本发明涉及一种疫苗的制备方法，尤其是一种用于预防红鳍东方鲀海洋尾丝虫病疫苗的制备方法。
背景技术
海洋尾丝虫隶属于盾纤毛虫类，是一种个体微小的兼性寄生纤毛虫，寄生于红鳍东方鲀可引起红鳍东方鲀海洋尾丝虫病。该病传染性强、传播范围广，能引起体表粘液增多，体色发黑，背部白浊、溃烂或脱皮，头部红肿，鳃盖内侧肿胀、充血、积水，鳃褪色或糜烂，腹部膨胀、局部红肿、出血或溃烂，鳍出血、溃烂等症状，对红鳍东方鲀养殖业造成大量的经济损失。因此，预防红鳍东方鲀海洋尾丝虫病意义重大。
目前，针对海洋尾丝虫病的治疗方法主要有物理治疗方法、化学药物治疗方法和中草药治疗方法。物理治疗方法如淡水浴，并不能彻底杀死海洋尾丝虫；化学药物治疗方法（如甲醛）副作用大，对鱼伤害大且污染环境；中草药治疗方法效果不佳等。迄今为止，并没有制备红鳍东方鲀海洋尾丝虫病疫苗的相关报道。
技术实现要素：
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种红鳍东方鲀海洋尾丝虫病疫苗的制备方法。
本发明的技术解决方案是：一种红鳍东方鲀海洋尾丝虫病疫苗的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：
a.分离寄生于红鳍东方鲀体表的海洋尾丝虫，接种于肉汤培养基中，进行体外驯化培养至少15天，得体外驯化培养的海洋尾丝虫液，所述肉汤培养基是每100ml灭菌海水加5g匀浆鱼肉煮沸10min，再用200目的纱布过滤的滤过物；
b.再将体外驯化培养的海洋尾丝虫液接种于肉汤培养基中，接种量与肉汤培养基的体积比为1:100，20℃培养120小时，得到处于生长期海洋尾丝虫液；
c.吸取1ml处于生长期的海洋尾丝虫液至灭菌的1.5ml离心管中，2000rpm离心10分钟，弃上清液后向离心管中加入1mll-15完全培养基，静置5min，所述l-15完全培养基是在l-15培养基中添加质量百分比为1%的青链霉素及质量百分比为10%的胎牛血清，用氯化钠调节盐度为35‰，调节ph为7.2；之后吸取上清液于另一离心管中，2000rpm离心10分钟，弃上清液，再用1mll-15完全培养基重悬，得到海洋尾丝虫重悬液；
d.用l-15完全培养基稀释海洋尾丝虫重悬液，稀释至低倍显微镜下一个视野内有10~20个海洋尾丝虫为止；
e.在多孔板的孔中分别加入200µl的l-15完全培养基，反复从海洋尾丝虫重悬液中吸取一个游动快的海洋尾丝虫置入有培养基中，20℃恒温培养96小时，得到海洋尾丝虫成活液；
f.用l-15完全培养基稀释海洋尾丝虫成活液至1000个/ml，从中吸取100µl的海洋尾丝虫成活液接种于50ml锥形瓶中，加入20ml的l-15完全培养基，封口膜密封，20℃恒温培养120小时，得到海洋尾丝虫扩大培养液；
g.将海洋尾丝虫扩大培养液转移到离心管中，2000rpm离心10分钟，弃上清液，加入l-15完全培养基静置5min，吸取上清加入另一离心管中，用甲醛溶液灭活，4000rpm离心10分钟，弃上清液，再用l-15完全培养基配制成密度为200万个/ml的灭活幼虫液；
h.用超声波破碎仪破碎灭活幼虫后，再与等体积的弗氏佐剂或弗氏不完全佐剂混合，将混合液振荡至乳液状，即可。
本发明操作简单、针对性强，有良好预防效果的疫苗密度为100万个/ml。通过腹腔注射刺激红鳍东方鲀，可提高其免疫力，可有效防御海洋尾丝虫的寄生和感染，大大降低了死亡率，减少了养殖户的经济损失。
附图说明
