本发明属于医学技术领域，特别是涉及一种小鼠灌注固定装置以及灌注固定方法。
背景技术：
组织化学技术被广泛应用于生物医药的基础和临床研究的各个领域，通过相应的组织化学方法，在组织细胞内原位显示其中的各种化学成分，并对其进行定性、定位和定量研究，从而分析生理或病理状态下生物体的代谢、机能及形态变化规律。一般而言，组织样品需要经过取材、固定、包埋和切片等步骤，才能进行相应的组织化学染色。为了更好地保持组织和细胞的固有形态结构、化学成分的分布和反应性等，组织样品经过取材后要迅速固定，这样能够有效抑制自溶、阻止溶解、防止腐败、减少损伤、硬化组织、改变折光率和增强染色等。因此，在制备切片的过程中，固定是非常重要的步骤。对于不同类型的组织应选择合适的固定剂和固定方法，针对中枢神经系统和肝脏等器官的取材，通常选用多聚甲醛作为固定剂，配合灌注固定法，通过心血管途径将固定剂迅速灌注到全身各组织，使细胞在原位被快速均匀固定，从而有效保存酶的活性及组织细胞的细微结构。同时，灌注冲洗还能排除血液中红细胞内假过氧化物酶的干扰。
多聚甲醛是甲醛以聚合物形式存在的一种白色固体试剂，多作为固定剂替代甲醛使用，可以减少甲醛溶液中的稳定剂甲醇对酶反应的影响。由于多聚甲醛具有组织穿透力强、组织收缩小、固定均匀、能保存脂肪和类脂质及价格低廉等优点，常用于动物灌注固定及灌注后固定。虽然多聚甲醛是良好的固定剂，但它易挥发、有刺激性气味、有腐蚀性、可致癌。如果在灌注过程中无法有效回收多聚甲醛，其在室内达到一定浓度时，会刺激实验人员产生眼痒、流泪、咳嗽及头痛等不适反应，并且长期接触多聚甲醛对呼吸道有致敏作用(msds)。因此，如何在灌注固定过程中最大程度的回收多聚甲醛并进行后续处理，对于保护实验人员人体健康和环境安全至关重要。
目前，小鼠灌注固定装置多为手工自制，缺乏有效的操作、收集和储存装置。同时，灌注固定过程中无法有效回收多聚甲醛，灌注固定后的废液通常直接倒入下水道，直接危害人体健康和环境安全。另外，实验操作需要至少两人同时配合，且每次只能灌注一只小鼠，整个过程耗时耗力。
技术实现要素：
基于此，本发明的目的在于，提供一种简易、安全、高效的小鼠灌注固定装置及其灌注固定方法。
本发明的技术方案如下：
一种小鼠灌注固定装置，其包括一固定装置和一输液装置；所述的固定装置为有机玻璃制成的透明长方状盒体，并设有操作台、器械盒和收集盒；所述的输液装置设有输液瓶、输液泵、转换阀、输液管和输液针。
进一步地，所述的操作台和器械盒并排设置，并置放在所述收集盒的顶部；所述的操作台设有收集孔、固定孔、固定绳和固定扣，所述收集孔与所述收集盒相连通，所述固定绳缠绕安装在所述固定孔上，所述固定扣安装在所述固定绳上；所述的收集盒设有进水孔、出水孔以及两个密封塞，所述两个密封塞分别过盈配合安装在所述进水孔、出水孔中。
进一步地，所述的操作台与器械盒均呈凹字形，且两者之间通过一侧壁相隔，所述的侧壁上设有卡槽；所述的输液管可拆卸地安装在所述的卡槽上。
进一步地，所述收集孔、固定孔均设置在所述操作台的底侧，并与所述收集盒相连通；所述进水孔位于所述收集盒一端的上表面，所述出水孔位于所述收集盒另一端的侧面。
进一步地，所述的操作台设有两组收集孔、四组固定孔、四组固定绳和四组固定扣；每组固定孔均设有两个以上的固定孔，每组固定孔分别安装有一组固定绳和一组固定扣；所述四组固定孔的分布位置分别与小鼠四肢的展开位置相对应，所述两组收集孔的位置分别位于小鼠躯干固定位置的两侧。
进一步地，所述的操作台包括并排设置的第一操作台和第二操作台，所述的器械盒包括并排设置的第一器械盒、第二器械盒和第三器械盒。
进一步地，所述的第一操作台与第一器械盒通过第一侧壁相隔并排设置，所述的第二操作台与第三器械盒通过第二侧壁相隔并排设置；所述的第一侧壁上设有第一卡槽，所述的第二侧壁上设有第二卡槽。
