本发明属药物制剂领域，涉及氨基化泊洛沙姆衍生物温度敏感型即型凝胶剂及其制备方法，具体涉及一种具有生物粘附性的氨基化泊洛沙姆衍生物载体的制备方法以及作为药物活性分子的载体在用于制备阴道、鼻腔和眼部等多种粘膜给药途径制剂中的应用。
背景技术
生物粘附是指合成或天然的高分子物质所具有的能够粘附到腔道粘液或上皮细胞表面的能力。二十世纪80年代以来，本技术领域开始研究将这种生物粘附性聚合物用于给药系统，即为生物粘附给药系统。研究显示，该种传递系统用于人体后，可以粘附到可接触到的给药部位、吸收部位或病灶部位，延长药物在病灶部位的保留时间，提高其治疗局部疾患的效果；同时，药物与吸收部位表面的紧密接触也可能促进药物的吸收，提高其生物利用度。
现有技术中较成熟的生物粘附策略包括1)向给药系统中物理混入生物粘附性材料和2)对给药系统进行生物粘附性功能基化学修饰(如巯基化、凝集素化、苯硼酸化)等。其中，策略1)采用物理混入的方法，加入生物粘附性高分子(卡波普，如专利cn201010108790.7、cn200610050215.x；壳聚糖如专利cn201310405163.3、cn200810047995.1等)，但是该种物理混入的方式存在混合均匀度差，混合效果不稳定等缺点；策略2)多对制剂载体材料进行化学修饰，如对泊洛沙姆类热敏型材料进行巯基化(如cn201410353376.0)、对可生物降解聚酯类材料进行凝集素化(如cn200610067505.5)和对聚苯乙烯类材料进行苯硼酸化(201310539766.2)等，但是巯基化稳定性差，容易氧化，凝集素本身作为糖蛋白，稳定性也差，苯硼酸疏水性强，对给药系统本身性质影响很大，因此，上述两种策略均存在有一定的不足之处。
温度敏感型即型凝胶是适合于阴道给药的剂型之一，实践显示所述的温度敏感型即型凝胶在给药时从室温到体温的温度变化刺激下，由溶液状态转变为凝胶态，在阴道内原位形成药物储库，缓慢释放药物，持久发挥疗效。泊洛沙姆是其中研究和应用最多的一类凝胶材料，已公开的专利有以泊洛沙姆类为单一凝胶基质的专利(wo9730693),有通过将不同型号的泊洛沙姆配伍使用以具有适宜相转变温度的专利(cn1377706a),有将泊洛沙姆类与其他生物粘附性高分子合用以获得生物粘附性即型凝胶的专利(ep0551626)，以及应用广泛的(wo2006099877、cn1814253a、cn1872026a、cn1593386a)，但是，泊洛沙姆本身无生物粘附性，基于泊洛沙姆的温度敏感型即型凝胶缺乏足够的生物粘附性。
迄今，尚未见有关氨基修饰的泊洛沙姆的制备及其作为药物活性分子的载体用于粘膜途径给药的应用的报道。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供氨基化泊洛沙姆衍生物温度敏感型即型凝胶剂，将生物粘附的策略1)和2)的优点结合起来，借助荷正电氨基对生物黏膜的亲和性和良好的亲水性，采用化学修饰的方法，实现给药系统均一、稳定的生物粘附功能化。
技术实现要素：
本发明的目的旨在针对现有技术存在的技术问题，提供一种氨基化泊洛沙姆衍生物温度敏感型即型凝胶剂，具体涉及一种具有生物粘附性的氨基化泊洛沙姆衍生物载体及其合成制备方法，以及作为药物活性分子的载体用于制备粘膜途径给药途径制剂中的应用。
