本发明涉及生物新医药技术领域，尤其是一种动物用肠溶性凝胶疫苗及其制备、使用方法。
背景技术
当前畜禽、水产类动物疫病甚至是野生动物疫苗越来越复杂，其中大部分为粘膜类疫病，在饲养管理过程中，对生物防控的意识也越来越强，大部分病毒性、细菌性、寄生虫性疾病均采用疫苗进行免疫，逐渐减少了大型烈性传染性疾病的发生，保证了养殖生产健康可持续发展，保障人民生活水平稳步提高。但是，在动物疫苗使用的过程中，也存在一些不足和缺点，当前大部分的疫苗免疫方式主要为注射，有部分疫苗可口服、喷雾、滴眼滴鼻等，但种类不多，另外，在疫苗缓控释制剂方面的研究极少，还停留在传统剂型和制剂研究工艺方面。
从动物生理看，动物呼吸道、消化道和生殖道的内表面粘膜总共有约400m2的面积，存在着大量的病毒、细菌、寄生虫等，对动物体影响巨大，我们必须保护这个巨大的屏障，因此，一般情况下会针对粘膜位置的不同，使用滴眼滴鼻或口服疫苗可以达到粘膜免疫的效果。当前粘膜免疫疫苗存在的不足是，疫苗滴眼滴鼻时，剂量难于精确控制，容易出现无效免疫或过量免疫；疫苗口服时，抗原会被胃液中的某些酶破坏或被胃酸中和，无法进入肠道起到粘膜免疫的效果；用于生殖道粘膜免疫的疫苗尚未有批准。
目前，在动物疫苗工艺研究领域，均专注于抗原的研究，极少对疫苗生产工艺和剂型进行研究。本发明主要针对当前粘膜免疫疫苗剂型较单一、抗原不稳定、尚无缓控释疫苗制剂等情况，引入了凝胶技术，发明了一种动物用肠溶口服凝胶疫苗及其制备、使用方法，解决动物粘膜免疫疫苗在生产实践中所出现的问题。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有动物粘膜免疫过程中疫苗所存在的不足和缺点，提供一种动物用肠溶口服凝胶疫苗及其制备、使用方法，引入凝胶技术，解决动物粘膜免疫疫苗在生产实践中所出现的问题。
本发明的“一种动物用肠溶口服凝胶疫苗的制备方法”，是这样实现的：
一种动物用肠溶口服凝胶疫苗的制备方法，包括如下步骤：s1,抗原颗粒的制备：将动物病原微生物的抗原与抗原保护剂、佐剂混合均匀后，采用一定的工艺，制备成抗原颗粒；s2,凝胶溶液的制备：按照处方量将增稠剂、稳定剂、矫味剂和稀释剂混合均匀后，配制成水溶液，即为凝胶溶液；s3,动物用肠溶口服凝胶疫苗的制备：将抗原颗粒加入到凝胶溶液中均匀分散后，冷却，即得。
作为本发明的进一步改进，所述s1在百级洁净区进行制备，所述s3在万级洁净区进行制备。
作为本发明的进一步改进，所述的动物包括畜禽、水产、特种经济动物、野生动物；所述的抗原包括活的或灭活的细菌、病毒、寄生虫以及多肽、蛋白、核酸；抗原的使用浓度按照质量百分比计，为0.013-1.5％；所述的抗原保护剂包括蔗糖、果糖、葡萄糖、海藻糖、乳糖、低聚果糖、低聚半乳糖、水苏糖、甘氨酸钠、脱脂奶粉中的至少一种；抗原保护剂的使用浓度按照质量百分比计，为0.013-1.5％；所述的佐剂包括免疫球蛋白、toll样受体、nod样受体、rig样受体、整合素、白细胞唾液素、选择素、细胞因子、壳聚糖、壳寡糖、黄芪多糖、紫锥菊多糖、玉竹多糖、酵母多糖、人参皂苷、皂苷、分枝杆菌、脂多糖、转移因子、脂蛋白、防御素、鞭毛素、左旋咪唑、免疫刺激复合物、白细胞介素、干扰素、胸腺激素、cpg-odn中的至少一种；佐剂的使用浓度按照质量百分比计，为0.05-2％。
作为本发明的进一步改进，所述的抗原颗粒的制备工艺为，将抗原溶液与一定的载体溶液混合均匀后，再加入抗原保护剂和佐剂，在-25-50℃干燥，20-60目过筛，制备成抗原颗粒。所述的载体包括阿拉伯树胶、丙烯酸树脂、微晶纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、β-环糊精中的至少一种。所述的载体溶液浓度为1-10％。
作为本发明的进一步改进，所述的凝胶溶液，按照重量百分比计，包含以下组分：
增稠剂10-40％
稳定剂5-40％
矫味剂0.5-5％
