本发明属于生物医药领域，涉及小白菊内酯用作骨形成蛋白9抑制剂的生物医药用途。
背景技术：
：骨形成蛋白9(bmp9)又称生长分化因子2(gdf2)，是bmp家族的一员。研究表明，bmp9参与骨形成、胚胎发育、肿瘤发生等多种生物学功能。苟理尧等发现，bmp9在人膀胱癌细胞中高表达，bmp9可以促进人膀胱癌细胞的增殖和迁移，bmp9被抑制后人膀胱癌细胞的增殖和迁移均显著降低(骨形成蛋白9对人膀胱癌biu-87细胞增殖和迁移的影响，中国生物工程杂志，2018年3月)。因此，bmp9的抑制剂有望用于膀胱癌等肿瘤的治疗。技术实现要素：本发明的目的在于提供小白菊内酯用作骨形成蛋白9抑制剂的生物医药用途。本发明技术方案如下：小白菊内酯用作骨形成蛋白9抑制剂的生物医药用途。小白菊内酯用于制备抑制膀胱癌转移的药物的生物医药用途。小白菊内酯用于制备治疗膀胱癌的药物的生物医药用途。一种抑制膀胱癌转移的药物制剂，以小白菊内酯为活性成分，还含有药学上可以接受的辅料，制成药学上可以接受的剂型。一种治疗膀胱癌的药物制剂，以小白菊内酯为活性成分，还含有药学上可以接受的辅料，制成药学上可以接受的剂型。本发明对现有技术的贡献：本发明发现，小白菊内酯为骨形成蛋白9的有效抑制剂。根据文献记载，骨形成蛋白9参与包括膀胱癌在内的多种肿瘤的发生、发展和转移，抑制骨形成蛋白9可以抑制这些肿瘤的增殖和迁移。本发明发现，用新发现的骨形成蛋白9的抑制剂小白菊内酯作用于人膀胱癌细胞后，其增殖和迁移能力确实显著降低，小白菊内酯可以用于制备抑制膀胱癌转移的药物，可以用于制备治疗膀胱癌的药物。附图说明图1为小白菊内酯和对比化合物木香烃内酯的化学结构式；图2为小白菊内酯对bmp9mrna含量的影响；图3为小白菊内酯对bmp9蛋白含量的影响；图4为小白菊内酯对人膀胱癌细胞增殖能力的影响；图5为小白菊内酯对人膀胱癌细胞迁移能力的影响。具体实施方式下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。实施例1：小白菊内酯对bmp9的抑制作用一、实验材料小白菊内酯和对比化合物木香烃内酯的纯度在98％以上，化学结构式如图1。膀胱癌t-24购于上海细胞生物研究所。rpmi-1640培养基、胎牛血清购于hyclone公司。trizol购于invitrogen公司，逆转录及pcr相关试剂购于takara公司，westernblot及蛋白质提取相关试剂均购自上海碧云天生物技术公司，鼠抗人β-actin单抗购自santacruz公司，兔抗人bmp9多克隆抗体购自abcam公司，兔抗人β-catenin单抗购自cst公司，hrp标记山羊抗兔(鼠)igg购自中杉金桥公司。二、实验方法1、细胞培养使用含10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的1640培养基，将膀胱癌t-24细胞在含5％co2的37℃培养箱中常规培养传代。2、分组和给药实验分为小白菊内酯低浓度组(10μm)、小白菊内酯高浓度组(20μm)、木香烃内酯低浓度组(10μm)、木香烃内酯高浓度组(20μm)和对照组(不含药)。3、实时定量pcr检测各组细胞中bmp9mrna含量取对数生长期膀胱癌t-24细胞，按上述分组培养48h。培养48h后，trizol法分别提取各组细胞rna，取0.15μg逆转录成cdna，进行q-pcr分析。β-actin正向引物为5'-gatgacccagatcatgtttgag-3'，β-actin反向引物为5'-agggcatacccctcgtagat-3'；bmp9的正向引物为5'-ctgcccttctttgttgtctt-3'，bmp9反向引物为5'-ccttacactcgtaggcttcata-3'。以β-actin作为内参，以bmp9mrna/β-actinmrna作为各组bmp9mrna相对含量，并且设定对照组bmp9mrna相对含量为1。4、westernblot检测各组细胞中bmp9蛋白含量取对数生长期膀胱癌t-24细胞，按上述分组培养48h。培养48h后，收集各组细胞后，使用蛋白裂解液4℃裂解30min，4℃高速离心15min，提取细胞总蛋白并定量。取50μg已加入上样缓冲液及煮沸变性的蛋白，在120v电泳分离，210ma转移蛋白至pvdf膜；转膜后用50g/l的脱脂奶粉37℃封闭60min；加兔抗人bmp9mab(1:5000)，小鼠抗人β-actinmab(1:1000)，4℃过夜；洗膜10min×3次，分别加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔igg或辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠igg(1:5000)，37℃孵育1h；使用1×tbst洗膜10min×3次，ecl显影，最后用quantityone4.6.2软件，以β-actin为内参对照对各组条带进行分析，以bmp9蛋白条带灰度/β-actin蛋白条带灰度作为各组bmp9蛋白相对含量，并且设定对照组bmp9蛋白相对含量为1。