本发明涉及鸢尾黄素电子等排体，具体涉及一种n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物在抗肝癌药物中的应用。
背景技术：
原发性肝癌(primaryhepaticcarcinoma，phc)指发生于肝实质细胞或肝内胆管上皮细胞的癌症，是一种恶性程度高、进展快、预后差、生存期短的恶性肿瘤，存活率仅为3％～5％。在全球范围内，原发性肝癌的发病率和死亡率分别排列所有肿瘤的第7位和第3位。我国是肝癌的发病大国，发病率占全球的45％。近年，我国肝癌的发病率呈上升趋势，病死率也随之上升，占全国癌症死亡率的第三位。我国2010年全国普查人口为13.4亿人(台湾地区未包括)，据2003～2007年肝癌发病率和死亡率水平，估计我国每年肝癌发病36万人、死亡35万人。
根据国家和广东省2015年的最新统计数据，广东是肝癌全球最高发地区之一，且呈现高危群体年轻化的倾向。
原发性肝癌的病因至今尚不完全清楚，目前研究表明可能与病毒性肝炎、黄曲霉毒素、肝硬化、饮用水污染、遗传、肥胖、烟酒等因素有关。尤其是沿海地区气候炎热、潮湿，为致癌物黄曲霉素的滋生创造了条件，增加了患肝癌的风险。其次，一些农村居民喝沟塘水或受污染的水，也会增加患肝癌风险。对于东北来说，喝酒是导致肝癌的一个重要诱因，长期饮酒会使肝细胞反复发生脂肪变性、坏死和再生，导致肝硬化，最终转化为肝癌，而由肝硬化转化成肝癌的比例高达70％。近年，临床上治疗肝癌的方法除了传统上的根治性切除、肝移植、放疗化疗等，还有生物治疗与分子靶向药物治疗法。20世纪80年代，美国olidham博士提出肿瘤的生物治疗新概念。它作为继原发性肝癌手术切除、放射治疗、化学治疗之后的第四大辅助治疗模式，通过调节机体自身的生物学反应，来增强机体对肿瘤的防御能力，从而抑制和(或)延缓肿瘤生长、提高生存率、降低复发率。已知肝癌的发病机制十分复杂，其发生、发展和转移与多种基因的突变、细胞信号传导通路和新生血管增生异常等密切相关，其中存在着多个关键性环节，正是进行分子靶向治疗的理论基础和潜在的靶点。
2007年，第一个靶向药物酪氨酸激酶抑制剂在晚期肝癌治疗上获得成功，肝癌的治疗进入靶向治疗新时代。因此，分子靶向药物治疗肝癌已逐渐引起重视,正在成为新的研究热点。近年来，一些分子靶向药物在肝癌治疗方面取得了一定的进展，如：表皮生长因子受体抑制药类：吉非替尼、厄洛替尼、拉帕替尼；多激酶抑制药类：索拉非尼、舒尼替尼；mek/erk类抑制药：a2d6244等。然而上述的分子靶向药物各自也有其局限性。
目前，有必要从我国传统中药的角度着手研究，从民间常用于治疗肝病的中药材中开发一种适宜大规模推广的、惠及平民大众的、制作流程较易的、高效的、副作用小的、定向治疗肝癌的分子靶点新药物。
小鼠的遗传物质和人非常相似，且构建小鼠模型成本较低、周期较短、基因修饰技术更容易实现，因此小鼠是可用于人类肝癌研究较好的模型动物[1]。构建可准确模拟人类肝癌症状、又易于获取、经济适用的小鼠模型不仅有助于深入探究肝癌发生和发病的分子机制，还可用于检测和评估新的肝癌治疗方法和手段，进而促进将实验室的肝癌研究成果转化到临床应用上的目标[2]。
参考文献：
[1]mouh，kennedyz，andersondg，etal.precisioncancermousemodelsthroughgenomeeditingwithcrispr-cas9[j].genomemed.2015，7:53；
[2]李顺，陈丽香，彭秀华，诸蒋鸣，周晓辉.小鼠肝癌模型研究进展[j].中国实验动物学报,2016,4,24(2):213-214。
技术实现要素：
本发明的目的是针对上述问题，提供一种药效显著，不易产生耐药性的一种n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物在抗肝癌药物中的应用。
为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物在抗肝癌药物中的应用。
进一步地，所述n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物，其化学结构式为：
更进一步地，所述n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物通过抑制raf/mek/erk通路和jak/stat通路抑制肝癌细胞增殖；所述n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物通过抑制p13k/akt/mtor通路促进肝癌细胞凋亡；所述n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物通过上调抗细胞凋亡信号p53和抗细胞凋亡信号pten基因从而促进肝癌细胞凋亡。