稀释剂15-84.5％
其中，所述的稳定剂包括十二烷基甜菜碱、吐温-80、吐温-20、聚乙烯氢化蓖麻油、橄榄油中的至少一种；所述的增稠剂包括聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙烯吡咯烷酮k30(pvpk30)、泊洛沙姆188、交联羧甲基纤维素钠、交联羟丙基纤维素钠、果胶、明胶、黄原胶、瓜尔胶、卡波普934、羟丙基β-环糊精、明矾、壳聚糖、阿拉伯胶、海藻酸钠、西黄蓍胶、乙基纤维素、微晶纤维素、丙烯酸树脂、半纤维素提取物中的至少一种；所述的稀释剂包括淀粉、乳糖、葡萄糖、麦芽糊精、麦芽糖糊精、黄芪多糖、低聚果糖、低聚半乳糖、水稳定化合物中的至少一种；凝胶溶液的制备温度为-4-80℃；凝胶溶液的浓度为1.3-12.5％。
作为本发明的进一步改进，所述的动物用肠溶口服凝胶疫苗为固体、半固体、胶体、液体状态。
本发明的“一种动物用肠溶口服凝胶疫苗”，是这样实现的：
一种动物用肠溶口服凝胶疫苗，采用如权利要求1-5任一项所述的动物用肠溶口服凝胶疫苗的制备方法制备而成。
本发明的“一种动物用肠溶口服凝胶疫苗的使用方法”，是这样实现的：
一种动物用肠溶口服凝胶疫苗的使用方法，采用如权利要求6所述的动物用肠溶口服凝胶疫苗，并且动物用肠溶口服凝胶疫苗的使用剂量为1-1000头份。
作为本发明的进一步改进，所述动物用半肠溶性凝胶疫苗可为混饮、混饲或直接投喂。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明的制备方法科学，简单合理，生产稳定可靠，产品收率达95％以上。采用了凝胶技术，成品具有抗原载量高、均匀性好、肠溶、缓释、毒副作用低、成本低廉、使用方便、保存期长等优点。
(2)制成的凝胶疫苗为肠溶，具有缓控释的效果，在胃中不释放，在小肠中释放，减少胃液对抗原的破坏影响，抗原能在肠道粘膜定殖，能刺激机体产生较高的粘膜局部免疫抗体siga，以及在粘膜表面诱导有效的细胞毒性t细胞应答，因此可同时产生细胞免疫、体液免疫和粘膜免疫。
(3)用本方法生产的凝胶疫苗为口服疫苗，具有肠溶缓释效果，在胃中不释放，主要在小肠中释放，使用方法上可通过混饮、混饲或直接投喂等方式进行动物疫苗免疫。本发明在常温密封条件下可保存2年不变质。
附图说明
图1是实施例4在人工胃液中作用2h后的样品性状示意图。
图2是实施例4在人工肠溶液作用2h后的样品性状示意图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
实施例1：猪流行性腹泻病毒肠溶口服凝胶疫苗及其制备方法
(1)抗原颗粒的制备：猪流行性腹泻病毒抗原0.13％、甘氨酸钠1.5％、cpg-odn0.5％，微晶纤维素-乙醇溶液10％，在百级洁净区内，将猪流行性病毒液加入到微晶纤维素-乙醇溶液中，然后与甘氨酸钠、cpg-odn混合均匀后，在40℃干燥，过20目筛，制备成抗原颗粒。
(2)凝胶溶液的制备：卡拉胶15％、羧甲基纤维素钠10％、吐温-805％、谷氨酸钠0.5％、麦芽糖糊精69.5％，按照处方量混合均匀后，在30℃条件下，制备5％的水溶液，即为凝胶溶液。
(3)猪流行性腹泻病毒肠溶口服凝胶疫苗的制备：在万级洁净区将抗原颗粒加入到凝胶溶液中均匀分散后，冷却，即得。
实施例2：鸡空肠弯曲杆菌肠溶口服凝胶疫苗及其制备方法
(1)抗原颗粒的制备：鸡空肠弯曲杆菌抗原0.13％、海藻糖1.5％、皂苷0.5％、微晶纤维素乙醇溶液10％，在百级洁净区内，将抗原液加入到微晶纤维素乙醇溶液中，再与海藻糖、皂苷混合均匀后，在40℃干燥，过24目筛，制备成抗原颗粒。
(2)凝胶溶液的制备：明胶15％、羟丙基甲基纤维素11％、甜菜碱3％、甜蜜素0.3％、低聚半乳糖70.7％，按照处方量混合均匀后，配制成10.5％的水溶液，即为凝胶溶液。
(3)鸡空肠弯曲杆菌肠溶口服凝胶疫苗的制备：在万级洁净区将抗原颗粒加入到凝胶溶液中均匀分散后，冷却，即得。
