本发明属于日用化妆品
技术领域：
，具体涉及一种玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜及其制备方法。
背景技术：
目前黑眼圈、眼袋、眼尾纹等眼部问题主要由内因：内分泌不协调，情绪波动大，眼疲劳、细胞衰老使眼部血液循环受阻黑色素堆积；外因：日晒、吸烟、熬夜、习惯性斜视，使真皮层的胶原蛋白被氧化、断裂等。为针对这两种情况，市面上推出许多治疗方法和产品，治疗方法有中医调理和西医手术，中医调理主要通过服用中药，调理内分泌，进而改善表肌，缓解眼部问题，此方法耗时长、中药煎煮麻烦而且需要通过饮食配伍等才能达到效果；西医手术是今年新流行的治疗方法，通过切除衰老、多余的皮肤刺激皮肤再生功能，但该方法因个人眼部情况差异大，技术要求高，危险性大，费用高，大多数有眼部问题的人员不愿意去尝试。产品中市面上有各种各样的眼霜、眼精华、眼膜等，通过添加多种中药提取物来去除黑眼圈、眼袋、眼角纹等问题，但大多数眼霜都是通过补水保湿暂时缓解眼部问题，或因眼部皮肤薄(0.3mm)无法吸收过多的中药提取物形成眼部脂肪粒等情况，并且从根本上无法有效的刺激眼部肌肤自我修复和再生。但自从2003年，瑞士科学家dr.fredzulli发现了一种苹果干细胞具有去除皱纹抗衰老及延长细胞寿命的美容奇效，随后，苹果干细胞被首次应用到化妆品中，为植物干细胞在延缓衰老的研究领域中奠定了基础。植物干细胞美容技术及其相关产品正受到美容界专家及业内人士的广泛关注，继苹果干细胞之后，紫草干细胞，摩洛哥坚果干细胞也已经被开发成美容产品，如中国专利申请号201610268493.6公开了芦荟干细胞冻干粉及其制备方法和应用，该方法可获得大量的芦荟干细胞并且不会损伤其主要成分芦荟苷的含量。为此随着现代技术的发展，利用干细胞未充分分化，具有无限自我更新复制和分化的潜能而用于化妆品行业是趋势所需。玫瑰茄(hibiscussabdariffalinn.)又名洛神花、洪金梅、红梅果，是锦葵科木槿属，生长期为一年的草本植物，产于热带和亚热带。玫瑰茄花含有的黄酮类化合物有黄酮醇和黄烷醇，它们以单体或聚合物的形式存在，包括木槿苷、棉黄苷、槲皮素、木樨草素、绿原酸、原儿茶酸、丁香酚、麦角固醇、γ-生育酚等。多种物质均具有抗氧化和抗衰老的生物活性，因此，玫瑰茄干细胞具有较强的抗氧化的作用，是一种纯天然、无毒无污染的抗衰老植物干细胞，在我国的广东、广西、福建、云南等地已经广泛种植玫瑰茄，将玫瑰茄干细胞制成冻干粉，再运用到化妆品特别是抗衰老产品的制备中，不仅不需要担心化妆品原料来源和质量的问题，还开拓了化妆品新领域，开发国内首款植物干细胞抗衰老产品。技术实现要素：为解决现有技术中的对治疗眼部问题的方法时间长，危险性大，费用高以及眼部护肤品只起到了表面补水、保湿的效果，没有从根本上解决眼部皮肤衰老的问题，本产品以玫瑰茄干细胞冻干粉为功效成分，刺激人角化细胞增殖，提高细胞内sod酶的活性，从而减少因紫外线辐射诱导产生的氧自由基对细胞的攻击和损害，并添加聚合杏仁蛋白，富醚斯金和角鲨烷等抗皱、抗氧化、紧致肌肤、抵抗松弛的成分，旨在降低细胞的死亡率，起到修复细胞，保护细胞和紧致肌肤的作用。本发明提供的一种玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜，包括以下成分及其重量：玫瑰茄干细胞冻干粉8.0-20.0g，丙二醇1.0-4.0g，丙三醇2.0-6.0g，丁二醇1.0-5.0g，卡波9400.1-0.6g，防腐剂0.1-0.2g，二甲基硅氧烷0.5-2.0g，辛酸癸酸三甘油酯1.0-4.0g，棕榈酸异丙酯1.0-4.0g，合成角鲨烷1.0-3.0g，鲸蜡硬酯醇醚2.0-6.0g，聚合杏仁蛋白1.0-3.0g，富醚斯金0.5-2.0g，三乙醇胺0.2-0.4g和水50-100g。