本发明对常用作温度敏感型即型凝胶材料的泊洛沙姆进行氨基化修饰，所得泊洛沙姆衍生物可作为药物活性分子的载体用于制备阴道、鼻腔和眼部等多种粘膜途径给药的制剂。
具体的，本发明提供了氨基化泊洛沙姆衍生物温度敏感型即型凝胶剂，其特征在于，采用生物粘附性的氨基化泊洛沙姆衍生物作为药物活性分子的载体，所述载体结构如下列化学式所示：
其中a为20-110，b为30-80。
本发明中，所述泊洛沙姆选自泊洛沙姆407泊或者泊洛沙姆188。
另一方面，本发明提供了制备所述的具有生物粘附性的氨基化泊洛沙姆衍生物的方法，其包括步骤：
以摩尔份数计，将1份泊洛沙姆溶解在10-100份反应溶剂中。另将2-20份羰基二咪唑(cdi)溶解于10-100份同一种反应溶剂，将上述cdi溶液取在氮气保护和持续搅拌的条件下缓慢滴加到上述泊洛沙姆溶液中，滴加完毕后,反应液继续在室温条件下反应2-10小时，然后向反应体系中加入1-50份去离子水，室温搅拌20-60分钟，以中和过量的cdi，然后在氮气保护和持续搅拌的条件下，向反应体系中滴入5-100份乙二胺，室温下搅拌过夜，旋转蒸发除去过量乙二胺,将剩余反应液用去离子水透析3-5天(所用透析膜截留分子量为3500)，之后冷冻干燥得固体粉末，制得氨基化泊洛沙姆衍生物；
本发明的制备方法中，所述反应溶剂为乙腈、n、n-二甲基甲酰胺、乙醇等有机溶剂中的一种或多种之混合物。
进一步，本发明提供了所述的具有生物粘附性的氨基化泊洛沙姆衍生物的用途，所述的衍生物可作为载体，制备用于阴道粘膜、鼻腔粘膜、口腔颊粘膜、直肠粘膜、眼部粘膜等途径给药的含药物活性分子的载药制剂；
所述的药学活性分子选自抗肿瘤药物、抗炎药物、抗菌药物、抗病毒药物、作用于生殖系统的药物、作用于呼吸系统的药物和调整内分泌功能的药物中的一种(或多种的混合物)，可以是小分子药物、生物大分子药物或天然产物活性成分，或是维持粘膜局部ph的活性物质，如乳酸；
所述的载药制剂具有温度敏感性，在较低温度下为液态，在较高温度下为半固态，临界相转变温度应在室温到体温之间。
本发明中，所述氨基化泊洛沙姆衍生物可制备供临床使用的剂型，通过下述方法用于包载难溶性药物：氨基化泊洛沙姆衍生物和治疗有效量的难溶性药物用药学上可以接受的挥发性溶剂溶解后，旋转蒸发干燥成膜，加入适宜的缓冲液以及必要的附加剂，振荡水化，直至将全部固体溶解，得澄明、均匀的溶液，即得；本发明的实施例中，所得制剂含药量为0.01～5％(w/w)；
或，氨基化泊洛沙姆衍生物和必要的附加剂溶于适宜的缓冲液，得澄明、均匀的空白凝胶基质，向该基质中加入难溶性药物粉末，在低温(0-10℃)下搅拌均匀，制得不透明的混悬型载药制剂，即得；
本发明的实施例中，所述的后加入的难溶性药物粉末粒度控制在200目以下；
或，将氨基化泊洛沙姆衍生物、治疗有效量的水溶性药物和必要的附加剂溶于适宜的缓冲液，得到澄明、均匀的溶液，即得；本发明的实施例中，所得制剂含药量为0.01～30.0％(w/w)；
本发明中，上述振荡水化在冰水浴中进行，温度控制在0-10℃；
本发明中，上述氨基化泊洛沙姆衍生物的溶解过程在冰水浴中进行。