实施例3：仔猪增生性肠炎肠溶口服凝胶疫苗及其制备方法
(1)抗原颗粒的制备：猪增生性肠炎抗原0.2％、甘氨酸钠0.5％、海藻糖0.5％、脱脂奶粉0.5％、皂苷0.5％、微晶纤维素乙醇溶液10％，在百级洁净区内，将抗原液加入到微晶纤维素乙醇溶液中，再与甘氨酸钠、海藻糖、脱脂奶粉和皂苷混合均匀后，在25℃干燥，过30目筛，制备成抗原颗粒。
(2)凝胶溶液的制备：黄原胶15％、羧甲基纤维素钠10％、吐温-205％、谷氨酸钠0.5％、乳糖69.5％，按照处方量混合均匀后，配制成5.5％的水溶液，即为凝胶溶液。
(3)仔猪增生性肠炎肠溶口服凝胶疫的制备：在万级洁净区将抗原颗粒加入到凝胶溶液中均匀分散后，冷却，即得。
实施例4：半肠溶性鸡球虫凝胶疫苗及其制备方法
(1)抗原颗粒的制备：鸡球虫卵囊1.2％、甘氨酸钠2.5％、脂多糖0.5％、微晶纤维素乙醇溶液10％，在百级洁净区内，将球虫卵囊加入到微晶纤维素乙醇溶液中，再与甘氨酸钠、脂多糖混合均匀后，在25℃干燥，过20目筛，制备成抗原颗粒。
(2)凝胶溶液的制备：卡拉胶15％、羧甲基纤维素钠10％、吐温-205％、糖精钠0.5％、麦芽糖糊精69.5％，按照处方量混合均匀后，配制成2％的水溶液，即为凝胶溶液。
(3)鸡球虫肠溶口服凝胶疫苗的制备：在万级洁净区将抗原颗粒加入到凝胶溶液中均匀分散后，冷却，即得。
实施例5：安全性检验
(1)豚鼠安全检验用体重为300-400g的豚鼠3只，每只灌服实施例1凝胶疫苗0.5头份，观察7日，全部健活，每只体重增加，证明其对豚鼠是安全的。
(2)小鼠安全检验用体重为18-20g的小鼠5只，每只灌服实施例2凝胶疫苗0.05头份，观察7日，全部健活，每只体重不减并增加，证明其对小鼠是安全的。
(3)乳鼠安全检验用2日龄乳鼠一窝(至少5只，带母鼠饲养)，每只灌服实施例3样品0.025头份，同时设对照，观察7日，全部健活。
(4)仔猪安全检验健康断奶仔猪4头(试验前观察5-7日，每日上、下午各测体温1次，挑选体温、精神、食欲正常者使用)，每头灌服实施例1样品2.5头份，接种后每日上、下午各测体温观察1次，观察7日。体温、精神、食欲与注射本品前相比没有明显变化，证明其对靶动物猪是安全的。
(5)仔鸡安全检验3日龄健康黄鸡20只，每只鸡灌服实施例4样品2.5羽份，接种后每日观察，连续观察7日，可见鸡只未出现血便、稀便、死亡等变化，证明其对靶动物鸡是安全的。
实施例6：免疫原性检验：将实施例2样品对鸡空肠弯曲杆菌进行免疫原性试验
试验方法：100羽7日龄仔鸡随机分成2组，每组50只，其中第1组为对照组，不免疫；第2组为试验组，口服实施例2样品进行免疫；在试验开始后第7天各组分别口服感染鸡源空肠弯曲杆菌抗原，连续观察至28天，在试验期间仔细观察鸡群临床体征，在7、14和28日龄每组采集5只鸡血清，测定血清igg；在7、14和28日龄剖杀5只鸡，采集肠液，测定肠液siga。
试验结果：
(1)临床体征观察：对照组鸡只出现空肠弯曲杆菌症状，精神沉郁，饮食欲下降，拉稀，死亡5只鸡；试验组正常，无死鸡。
(2)血清igg测定结果
(3)肠液siga测定结果
结果显示，试验组能较好地防治空肠弯曲杆菌抗原的感染，保护率为100％，免疫后血清igg和肠液siga浓度明显高于对照组，表现出较好的免疫原性。
实施例7：体外释放度试验
将实施例4样品进行释放度试验，在人工胃液中连续作用2h，分别在1h、2h用取样针取样，测定病原释放量；连续作用2h后，取出样品，放入人工肠液中，分别在1h、2h用取样针取样，连续作用2h后，测定病原释放量。
释放度试验结果
经过检验发现：所述的凝胶疫苗具有肠溶缓释效果，如图1所示，在胃中几乎不释放，释放量为1.79-2.91％，主要在小肠内释放，如图2所示，释放量为96.26％-99.02％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。