优选地，一种玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜，所述眼霜的配方如下：玫瑰茄干细胞冻干粉10ng，防腐剂0.15g，丙二醇2g，丙三醇4g，丁二醇3g，卡波0.35g，二甲基硅氧烷1g，辛酸癸酸三甘油酯3g，棕榈酸异丙酯3g，合成角鲨烷2g，鲸蜡硬酯醇醚3.5g，聚合杏仁蛋白2g，富醚斯金1g，三乙醇胺0.35g和水85g。进一步地，本发明提供的玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜，所述的鲸蜡硬酯醇醚为鲸蜡硬酯醇醚-2。进一步地，本发明提供的玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜，所述的防腐剂为euxylk350。进一步地，本发明提供的玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜，所述的玫瑰茄干细胞冻干粉的制备方法步骤如下：a.取玫瑰茄组织，清洗，消毒；b.将得到的玫瑰茄切成5mm*5mm*5mm大小，接种至含有硫酸锌2-3mg/l、柠檬酸75-80mg/l、甘氨酸78-82mg/l、吲哚乙酸1.0-2.0mg/l、蔗糖10.5-11.5mg/l、活性炭0.45-1g/l、芦荟苷3-5mg/ml和琼脂2.8-3.5mg/l的固体培养基上，培养温度为24-28℃，ph值为6.2-6.8，培养12-18天，得形成层来源的玫瑰茄干细胞；c.将形成层来源的玫瑰茄干细胞转移至含有硫酸镁180-182mg/l、柠檬酸75-80mg/l，甘氨酸76.0-84.0mg/l、吲哚乙酸1.0-2.0mg/l、蔗糖32.0-34.0mg/l、芦荟苷3-5mg/ml、麦饭石颗粒65-75mg/l和硒矿石颗粒65-75mg/l的液态培养基中培养；d.将步骤c培养收集的形成层来源的玫瑰茄干细胞移入气升式生物反应器内培养，培养液使用步骤c的液态培养液，在常温下不断搅拌，培养至第7天，向气升式生物反应器内注入蔗糖、甲基茉莉酮酸酯和无菌磁化水；e.将步骤d的气升式生物反应器内的培养液通过过滤器过滤，将截留的细胞系培养物取出，放入-80℃冰箱超低温冷冻2-3h，取出室温解冻30-40min，重复3-5次；最后一次解冻后利用超声波破碎仪破碎细胞，收集滤液，浓缩，得玫瑰茄干细胞提取物；f.往步骤e中的玫瑰茄干细胞提取物加水调节蛋白质的终浓度为50±0.5μg/ml，加入玫瑰茄干细胞提取物总质量的4-6％的冻干保护剂，灭菌，在温度为-20～-35℃，真空度为50～200pa中冻干，制得玫瑰茄干细胞冻干粉。优选地，本发明提供的玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜的制备，所述步骤a中的切取的玫瑰茄组织为去除根冠的玫瑰茄根尖。优选地，本发明提供的玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜的制备，所述步骤e中的过滤器为0.45μm的无菌微孔滤膜，超声条件为4℃、40w、超声3s、间隔3s，总耗时9min。优选地，本发明提供的玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜的制备，所述步骤f中的冻干保护剂为l-脯氨酸，l-脯氨酸是植物蛋白质的组分之一，是理想的渗透调节物质，可作为膜和酶的保护物质及自由基清除剂，可起到对细胞质渗透平衡的调节作用。