进一步地，所述n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物通过上调抗细胞凋亡信号p53的表达水平，提高ros的生成，增加线粒体膜的通透性与引起内质网过度应激相结合从而诱导肝癌细胞凋亡；所述n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物通过调控新生血管异常增生通路的相关基因的表达防止肝癌细胞迁移。
进一步地，所述n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物通过下调akt、erk、perk的表达水平，从而抑制肝癌细胞的增殖；所述n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物在治疗肝癌过程中提高肿瘤对药物的敏感性、降低耐药性。
本发明的一种n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物在制备抑制raf/mek/erk通路、jak/stat通路和p13k/akt/mtor通路促进肝癌细胞凋亡并抑制肝癌的药物或者制剂中的应用。
本发明的一种n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物在制备下调抗细胞凋亡信号p53和pten基因从而促进肝癌细胞凋亡并抑制肝癌的药物或者制剂中的应用。
本发明的一种n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物在制备上调抗细胞凋亡信号p53，下调akt、erk、perk的表达水平，提高ros的生成，增加线粒体膜的通透性与引起内质网过度应激相结合从而诱导肝癌细胞凋亡并抑制肝癌的药物或者制剂中的应用。
本发明的一种n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物在制备调控新生血管异常增生通路的抑癌基因p53、erk1/2基因、akt基因的表达防止肝癌细胞迁移并抑制肝癌侵袭和转移药物或者制剂中的应用。
本发明的一种n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物在制备提高肝癌对药物的敏感性、降低肝癌耐药性的药物或者制剂中的应用。
有益效果：本发明的抗肝癌药物治疗效果显著，不易产生耐药性和不良反应。
在另一个方面，本发明提供了上述n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物的产率更高的制备方法，包括如下步骤：
(1)将1,3-二溴-2-甲氧基-5-硝基苯溶解于乙醇，然后加入na2s2o4水溶液，于50～60℃下搅拌3～7小时，冷却至室温，用乙酸乙酯提纯，之后经洗涤、干燥，减压以去除乙酸乙酯，得到白色粉末状的3,5-二溴-4-甲氧基苯胺；
(2)将3,5-二溴-4-甲氧基苯胺溶解于ch(ome)3中，搅拌以去除过量的ch(ome)3后，得到白色粉末状的(顺)-n-3,5-二溴-4-甲氧基苯基甲酰亚胺；
(3)将(顺)-n-3,5-二溴-4-甲氧基苯基甲酰亚胺溶解于无水meoh中，然后加入naome并搅拌至均匀，再加入2-(4-甲氧基苯基)乙酸乙酯以除去过量的meoh，之后加水搅拌至均匀，减压过滤得到白色粉末状的(反)-3-(3,5-二溴-4-甲氧基苯基氨基)-2-(4-甲氧基苯基)丙烯酸乙酯；
(4)将(反)-3-(3,5-二溴-4-甲氧基苯基氨基)-2-(4-甲氧基苯基)丙烯酸乙酯溶解于乙醇中，然后加入h2so4，于50℃-70℃下搅拌4-10小时，冷却至室温，加水搅拌，减压过滤得到白色粉末状的5,7-二溴-6-甲氧基-3-(4-甲氧基苯基)喹啉-4(1h)-酮；
(5)将5,7-二溴-6-甲氧基-3-(4-甲氧基苯基)喹啉-4(1h)-酮溶解于dmf和et2o的混合物中，然后逐滴加入pcl3，搅拌8～16小时，之后加水搅拌至均匀，所得混合物用acoet提取，然后经洗涤、干燥以除去acoet，得到白色粉末状的5,7-二溴-4-氯-6-甲氧基-3-(4-甲氧基苯基)喹诺酮，即所述的n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物。
其中，所述步骤(1)中乙醇的当量优选10～20；na2s2o4水溶液的质量浓度优选10～30％；na2s2o4水溶液的当量优选2～6；用乙酸乙酯提纯时，优选提纯三次，每次用2～4倍体积；用乙酸乙酯提纯后的总提取物用饱和盐溶液洗涤并用mgso4干燥；
所述步骤(2)中，ch(ome)3的当量优选10～20，搅拌时间优选6～12小时；