本发明中，上述所采用的缓冲液能有效控制所得制剂的ph在4.5～5.5之间，可采用乳酸盐缓冲液，硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、枸橼酸缓冲液等缓冲体系，其摩尔总浓度在10-500mm；所采用的附加剂为山梨酸、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯等防腐剂中的一种或者几种的混合物，浓度在0.01～1.0％之间；
本发明中，制备温度敏感型凝胶制剂所用的氨基化泊洛沙姆衍生物可以是氨基化泊洛沙姆407、氨基化泊洛沙姆188或上述两种的混合物；本发明的实施例中，优选制备的温度敏感型凝胶制剂含有泊洛沙姆407或188。
更具体的，本发明提供了将药物活性分子包载于所述的基于氨基修饰的泊洛沙姆的温度敏感型凝胶制剂的方法：
对于可以被氨基化泊洛沙姆增溶的难溶性药物活性分子：将氨基化泊洛沙姆衍生物和难溶性药物用药学上可以接受的挥发性溶剂一起溶解后，旋转蒸发干燥成膜，加入适宜的缓冲液以及必要的附加剂，在低温(0-10℃)下振荡水化，直至将全部固体溶解，即得；
对于无法被氨基化泊洛沙姆增溶的难溶性药物活性分子：将氨基化泊洛沙姆衍生物和必要的附加剂溶于适宜的缓冲液，得到澄明、均匀的空白凝胶基质。向该基质中加入难溶性药物粉末，在低温(0-10℃)下搅拌均匀，得到混悬型的温度敏感型载药即型凝胶制剂；
对于水溶性药物：将氨基化泊洛沙姆衍生物、治疗有效量的水溶性药物和必要的附加剂在低温(0-10℃)下溶于适宜的缓冲液，得到澄明、均匀的溶液。
经试验，结果显示，用上述的方法制得的基于氨基化泊洛沙姆衍生物的温度敏感型凝胶制剂具有良好的温度敏感性，给药方便，能够在体内原位凝胶化，具有较强的实用性，改变泊洛沙姆衍生物的浓度，可调节其凝胶化温度(如图所示)；
制得的基于氨基化泊洛沙姆衍生物的温度敏感型凝胶制剂在体外无膜释放实验条件下(释放介质接触面积恒定)，可以接近恒定的速度溶蚀并释放药物(如图2所示)，具有良好的缓释性能；
制得的基于氨基化泊洛沙姆衍生物的温度敏感型凝胶制剂在小鼠阴道给药后在8小时内局部滞留量始终高于基于非衍生化泊洛沙姆的对照制剂(如图3所示)；
制得的基于氨基化泊洛沙姆衍生物的温度敏感型凝胶制剂作为药物活性分子载体载药在健康小鼠阴道给药后，对粘膜的局部刺激性与生理盐水接近，远低于游离药物(如图4所示)，表明所述制剂作为药物载体进行粘膜给药时，能够降低药物本身对局部粘膜的刺激作用，尤其适用于局部粘膜刺激性较强的药物。
本发明提供的基于氨基修饰的泊洛沙姆的温度敏感型凝胶制剂具有以下优点：(1)氨基化泊洛沙姆衍生物带正电荷，能够与粘膜特征成分粘蛋白发生静电相互作用，改善了生物粘附性；(2)在室温下呈液态，给药方便，给入体腔内在粘膜表面因温度的升高而发生相转变，在阴道内原位凝胶化，粘附于阴道粘膜表面，使药物长时间滞留在阴道内壁上，缓慢释放，持久起效；(3)具有良好的安全性，本身对阴道粘膜刺激小。本发明为多种粘膜途径给药提供了一种给药方便、滞留持久的粘膜给药载体新平台。
附图说明
图1，不同质量浓度的基于氨基化泊洛沙姆407衍生物的温度敏感型凝胶(简写为nfg)复合模量随温度的变化。