本发明所述的玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜的制备步骤如下：s1：将丙二醇，丙三醇，丁二醇，卡波940和防腐剂混合溶于水中，加热至75-80℃，搅拌至完全溶解，得混合物a；s2：将二甲基硅氧烷，辛酸癸酸三甘油酯，棕榈酸异丙酯，合成角鲨烷，鲸蜡硬酯醇醚混合溶于水中，加热至75-80℃，搅拌至完全溶解，得混合物b；s3：将步骤s2中制得的混合物b，加入步骤s1中制得的混合物a中，放入均质机中均值3～5min，冷却至30～50℃，得混合物c；s4：将玫瑰茄干细胞冻干粉，聚合杏仁蛋白和富醚斯金溶于水中，搅拌至完全溶解，得混合物d；s5：将步骤s4中制得的混合物d和三乙醇胺加入步骤s3中制得的混合物c中，均质即得。本发明提供的玫瑰茄干细胞冻干粉的制备方法在培养过程中无细胞变异，细胞增殖分裂快速，分离培养的玫瑰茄干细胞纯度高，可以达到95％以上，有利于该玫瑰茄干细胞冻干粉的制备方法的推广和应用。本发明的玫瑰茄干细胞冻干粉制备中，培养基中的吲哚乙酸为植物生长素，促进根尖增殖分裂成形成层细胞，加入的芦荟苷为植物提取的提取物，具有抑菌作用，减少了抗生素的添加，另外我们还发现，在培养基内同时加入吲哚乙酸和芦荟苷可更好地促进细胞增殖生长，缩短培养时间。对比现有技术，本发明提供的玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜及其制备方法，具有以下优点：1)本发明提供的玫瑰茄干细胞冻干粉的制备方法中添加了芦荟苷，芦荟苷不仅具有抑菌效果，与吲哚乙酸相结合，明显缩短了细胞培养周期短，促进细胞增殖；2)本发明制得的玫瑰茄干细胞冻干粉制备方法简单可重复性高，利用了玫瑰茄干细胞具有修复受损细胞、促进细胞再生、保护肌肤作用，再结合聚合杏仁蛋白、富醚斯金、合成角鲨烷，相互协同，起到紧致肌肤的作用，对人体皮肤具有抗老化及延长细胞寿命的效果；3)本发明制得的玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜对眼部的鱼尾纹、眼袋、黑眼圈、皮肤松弛具有显著的改善作用。具体实施方式：实施例1：一种玫瑰茄干细胞冻干粉的制备：a.取切玫瑰茄根尖，清洗，消毒；b.将得到的玫瑰茄切成5mm*5mm*5mm大小，接种至含有硫酸锌2.5mg/l、柠檬酸75.5mg/l、甘氨酸80.0mg/l、吲哚乙酸1.5mg/l、蔗糖11.0mg/l、活性炭0.8g/l、芦荟苷4.5mg/ml和琼脂3.2mg/l的固体培养基上，培养温度为25℃，ph值为6.5，培养14天，得形成层来源的玫瑰茄干细胞；c.将形成层来源的玫瑰茄干细胞转移至含有硫酸镁181mg/l、柠檬酸79mg/l，甘氨酸78.0mg/l、吲哚乙酸1.5mg/l、蔗糖33.0mg/l、芦荟苷2.5mg/ml、麦饭石颗粒70.0mg/l和硒矿石颗粒70.0mg/l的液态培养基中培养；d.将步骤c培养收集的形成层来源的玫瑰茄干细胞移入气升式生物反应器内培养，培养液使用步骤c的液态培养液，在常温下不断搅拌，培养至第7天，向气升式生物反应器内注入蔗糖、甲基茉莉酮酸酯和无菌磁化水；e.将步骤d的气升式生物反应器内的培养液通过0.45μm的无菌微孔滤膜，将截留的细胞系培养物取出，放入-80℃冰箱超低温冷冻2h，取出室温解冻30min，重复4次；最后一次解冻后利用超声波破碎仪破碎细胞，超声条件为4℃、40w、超声3s、间隔3s，总耗时9min。收集滤液，将滤液浓缩，得到玫瑰茄干细胞提取物；f.