所述步骤(3)中，无水meoh的当量优选10～20；naome的当量优选1～4，搅拌时间优选15～45分钟；2-(4-甲氧基苯基)乙酸乙酯的当量优选1～3，搅拌时间优选4～10小时，之后加水量优选同等体积，搅拌10～20分钟；
所述步骤(4)中，乙醇的当量优选10～20；h2so4的当量优选0.5～1；冷却至室温后加水量优选5～10倍体积，搅拌30～50分钟；
所述步骤(5)中，逐滴加入pcl3时的温度优选0℃；dmf的当量优选20～40，et2o的当量优选20～40，加水量优选2～6倍，acoet提取次数优选为3，每次提取的用量为2～4倍体积，优选采用饱和盐溶液洗涤并用mgso4干燥。
在又一个方面，本发明提供了上述5,7-二溴-4-氯-6-甲氧基-3-(4-甲氧基苯基)喹诺酮在制备抑制移植瘤的药物中的应用。其中，移植瘤优选为小鼠移植瘤；移植瘤来源优选为hepg2细胞、h22细胞或hepa1-6细胞。所述移植瘤可以是原位移植瘤，也可以是异位移植瘤。
在又一个方面，本发明提供了一种抑制肿瘤的药物，所述药物中含有5,7-二溴-4-氯-6-甲氧基-3-(4-甲氧基苯基)喹诺酮。其中，所述肿瘤可以是原发肿瘤，也可以是移植瘤，更优选为移植瘤；最优选为hepg2细胞、h22细胞或hepa1-6细胞来源的移植瘤。更优选地，当肿瘤是hepa1-6或h22细胞移植瘤时，5,7-二溴-4-氯-6-甲氧基-3-(4-甲氧基苯基)喹诺酮的浓度为7～14mg/kg；当肿瘤是hepg2细胞移植瘤时，5,7-二溴-4-氯-6-甲氧基-3-(4-甲氧基苯基)喹诺酮的浓度为8～32μm。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明通过体外培养hepg2细胞，newtectorigenin通过上调抗细胞凋亡信号p53的表达水平，提高ros的生成，增加线粒体膜的通透性与引起内质网过度应激相结合，而诱导hepg2细胞凋亡。还通过下调akt、erk、perk的表达水平，抑制hepg2细胞的增殖。newtectorigenin可作为一种抗肝癌药物运用于防治原发性肝癌等疾病；
(2)采用本发明的n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物的的制备方法合成newtectorigenin，产率显著提高，newtectorigenin的产率可提高10％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同浓度(0μm、4μm、8μm、16μm、24μm和32μm)的newtectorigenin对hepg2细胞的影响结果图；
图2为mtt比色法检测不同浓度(0μm、4μm、8μm、16μm、24μm和32μm)的newtectorigenin处理hepg2细胞24h和48h的存活率结果图；
图3为不同浓度(0μm、4μm、8μm、16μm、24μm和32μm)的newtectorigenin对hepg2细胞核型的影响结果图；
图4为不同浓度(0μm、4μm、8μm、16μm、24μm和32μm)的newtectorigenin对hepg2细胞线粒体膜电位(mmp)的影响结果图；
图5为不同浓度(0μm、4μm、8μm、16μm、24μm和32μm)的newtectorigenin对calnexin的亚细胞定位的影响结果图；
图6为不同浓度(0μm、4μm、8μm、16μm、24μm和32μm)的newtectorigenin对hepg2细胞内ros的影响结果图；
图7为westernblot检测不同浓度(0μm、4μm、8μm、16μm、24μm和32μm)的newtectorigenin对p53、caspase-3、bax、bcl-2蛋白表达的影响结果图；
图8为westernblot检测不同浓度(0μm、4μm、8μm、16μm、24μm和32μm)的newtectorigenin对akt和pi3k蛋白表达的影响结果图；
图9为westernblot检测不同浓度(0μm、4μm、8μm、16μm、24μm和32μm)的newtectorigenin对erk和perk蛋白表达的影响结果图。
图10是正常小鼠、模型组小鼠、低浓度newtectorigenin与高浓度newtectorigenin组h22荷瘤小鼠肿瘤大小变化图；
图11是正常小鼠、模型组小鼠、低浓度newtectorigenin与高浓度newtectorigenin组h22荷瘤小鼠第3周肿瘤大小图；
图12是正常小鼠、模型组小鼠、低浓度newtectorigenin与高浓度newtectorigenin组小鼠实验结束时小鼠活体成像与肿瘤大小图；
图13是模型组小鼠、低浓度newtectorigenin与高浓度newtectorigenin组h22荷瘤小鼠肿瘤组织h&e染色(×200)图；