图2，含有20％(w/w)氨基化泊洛沙姆407衍生物和2％(w/w)药物活性分子(醋酸棉酚，简写为ag)的温度敏感型凝胶(简写为nfg-ag)的溶蚀与释放曲线(n＝3，均值±标准误差)。
图3，nfg-ag(含有20％(w/w)氨基化泊洛沙姆407衍生物和2％(w/w)醋酸棉酚的温度敏感型凝胶)以及nfg(含有20％(w/w)氨基化泊洛沙姆407衍生物、不含药的温度敏感型凝胶)在健康雌性小鼠阴道内的滞留时间过程(n＝3，均值±标准误差)，以同样含有20％(w/w)非氨基衍生化的泊洛沙姆407的温度敏感型凝胶(简写为fg)作为对照(n＝3，均值±标准误差)。
图4，对健康雌性小鼠阴道粘膜刺激性考察结果(给药24小时后马上取样以及给药后恢复一周再取样)：2％(w/w)ag混悬液(游离药物)vsnfg-ag(含有20％(w/w)氨基化泊洛沙姆407衍生物和2％(w/w)醋酸棉酚的温度敏感型凝胶)vs.生理盐水。
图5，氨基化泊洛沙姆407衍生物的氢谱。
图6，氨基化泊洛沙姆407衍生物的碳谱。
图7、氨基化泊洛沙姆407衍生物的红外吸收光谱
图8，nfgvs.fg与粘蛋白混合后发生的复合模量变化(n＝3，均值±标准误差)。
图9，nfg-agvs.nfgvs.fg在离体动物组织(健康小鼠阴道粘膜)上的滞留时间过程(n＝3，均值±标准误差)。
图10，nfg-ag(含有20％(w/w)氨基化泊洛沙姆407衍生物和2％(w/w)醋酸棉酚的温度敏感型凝胶)以及nfg(含有20％(w/w)氨基化泊洛沙姆407衍生物、不含药的温度敏感型凝胶)复合模量随温度的变化。
具体实施方式
以下实施例是用来说明本发明的，不应被认为是以任何方式对本发明的限制。
实施例1、氨基化泊洛沙姆407衍生物的合成制备
将适量泊洛沙姆407溶于丙酮,然后加入预冷的正己烷，使泊洛沙姆407析出,真空干燥即得。取5.759纯化后的泊洛沙姆407(1mmol)溶解于25ml无水乙腈，另将1.629羰基二咪唑(cdi,10mmol)溶解于15ml无水乙腈，然后将cdi的乙腈溶液在氮气保护条件下,于2h内缓慢滴加到上述溶液中。滴加完毕后,反应液继续在室温条件下反应2h，然后向反应体系中加入0.2ml去离子水以中和过量的cdi。室温搅拌20min后,将10ml乙二胺于2h内缓慢滴加到上述反应液中,室温磁力搅拌过夜。旋转蒸发除去过量乙二胺,将剩余液体用去离子水透析5天(截留分子量3500),每天更换去离子水3次,然后进行超滤(mwco＝3000da),冷冻干燥即得氨基化泊洛沙姆407衍生物；
所得氨基化泊洛沙姆407衍生物的氢谱如图5所示，其中7.28ppm处信号为氨基上的氢原子的特征峰，碳谱如图6所示，其中40～50ppm处的信号为连接氨基的伯碳原子的特征峰，红外光谱如图7所示，1344～1345cm-1处的吸收为氨基的特征吸收峰。
实施例2、基于氨基化泊洛沙姆407衍生物的生物粘附性温度敏感型即型凝胶的制备
该实施例按照以下处方(按重量计)进行基于氨基化泊洛沙姆407衍生物的生物粘附性温度敏感型即型凝胶的配制：
根据实施例1所述制备的氨基化泊洛沙姆407衍生物20.0％
纯水80.0％
根据处方量称取根据实施例1所述制备的氨基化泊洛沙姆407衍生物，将其溶于处方量的纯水，在4℃冰箱中静置过夜后搅拌均匀，即得；