往步骤e中的玫瑰茄干细胞提取物加水调节蛋白质的终浓度为50±0.5μg/ml，加入玫瑰茄干细胞提取物总质量的5％的l-脯氨酸，灭菌，在温度为-20～-35℃，真空度为50pa中冻干，制得玫瑰茄干细胞冻干粉。对比例1：一种玫瑰茄干细胞冻干粉的制备：a.取切玫瑰茄根尖，清洗，消毒；b.将得到的玫瑰茄切成5mm*5mm*5mm大小，接种至含有硫酸锌2.5mg/l、柠檬酸75.5mg/l、甘氨酸80.0mg/l、吲哚乙酸1.5mg/l、蔗糖11.0mg/l、活性炭0.8g/l和琼脂3.2mg/l的固体培养基上，培养温度为25℃，ph值为6.5，培养14天，得形成层来源的玫瑰茄干细胞；c.将形成层来源的玫瑰茄干细胞转移至含有硫酸镁181mg/l、柠檬酸79mg/l，甘氨酸78.0mg/l、吲哚乙酸1.5mg/l、蔗糖33.0mg/l、麦饭石颗粒70.0mg/l和硒矿石颗粒70.0mg/l的液态培养基中培养；d.将步骤c培养收集的形成层来源的玫瑰茄干细胞移入气升式生物反应器内培养，培养液使用步骤c的液态培养液，在常温下不断搅拌，培养至第7天，向气升式生物反应器内注入蔗糖、甲基茉莉酮酸酯和无菌磁化水；e.将步骤d的气升式生物反应器内的培养液通过0.45μm的无菌微孔滤膜，将截留的细胞系培养物取出，放入-80℃冰箱超低温冷冻2h，取出室温解冻30min，重复4次；最后一次解冻后利用超声波破碎仪破碎细胞，超声条件为4℃、40w、超声3s、间隔3s，总耗时9min。收集滤液，将滤液浓缩，得到玫瑰茄干细胞提取物；f.往步骤e中的玫瑰茄干细胞提取物加水调节蛋白质的终浓度为50±0.5μg/ml，加入玫瑰茄干细胞提取物总质量的5％的l-脯氨酸，灭菌，在温度为-20～-35℃，真空度为50pa中冻干，制得玫瑰茄干细胞冻干粉。对比例1与实施例1的培养基的区别在于，对比例1未添加芦荟苷。对比例2：一种玫瑰茄干细胞冻干粉的制备：a.取切玫瑰茄根尖，清洗，消毒；b.将得到的玫瑰茄切成5mm*5mm*5mm大小，接种至含有硫酸锌2.5mg/l、柠檬酸75.5mg/l、甘氨酸80.0mg/l、萘乙酸2.5mg/l、蔗糖11.0mg/l、活性炭0.8g/l和琼脂3.2mg/l的固体培养基上，培养温度为25℃，ph值为6.5，培养14天，得形成层来源的玫瑰茄干细胞；c.将形成层来源的玫瑰茄干细胞转移至含有硫酸镁181mg/l、柠檬酸79mg/l，甘氨酸78.0mg/l、萘乙酸2.5mg/l、蔗糖33.0mg/l、麦饭石颗粒70.0mg/l和硒矿石颗粒70.0mg/l的液态培养基中培养；d.将步骤c培养收集的形成层来源的玫瑰茄干细胞移入气升式生物反应器内培养，培养液使用步骤c的液态培养液，在常温下不断搅拌，培养至第7天，向气升式生物反应器内注入蔗糖、甲基茉莉酮酸酯和无菌磁化水；e.将步骤d的气升式生物反应器内的培养液通过0.45μm的无菌微孔滤膜，将截留的细胞系培养物取出，放入-80℃冰箱超低温冷冻2h，取出室温解冻30min，重复4次；最后一次解冻后利用超声波破碎仪破碎细胞，超声条件为4℃、40w、超声3s、间隔3s，总耗时9min。收集滤液，将滤液浓缩，得到玫瑰茄干细胞提取物；f.往步骤e中的玫瑰茄干细胞提取物加水调节蛋白质的终浓度为50±0.5μg/ml，加入玫瑰茄干细胞提取物总质量的5％的l-脯氨酸，灭菌，在温度为-20～-35℃，真空度为50pa中冻干，制得玫瑰茄干细胞冻干粉。对比例2与实施例1的区别在于，对比例2中的生长素用萘乙酸代替了吲哚乙酸。实施例2-4：一种玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜，包括以下成分及其重量：表1实施例2-4玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜的成分及其重量所述玫瑰茄干细胞冻干粉由实施例1所述的玫瑰茄干细胞冻干粉的制备方法制得的。玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜的制备方法，分别将表1中实施例2-4的成分及其重量按以下步骤制备：s1：将丙二醇，丙三醇，丁二醇，卡波940和防腐剂混合溶于水中，加热至75℃，搅拌至完全溶解，得混合物a；s2：将二甲基硅氧烷，辛酸癸酸三甘油酯，棕榈酸异丙酯，合成角鲨烷，鲸蜡硬酯醇醚混合溶于水中，加热至75℃，搅拌至完全溶解，得混合物b；s3：将步骤s2中制得的混合物b，加入步骤s1中制得的混合物a中，放入均质机中均值5min，冷却至30℃，得混合物c；s4：将玫瑰茄干细胞冻干粉，聚合杏仁蛋白和富醚斯金溶于水中，搅拌至完全溶解，得混合物d；s5：将步骤s4中制得的混合物d和三乙醇胺一起加入步骤s3中制得的混合物c中，均质即得。试验例一：玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜的制备中培养基成分组成试验1.试验对象：实施例1、对比例1和对比例2制备得到的玫瑰茄干细胞冻干粉。2.试验方法：取切玫瑰茄根尖，清洗，消毒，将得到的玫瑰茄切成5mm*5mm*5mm大小，接种至含有硫酸锌2.5mg/l、柠檬酸75.5mg/l、甘氨酸80.0mg/l、吲哚乙酸1.5mg/l、蔗糖11.0mg/l、活性炭0.8g/l和琼脂3.2mg/l的固体培养基上，培养温度为25℃，ph值为6.5，培养14天，得形成层来源的玫瑰茄干细胞；将形成层来源的玫瑰茄干细胞转移至含有硫酸镁181mg/l、柠檬酸79mg/l，甘氨酸78.0mg/l、吲哚乙酸1.5mg/l、蔗糖33.0mg/l、麦饭石颗粒70.0mg/l和硒矿石颗粒70.0mg/l的液态培养基中培养，得细胞悬液a；将上述得到的细胞悬液a平均分为3份，低速离心沉淀，收集细胞，分别转移至5l大规模培养器中培养，分别用实施例1、对比例1和对比例2中液体培养基培养，培养第5天后，分别加入4l的新鲜的实施例1、对比例1和对比例2的液体培养基，继续培养，中间不添加培养基，第15天后收集细胞，称重。3.试验结果：试验结果如表2，结果表明，实施例1，培养基内加入吲哚乙酸和芦荟苷的细胞重量明显高于对比例1未添加芦荟苷和对比例2加入萘乙酸和芦荟苷的细胞重量，说明吲哚乙酸和芦荟苷可促进细胞增殖分裂，缩短培养时间。表2细胞重量检测指标实施例1对比例1对比例2细胞液重量(mg)687.8345.7350.7试验例二：玫瑰茄干细胞冻干粉制备中玫瑰茄组织提取部位的培养时间1.试验变量：玫瑰茄去除根冠的根尖，玫瑰茄茎(维管形成层)，玫瑰茄储藏根(根冠)。2.试验方法：根据本发明玫瑰茄干细胞当干粉的制备方法和步骤，具体操作如下：a.分别取玫瑰茄去除根冠的根尖，玫瑰茄茎(维管形成层)，玫瑰茄储藏根(根冠)；b.将得到的玫瑰茄组织分别切成5mm*5mm*5mm大小，每种组织6份，分别接种至实施例1中b步骤培养基中培养，观察玫瑰茄根尖细胞增殖分化成形成层的时间。3.试验结果：试验结果如表3所示，玫瑰茄根尖培养出来的玫瑰茄形成层干细胞时间最短。表3玫瑰茄形成层干细胞形成时间试验例三：玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜抗紫外损伤试验1.试验对象：健康豚鼠，体重220-300g，雌雄对半。2.试验材料：实施例2-4制备的玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜，市售抗紫外损伤眼霜。