图1~图6是本发明实施例对照组四尾鱼体表溃烂照片。
图7~图8是本发明实施例实验组鱼血清对海洋尾丝虫凝集作用效果示意图。
具体实施方式
实施例：
a.从某养殖场红鳍东方鲀体表溃烂组织处分离出虫体，经鉴定为海洋尾丝虫幼体（uronemamarinum）。将分离得到的虫体接种于肉汤培养基中，进行体外驯化培养15天，得体外驯化培养的海洋尾丝虫液，所述肉汤培养基是每100ml灭菌海水加5g匀浆鱼肉煮沸10min，再用200目的纱布过滤的滤过物；
b.再将体外驯化培养的海洋尾丝虫液接种于肉汤培养基中，接种量与肉汤培养基的体积比为1:100，20℃培养120小时，得到处于生长期海洋尾丝虫液；
c.吸取1ml处于生长期的海洋尾丝虫液至灭菌的1.5ml离心管中，2000rpm离心10分钟，弃上清液后向离心管中加入1mll-15完全培养基，所述l-15完全培养基是在l-15培养基中添加质量百分比为1%的青链霉素及质量百分比为10%的胎牛血清，用氯化钠调节盐度为35‰，调节ph为7.2，静置5min；之后吸取上清液于另一离心管中，2000rpm离心10分钟，弃上清液，再用1mll-15完全培养基重悬，得到海洋尾丝虫重悬液；
d.用l-15完全培养基稀释海洋尾丝虫重悬液，稀释至低倍显微镜下一个视野内有10~20个海洋尾丝虫为止；
e.在96孔板的9个孔中分别加入200µl的l-15完全培养基，反复从海洋尾丝虫重悬液中吸取一个游动快的海洋尾丝虫置入有培养基的各孔中，20℃恒温培养96小时，得到海洋尾丝虫成活液；
f.用l-15完全培养基稀释海洋尾丝虫成活液至1000个/ml，从中吸取100µl的海洋尾丝虫成活液接种于50ml锥形瓶中，加入20ml的l-15完全培养基，封口膜密封，20℃恒温培养120小时，得到海洋尾丝虫扩大培养液，即获得单一物种的无污染的海洋尾丝虫；
g.将海洋尾丝虫扩大培养液转移到离心管中，2000rpm离心10分钟，弃上清液，加入l-15完全培养基静置5min，吸取上清加入另一离心管中，用甲醛溶液灭活，4000rpm离心10分钟，弃上清液，再用l-15完全培养基配制成密度为200万个/ml的灭活幼虫液，可收集在1.5ml离心管里，-80℃保存；
h.解冻灭活幼虫液，用超声波破碎仪破碎后，与等体积弗氏佐剂或弗氏不完全佐剂混合，将混合液振荡至乳液状（滴一滴在水面上不扩散），即制备成红鳍东方鲀海洋尾丝虫病疫苗（100万个/ml的密度）；与弗氏完全佐剂混合，用于制备初次免疫用疫苗；与等体积的弗氏不完全佐剂混合，用于制备加强免疫用疫苗。
实验：
某养殖场红鳍东方鲀海洋尾丝虫病病发严重，从体表溃烂组织处分离出海洋尾丝虫幼体，经鉴定为海洋尾丝虫（uronemamarinum）。
在2018年3月7号，从该养殖场挑选了20尾健康的红鳍东方鲀（200g左右），暂养15天，没有发病，之后随机分为两组，实验组和对照组，每组10尾鱼。实验组鱼腹腔注射0.1ml本发明实施例初次免疫用疫苗，两周后鱼腹腔注射0.1ml本发明实施例加强免疫用疫苗；对照组注射等体积的l-15完全培养基。同时喂养于一池塘，30天后，对照组有一尾鱼体表溃烂，并将其打捞出来；45天后，对照组又有三尾鱼体表溃烂严重发病，如图1、2、3、4、5、6所示，图2、4、6分别是图1、2、3的放大图，箭头所指为溃烂部位。而实验组鱼在此期间没有发病且生长较好，增重率6.09%明显高于对照组1.81%。测实验组鱼血清对海洋尾丝虫有凝集作用（如图7、8所示）。