进一步地，所述输液管的一端安装有与之相连通的输液针，另一端通过所述输液泵、转换阀与所述输液瓶相连通。
进一步地，所述的输液装置设有若干个输液瓶，所述若干个输液瓶的液体通过所述转换阀轮流输送至所述输液管。
一种小鼠灌注固定方法，采用本发明所述的灌注固定装置，具体包括以下步骤：
1)将经过麻醉处理的小鼠放置在操作台上，并通过固定绳和固定扣将其四肢固定在操作台上；
2)对小鼠进行剖腹处理，暴露其心脏组织，将输液针穿刺至小鼠的心脏中，启动输液泵以将输液瓶内的液体灌注至小鼠的心脏中；
3)将灌注的废液通过收集孔流入并储存在收集盒中，待灌注操作完成后，将收集盒中的废液经出水孔进行回收处理。
本发明所述的小鼠灌注固定装置，集操作台、器械盒和废液收集盒为一体，具有功能多样、安全、高效、便捷等优点。本小鼠灌注固定装置只需放置在实验平台即可操作，也可放置在通风橱等环境中操作，可移动性强，可满足教学和科研的各种条件使用。灌注操作后的废液，能够快速收集至收集盒中，能有效避免多聚甲醛等固定剂的挥发，避免多聚甲醛等固定剂对实验人员的身体和环境造成危害。通过并排设置两个操作台，能够交替进行实验小鼠的灌注固定，有效提高实验效率。通过配置若干个输液瓶，与转换阀、输液泵配合使用，能够有效减少灌注固定的时间和耗液量，从而有效提高灌注固定的效果。
本发明所述的小鼠灌注固定方法，通过使用本发明的小鼠灌注固定装置，能够实现小鼠的快速灌注固定，并具有灌注固定效果好、安全性高、操作便捷等优点。
附图说明
图1为本发明所述小鼠灌注固定装置的固定装置结构示意图；
图2为本发明所述小鼠灌注固定装置的输液装置结构示意图；
图3为本发明所述小鼠灌注固定装置的操作台结构示意图；
图4为本发明所述小鼠固定灌注装置的固定绳结构示意图。
具体实施方式
实施例一：小鼠灌注固定装置
如图1至图4所示，本发明所述的小鼠灌注固定装置，包括一固定装置和一输液装置。该固定装置为一有机玻璃制成的透明长方状盒体，其设有第一操作台11、第二操作台12、第一器械盒21、第二器械盒22、第三器械盒23和收集盒30。该输液装置设有第一输液瓶41、第二输液瓶42、转换阀43、输液泵44、输液管45和输液针46。
收集盒30位于长方状盒体的底部，第一操作台11、第二操作台12、第一器械盒21、第二器械盒22、第三器械盒23均位于收集盒30的顶部，且均呈凹字形。第一器械盒21和第三器械盒23可用于存放手术器械，第二器械盒22可用于存放动脉夹。
收集盒30的一端上表面设有进水孔31，另一端侧面设有出水孔32，进水孔31和出水孔32上分别过盈配合安装有密封塞33，密封塞33为一弹性橡胶塞。
第一操作台11和第二操作台12横向并排设置，第一器械盒21、第二器械盒22和第三器械盒23依次横向并排设置。第一操作台11和第一器械盒21纵向并排设置，两者之间通过第一侧壁13相隔；第二操作台12和第三器械盒23纵向并排设置，两者之间通过第二侧壁14相隔。第一侧壁13和第二侧壁14上分别设有一个用于安装输液管45的卡槽15。
第一操作台11和第二操作台12各设有两组收集孔51、四组固定孔52、四组固定绳53以及四组固定扣54。收集孔51和固定孔52分别设置在第一操作台11和第二操作台12的底侧，并分别与收集盒30相连通。两组收集孔51的位置分别位于小鼠躯干固定位置的两侧，四组固定孔52的分布位置分别与小鼠四肢的展开位置相对应。每组固定孔52均设有两个固定孔，固定绳53缠绕安装在同一组的两个固定孔52上，固定扣54安装在固定绳53上。
输液管45的一端安装有与之相连通的输液针46，另一端通过转换阀43、输液泵44分别与第一输液瓶41、第二输液瓶42相连通，第一输液瓶41、第二输液瓶42的液体通过转换阀43轮流输送至输液管45中。