3.试验方法：分组：将豚鼠分为空白对照组、阳性对照组(市售眼霜)、阴性对照组、试验组1、试验组2和试验组3，每组6只，雌雄对半，将豚鼠背部的毛剃去，空白对照组正常饲养，阴性对照组紫外照射16h，涂抹生理盐水，阳性对照组紫外照射16h后涂抹市售眼霜，试验组1、试验组2和试验组3组紫外照射16h后，分别涂抹实施例2、实施例3和实施例4制备的眼霜；每隔6h涂抹一次，24h后用生理盐水洗去眼霜，分别于0、1、24、48h测定各组豚鼠剃毛皮肤水分情况。4.试验结果：试验结果如表4所示，玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜的抗紫外效果远高于市售眼霜。表4玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜抗紫外损伤试验其中与阳性对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01。试验例四：玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜过敏性试验1.试验对象：健康豚鼠，体重220-300g，雌雄对半。2.试验材料：实施例2制备的玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜。3.试验方法：分组：将豚鼠随机分为4组，空白对照组、阳性致敏组、试验组1和试验组2，空白对照组，每组10只，雌雄对半，将豚鼠身体背部脱毛，空白对照组在脱毛处涂抹0.2-0.25ml生理盐水；阳性致敏组在脱毛处涂抹0.2-0.25ml致敏乳膏，均匀涂抹于豚鼠脱毛处；试验组1和试验组2分别在脱毛处涂抹0.2-0.25ml实施例2制备的玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜，分别于0、1、24、48、72h观察皮肤过敏现象。4.试验结果：试验结果表明，空白对照组、试验组1和试验组2各10只豚鼠未出现红斑和水肿，致敏组10只豚鼠均出现明显的红斑，致敏组豚鼠自给药1h后出现红斑，6h时最明显，24h逐渐消退，72h后红斑基本消退。试验例5：玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜抗衰老效果1.试验品：实施例3制备的玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜，市售的具抗皱、黑眼圈的眼霜。2.受试人群：数目：100人年龄：18-48岁之间性别：女健康状况：受试者皮肤健康，无皮肤病过敏史，符合受试者志愿入选标准。3.受试时间1个月，每天早晚各1次。4.测试方法：设置对照组和试验组，受试者脸部清洁后，对照组涂抹市售眼霜涂覆到眼部周围，试验组将实施例3制备的玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜涂覆到眼部周围，观察和感受使用效果。5.测试评估结果如下：表5实施例3制备的眼霜的试用反馈总结表表6市售眼霜的试用反馈总结表测试者均表示，实施例3制备的玫瑰茄干细胞冻干粉眼霜，对比市售抗皱、抗黑眼圈、眼袋的眼霜，长期使用后，可以明显提高肌肤含水量，增强肌肤保湿力和皮肤弹性，可长时保持水润感，同时具有淡化眼部鱼尾纹、黑眼圈和消除眼袋的效果。而且使用者均未出现过敏现象，实施例3制备的眼霜是一种安全、效果佳的改善和修复眼部肌肤的眼霜。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页12