前述得基于氨基化泊洛沙姆407衍生物的生物粘附性温度敏感型即型凝胶(nfg)的流变学具有显著的温度依赖性，随着温度上升，复合模量在特定温度范围内发生突跃式上升，该特定温度范围称之为临界凝胶化温度，前述所得nfg的临界凝胶化温度在20℃左右(如图1所示)；
前述所得nfg与粘蛋白(粘膜表面特征成分)之间相互作用明显，如图8所示，在37℃时，浓度为20％(w/w)的生物粘附性温度敏感型即型凝胶(简写为nfg)与粘蛋白混合时复合模量上升的幅度显著高于相同浓度的基于非衍生化泊洛沙姆407的非生物粘附性温度敏感型即型凝胶水凝胶(简写为fg)；
前述所得nfg在离体动物组织(健康小鼠阴道粘膜)上表现出了良好的滞留性，如图9所示，在持续的阴道模拟液体外冲刷条件下，nfg(含近红外荧光探针dir)在离体组织上的滞留优于fg。
实施3、用于治疗子宫内膜异位症的醋酸棉酚阴道用生物粘附性温度敏感型即型凝胶
该实施例按照以下处方(按重量计)进行含醋酸棉酚生物粘附性温度敏感型即型凝胶的配制。
醋酸棉酚2.0％
根据实施例1所述制备的氨基化泊洛沙姆407衍生物20.0％
山梨酸0.05％
乳酸适量，调节ph至4.5～5.5
纯水至足量；
称量适量氨基化泊洛沙姆衍生物和醋酸棉酚，溶于二氯甲烷，旋转干燥成膜后，加入适当浓度的山梨酸和纯水，冰浴振荡水化，直至形成澄明无气泡的棕色溶液即得，用乳酸将ph调节到4.5～5.5之间，最后加纯水至足量，即得；
前述醋酸棉酚阴道用生物粘附性温度敏感型即型凝胶(简称为nfg-ag)的温度敏感性如图10所示，临界凝胶化浓度在20℃左右，与以非衍生化泊洛沙姆407制备的对比制剂(即相应的非生物粘附性温度敏感型即型凝胶)相似；
前述nfg-ag体外释放结果如图2所示；释放实验采用无膜法，在37℃下，以阴道模拟液为释放介质进行，醋酸棉酚以基本恒定的速度释放，体现了一定的控释效果；
前述nfg-ag在健康雌性小鼠阴道给药后的体内药物滞留结果如图3所示；以健康雌性小鼠为模型动物，每只经阴道给予10微升受试制剂，在预定时间点以生理盐水进行阴道灌洗，分别收集每只小鼠的阴道灌洗液，对其中的醋酸棉酚浓度进行定量测定，计算各个时间点相对于初始时间点的滞留百分比，结果表明，阴道给药8小时内，nfg-ag组的药物局部滞留量始终优于fg-ag(以非衍生化泊洛沙姆407制备的对比制剂，即相应的非生物粘附性温度敏感型即型凝胶)；
阴道局部刺激性结果如图4所示。以健康雌性小鼠为模型动物，每只经阴道单次给予10微升受试制剂，分别在给药24小时后和恢复一周后，处死动物，对阴道粘膜组织进行组织学观察(h&e染色后)，与生理盐水对照组相似，ag-nfg组基本没有引起阴道粘膜形态学上的明显改变；相反，醋酸棉酚混悬剂组阴道粘膜表面组织脱落严重，即使经过一周的恢复，仍然没能回到正常生理状态；
该制剂可用于阴道给药，治疗子宫内膜异位症。
实施例4、用于治疗子宫内膜异位症的醋酸棉酚阴道用生物粘附性温度敏感型即型凝胶
该实施例按照以下处方(按重量计)进行含醋酸棉酚生物粘附性温度敏感型即型凝胶的配制。
醋酸棉酚2.0％
根据实施例1所述制备的氨基化泊洛沙姆407衍生物17.5％
山梨酸0.05％
乳酸适量，调节ph至4.5～5.5
