了使用同轴晶状体乳化方法的单侧白内障提取与晶状体置换（celr），具有丙烯酸晶状体插入的主体中比较苯肾上腺素（pe）、酮咯酸（ke）和含有pe和ke的组合药物组合物。检验冲洗液的施用以双盲样式发生。在4组全因子设计（four-armfull-factorialdesign）中，所述研究评估了当在平衡盐溶液（bss）中稀释施用时，两种活性药物成分（pe和ke，单独和组合）对瞳孔散大的维持和术后疼痛减轻的贡献。研究还探索了组合药物组合物、pe和ke在术后炎症上的效果。主体以1:1:1:1的形式随机进入以下4个治疗组之一。
a.bss媒介物
b.在bss中483µmpe
c.在bss中89µmke
d.在bss中含有483µmpe和89µmke的组合药物组合物。
该研究中的全部主体受到术前瞳孔散大和麻醉。在4个组的每一个中，相应的冲洗治疗作为celr手术期间眼前房的单一冲洗施用，在该研究中具有平均为8分钟的暴露。此外，在手术结束时，眼前房使用冲洗治疗填充。测量从手术基线（在刚刚手术切开前）至外科手术结束（伤口缝合）随时间的瞳孔直径变化，并测量在手术当天的术后疼痛，如通过视觉模拟量表（visualanalogscale，vas）在2、4、6、8和10-12小时和其它时间所测量，由患者在服用救援止痛药前记录。
在该223名患者的2b期临床研究中，相比于bss或ke组，使用组合药物组合物治疗的主体在白内障手术期间展示了统计学显著的（p<0.0001）和有临床意义的瞳孔散大的维持。考虑到眼科医生通过瞳孔操作，瞳孔散大的维持对于安全和熟练地执行晶状体置换是关键的。如果瞳孔散大不能在手术期间维持，眼内结构损伤的风险会增加并且需要的手术时间通常会延长。在手术期间的任何瞳孔大小的减少可以对手术技术造成干扰。在该研究中在切口时平均瞳孔直径是8.3mm。2.5mm或更多（极端的收缩）的减少代表30%直径和52%的平均瞳孔面积的丧失，具有对手术极端影响的潜在性。出人意料地，相比于在组合药物组合物组中只有4%的主体，该研究证明在bss组中21%的主体和在ke组中21%的主体经历了该极端收缩。
在晶状体置换手术期间，当瞳孔直径小于6mm时术中并发症增加。对于术中瞳孔直径的意向性治疗基础上的分类分析，用于鉴定经历该瞳孔收缩水平的研究主体的比例。在该研究中，当与其它3个治疗组比较时，组合药物组合物在预防此瞳孔收缩程度（即瞳孔缩小至直径小于6mm）方面是统计学上显著优越的（表xx）。
表5
在celr期间具有瞳孔直径<6mm的主体
*fet相比于pe-ke组合。
瞳孔直径中的临床显著的减少与手术相关并发症的增加有关，包括后囊膜撕裂、晶状体碎片保留和玻璃体渗漏。这些发现证明苯肾上腺素和酮咯酸在防止临床意义的瞳孔收缩中均有贡献并且协同地作用。
该发现是出人意料的，因为苯肾上腺素是强大的瞳孔散大剂并且会期望单独抑制瞳孔收缩。出人意料地，酮咯酸在苯肾上腺素效果顶部还提供抗瞳孔收缩效果。
此外，组合药物组合物相比于pe（p=0.0089）或bss（p=0.0418）组同样显著地在术后早期（手术后10-12小时）减少疼痛。令人惊讶地，组合药物组合物同样减少温和和严重疼痛抱怨的频率（在bss治疗主体中抱怨多2.5倍）。在该研究中药物组合物是安全的并且良好耐受的。
该研究证明在上文限定的申请中要求保护的本发明组合物和用途防止了令人惊讶的极度瞳孔收缩程度，并且导致了在手术期间暴露于检验药物仅数分钟后意想不到的中等的和严重的术后疼痛的减少直到手术后10-12小时。
虽然前述发明为了清晰理解的目的已经通过说明和实例的方式详尽地描述，但是鉴于该发明的教导其对于本领域普通技术人员容易显而易见的是可以对其进行某些改变和修改而不偏离所附权利要求的精神和范围。