5、统计学方法应用spss19.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差表示，多组间计量数据比较采用one-wayanova分析，组间比较采用lsd，以p<0.05表示差异具有统计学意义。三、实验结果结果如表1和图2-3所示。与对照组相比，小白菊内酯低浓度组、高浓度组细胞中bmp9mrna含量、bmp9蛋白含量均显著降低(p＜0.05)，且呈现浓度依赖。木香烃内酯低浓度组、高浓度组细胞中bmp9mrna含量、bmp9蛋白含量与对照组无明显差异。表1各组细胞中bmp9mrna、bmp9蛋白含量bmp9mrna相对含量bmp9蛋白相对含量对照组11小白菊内酯低浓度组0.690.65小白菊内酯高浓度组0.520.50木香烃内酯低浓度组0.950.94木香烃内酯高浓度组0.960.95实施例2：小白菊内酯对膀胱癌细胞增殖和迁移能力的抑制作用一、实验材料小白菊内酯和对比化合物木香烃内酯同实施例1。膀胱癌t-24购于上海细胞生物研究所。rpmi-1640培养基、胎牛血清购于hyclone公司。噻唑蓝(mtt)购于美国sigma公司。二、实验方法1、细胞培养同实施例1。2、分组和给药同实施例1。3、细胞增殖活力测定采用mtt法，收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度，按5×103个/孔密度接种于96孔板中，每孔加入100μl细胞悬液；待细胞贴壁后按上述方法进行分组给药培养，每组设3个复孔，培养48h后弃上清，每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml)，37℃孵育4h，弃培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，用酶标仪测定490nm处吸光度(a)值，实验独立重复3次。按如下公式计算各给药组细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率＝1-[(a用药组-a空白孔)/(a对照组-a空白孔)]×l00％4、细胞迁移能力测定取对数生长期膀胱癌t-24细胞，按上述分组培养48h。培养48h后，收集细胞，调整细胞悬液浓度至2.5×105个/ml，将200μl细胞悬液到加入包被matigel基质胶的transwell上室，下室加入600μl含10％血清的rpmi-1640培养基，将其放到培养箱中再培养24h。取出小室，弃上室中的培养基，用4％多聚甲醛将滤膜固定10min。丢弃甲醛，再用1％结晶紫进行染色3min。擦掉未穿过transwell小室膜的细胞，在显微镜高倍镜下随机挑选5个视野并进行计数，然后将给药组除以对照组得到抑制率。5、统计学方法同实施例1。三、实验结果结果如表2和图4-5所示。与对照组相比，小白菊内酯低浓度组、高浓度组细胞增殖活力、细胞迁移能力均显著降低(p＜0.05)，且呈现浓度依赖。木香烃内酯低浓度组、高浓度组细胞增殖活力、细胞迁移能力与对照组无明显差异。表2各组细胞增殖抑制率和迁移抑制率细胞增殖抑制率(％)细胞迁移抑制率(％)小白菊内酯低浓度组48.245.1小白菊内酯高浓度组70.568.3木香烃内酯低浓度组6.86.5木香烃内酯高浓度组7.06.9实施例3：小白菊内酯的药物制剂1、小白菊内酯片剂小白菊内酯200mg，淀粉88g，硬脂酸镁3g。制备工艺：取小白菊内酯加淀粉、硬脂酸镁混合均匀，制成颗粒，干燥，压片，即得。2、小白菊内酯胶囊小白菊内酯200mg，淀粉88g，硬脂酸镁3g。制备工艺：取小白菊内酯加淀粉、硬脂酸镁混合均匀，制成颗粒，干燥，装胶囊，即得。3、小白菊内酯注射液小白菊内酯47mg，注射用氯化钠7mg。制备工艺：取小白菊内酯加1.9ml注射用水溶解，加入注射用氯化钠至等渗，调节ph值至7-7.1，滤过，冷藏24小时，加注射用水至规定量，滤过，灌封，灭菌，即得。4、小白菊内酯片剂小白菊内酯由小白菊内酯和氢氧化钠成盐制备得到。小白菊内酯200mg，淀粉88g，硬脂酸镁3g。制备工艺：取小白菊内酯加淀粉、硬脂酸镁混合均匀，制成颗粒，干燥，压片，即得。上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。当前第1页12