实施例二：小鼠灌注固定方法
1、配制溶液
磷酸盐缓冲液：先分别配制1mol/l的k2hpo4溶液和1mol/l的kh2po4溶液，然后取80.2ml的k2hpo4溶液和19.8ml的kh2po4溶液，混合均匀，得到0.1mol/l的磷酸盐缓冲液，ph＝7.4，于4℃保存备用。
多聚甲醛溶液：称取4g多聚甲醛，溶解于100ml0.1mol/l的磷酸盐缓冲液中，于磁力搅拌器上搅拌加热，滴加1mol/l的naoh溶液至澄清，调整ph值至7.4，定性滤纸过滤，得到质量浓度为4％的多聚甲醛溶液，于4℃避光保存备用。
水合氯醛溶液：称取4.3g水合氯醛，溶解于100ml0.1mol/l的磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀，得到质量浓度为4.3％的多聚甲醛溶液，于4℃避光保存备用。
2、麻醉
采用spf级体重为20～30g的balb/c小鼠作为采集体，雌雄不限。
取水合氯醛溶液，以0.01ml/g体重的剂量，对小鼠进行腹腔注射麻醉，2～3分钟后夹捏小鼠后肢，如无反应，说明麻醉程度合适，如有肢体抽动反应，追加少许麻醉剂，以避免手术疼痛引起肌肉痉挛压迫血管，影响灌注效果。
3、固定
取实施例一的小鼠灌注固定装置，分别将磷酸盐缓冲液、多聚甲醛溶液装入实施例一所述的小鼠灌注固定装置的第一输液瓶41、第二输液瓶42中，并将输液管45安装在第一卡槽15中。将手术器械、动脉夹等分别放置在第一器械盒21、第二器械盒22中。
将麻醉后的小鼠放置在第一操作台11的两组收集孔51中间，小鼠腹面朝上，分别将小鼠的前肢和后肢分别穿入四组固定绳53内，对应拉紧固定扣54，进而将小鼠的四肢固定在第一操作台11上。然后，将小鼠的舌头拉出，防止舌头后缩阻塞呼吸道。
4、穿刺
从小鼠的后肢中线剪开腹部皮肤，分离皮下组织至两侧腋前线，剪开肌肉层及膈肌，沿左右肋缘横向剪开两胸侧壁，用止血钳夹住剑突将胸壁翻向头部，切勿横断。打开胸腔，剪开心包膜，暴露心脏，将输液针46插入左心室中，用动脉夹固定心尖及输液针46，操作时间控制在60秒以内，避免输液针46刺破心室壁，避免动脉夹夹闭输液针46的针尖。
5、灌注
开启输液泵44，设定输液程序(20ml，5分钟)，先将磷酸盐缓冲液注入心脏内，右心耳充盈后用眼科剪剪开，开放体循环通道。调整转换阀43，将多聚甲醛溶液注入心脏，设定输液程序(20ml，5分钟；30ml，15分钟)。此时，小鼠出现强烈反应，尾巴向上翘起抖动。灌注固定的废液通过位于小鼠身体两侧的收集孔51流入收集盒30内进行暂存。
当第一操作台11的小鼠进行灌注固定后，可以在第二操作台12进行第二只小鼠的灌注固定。通过两个操作台的交替灌注，可以有效提高灌注效率，节约实验操作时间。
6、取样
沿小鼠两耳中线剪开头部皮肤，在枕骨大孔后方剪断颈椎，分离除去后颈部肌肉，用手术刀刀尖沿头骨中缝划开头骨，注意避免损伤大脑，用尖镊子从枕骨大孔处开始，逐步剔除颅骨，注意清理脑表面的脑膜和两侧的断骨，用眼科剪于两侧剪断视神经并探到颅底，可将整个脑组织取出。灌注固定成功的脑组织具有相当的硬度和弹性，呈白色，且无血色。
将完整取下的脑组织置于含有多聚甲醛溶液的离心管中，于4℃继续固定4～6小时，然后将离心管内的多聚甲醛溶液置换成质量浓度为30％的蔗糖溶液，于4℃脱水至脑组织沉入离心管底部。最后，将脱水后的脑组织放入冻存管中，在液氮中迅速冰冻20秒以上，于-80℃保存。
7、清洗
待灌注固定结束后，打开收集盒30的出水孔32，将灌注固定后的废液倒入贮液桶中进行回收处理，然后打开进水孔31，通入自来水清洗灌注固定装置的内部和表面。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。