纯水至足量
称量适量基于氨基化泊洛沙姆407衍生物和醋酸棉酚，溶于二氯甲烷，旋转干燥成膜后，加入处方量的山梨酸和适量纯水，冰浴振荡水化，直至形成澄明无气泡的棕色溶液即得，用乳酸将ph调节到4.5～5.5之间，最后加纯水至足量，即得；所得制剂的临界凝胶化浓度在28-30℃左右；
该制剂可用于阴道给药，治疗子宫内膜异位症。
实施例5、姜黄素阴道用生物粘附性温度敏感型即型凝胶
该实施例按照以下处方(按重量计)进行姜黄素生物粘附性温度敏感型即型凝胶的配制。
姜黄素2.0％
根据实施例1所述制备的氨基化泊洛沙姆衍生物17.5％
山梨酸0.05％
乳酸适量，调节ph至4.5～5.5
纯水至足量
称量适量氨基化泊洛沙姆407衍生物和姜黄素，溶于二氯甲烷，旋转干燥成膜后，加入适当浓度的山梨酸和纯水，冰浴振荡水化，直至形成澄明无气泡的棕色溶液即得，用乳酸将ph调节到4.5～5.5之间，最后加纯水至足量，即得，临界凝胶化浓度在28-30℃左右；
该制剂可用于阴道给药，治疗感染性阴道炎。
实施例6、阿昔洛韦阴道用生物粘附性温度敏感型即型凝胶
该实施例按照以下处方(按重量计)进行含阿昔洛韦生物粘附性温度敏感型即型凝胶的配制。
阿昔洛韦2.0％
根据实施例1所述制备的氨基化泊洛沙姆407衍生物17.5％
山梨酸0.05％
乳酸适量，调节ph至4.5～5.5
纯水至足量
称量适量氨基化泊洛沙姆407衍生物，加入适当浓度的山梨酸和纯水，在4℃冰箱中静置过夜，得到均匀无色澄清的粘稠溶液，用乳酸将ph调节到4.5～5.5之间，加纯水至足量，作为空白基质；称量适量的阿昔洛韦(200目)，分散在前述空白基质中，冰水浴中搅拌均匀，即得，临界凝胶化浓度在28-30℃左右；
该制剂可用于阴道给药，治疗病毒性阴道感染性疾病。
实施例7、重组人干扰素α-2b阴道用生物粘附性温度敏感型即型凝胶
该实施例按照以下处方(按重量计)进行含重组人干扰素α-2b生物粘附性温度敏感型即型凝胶的配制，
重组人干扰素α-2b40万单位/g
根据实施例1所述制备的氨基化泊洛沙姆407衍生物17.5％
山梨酸0.05％
乳酸适量，调节ph至4.5～5.5
纯水至足量
称量适量基于氨基化泊洛沙姆衍生物，加入适当浓度的山梨酸和纯水，在4度冰箱中静置过夜，得到均匀无色澄清的粘稠溶液，用乳酸将ph调节到4.5～5.5之间，加纯水至足量，作为空白基质；称量重组人干扰素α-2b，搅拌，使其溶解在前述空白基质中，冰水浴中搅拌均匀，即得，临界凝胶化浓度在28-30℃左右；
该制剂可用于阴道给药，治疗病毒性阴道感染性疾病。
实施例8、乳酸缓冲型阴道用生物粘附性温度敏感型即型凝胶
该实施例按照以下处方(按重量计)进行乳酸缓冲型阴道热敏凝胶剂的配制，
乳酸1.0％
根据实施例1所述制备的基于氨基化泊洛沙姆衍生物17.5％
山梨酸0.05％
naoh适量，调节ph至4.5～5.5
纯水至足量
称量适量基于氨基化泊洛沙姆407衍生物，加入适当浓度的乳酸、山梨酸和纯水，在4度冰箱中静置过夜，得到均匀无色澄清的粘稠溶液，用naoh将ph调节到4.5～5.5之间，加纯水至足量，即得，临界凝胶化浓度在28-30℃左右；
该制剂可用于阴道给药，作为细菌性或病毒性阴道感染性疾病的辅助治疗。