图14是模型组小鼠、低浓度newtectorigenin与高浓度newtectorigenin组h22荷瘤小鼠肿瘤组织arg-1、afp、ca125、gpc3免疫组化显微观察图(×100)；
图15是模型组小鼠、低浓度newtectorigenin与高浓度newtectorigenin组hepa1-6荷瘤小鼠不同时间肿瘤活体成像图；
图16是模型组小鼠、低浓度newtectorigenin与高浓度newtectorigenin组hepa1-6荷瘤小鼠不同时间肿瘤大小图；
图17是模型组小鼠、低浓度newtectorigenin与高浓度newtectorigenin组小鼠实验结束时小鼠活体成像与肿瘤大小图；
图18是模型组小鼠、低浓度newtectorigenin与高浓度newtectorigenin组hepa1-6荷瘤小鼠肿瘤组织h&e染色(×200)图；
图19是模型组小鼠、低浓度newtectorigenin与高浓度newtectorigenin组hepa1-6荷瘤小鼠肿瘤组织arg-1、afp、ca125、gpc3免疫组化显微观察(×100)图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方法进行清晰、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。如无特别说明，本申请中的试剂浓度均为质量浓度。
实施例1
本发明的n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物的制备方法的一种实施例，包括如下步骤：
(1)室温下将1,3-二溴-2-甲氧基-5-硝基苯溶解于10当量的乙醇中；向所得溶液加入6当量的10％的na2s2o4水溶液，于50℃下搅拌7小时；当反应混合物冷却至室温，用acoet(乙酸乙酯)提取三次，每次用2-4倍体积；总提取物用饱和盐溶液洗涤并用mgso4干燥；减压去除acoet，得到白色粉末状的3,5-二溴-4-甲氧基苯胺；
(2)室温下将3,5-二溴-4-甲氧基苯胺溶解于10当量的ch(ome)3中，搅拌6-12小时；去除过量的ch(ome)3后得到白色粉末状的(顺)-n-3,5-二溴-4-甲氧基苯基甲酰亚胺；
(3)室温下将(顺)-n-3,5-二溴-4-甲氧基苯基甲酰亚胺溶解于20当量的无水meoh中；向上述混合物加入1当量的naome(甲醇钠)，搅拌15-45分钟；再加入1当量的2-(4-甲氧基苯基)乙酸乙酯，搅拌4-10小时；在除去过量的meoh后，加入同等体积的水并搅拌10-20分钟；减压过滤所得混合物，得到白色粉末状的(反)-3-(3,5-二溴-4-甲氧基苯基氨基)-2-(4-甲氧基苯基)丙烯酸乙酯；
(4)室温下将(反)-3-(3,5-二溴-4-甲氧基苯基氨基)-2-(4-甲氧基苯基)丙烯酸乙酯溶解于10当量的乙醇中；向所得混合物加入0.5当量的h2so4，于50℃-70℃下搅拌4-10小时；当反应混合物冷却至室温，加入5倍体积的水并搅拌30-50分钟；减压过滤所得混合物，得到白色粉末状的5,7-二溴-6-甲氧基-3-(4-甲氧基苯基)喹啉-4(1h)-酮；
(5)0℃下，将5,7-二溴-6-甲氧基-3-(4-甲氧基苯基)喹啉-4(1h)-酮溶解于40当量的dmf(n，n-二甲基甲酰胺)和20当量的et2o(乙醚)的混合物中，然后逐滴加入pcl3，搅拌8-16小时；加入6倍体积的水并用力搅拌，所得混合物用4倍体积的acoet提取3次，用饱和盐溶液洗涤并用mgso4.干燥；除去acoet，得到白色粉末状的5,7-二溴-4-氯-6-甲氧基-3-(4-甲氧基苯基)喹诺酮。
上述制备方法相应的合成路线如下：
实施例2
本发明的n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物的制备方法的一种实施例，包括如下步骤：
(1)室温下将1,3-二溴-2-甲氧基-5-硝基苯溶解于15当量的乙醇中；向所得溶液加入2当量的20％的na2s2o4水溶液，于55℃下搅拌5小时；当反应混合物冷却至室温，用acoet提取三次，每次用2-4倍体积；总提取物用饱和盐溶液洗涤并用mgso4干燥；减压去除acoet，得到白色粉末状的3,5-二溴-4-甲氧基苯胺；
(2)室温下将3,5-二溴-4-甲氧基苯胺溶解于16当量的ch(ome)3中，搅拌6-12小时；去除过量的ch(ome)3后得到白色粉末状的(顺)-n-3,5-二溴-4-甲氧基苯基甲酰亚胺；
(3)室温下将(顺)-n-3,5-二溴-4-甲氧基苯基甲酰亚胺溶解于14当量的无水meoh中；向上述混合物加入2当量的naome，搅拌15-45分钟；再加入2当量的2-(4-甲氧基苯基)乙酸乙酯，搅拌4-10小时；在除去过量的meoh后，加入同等体积的水并搅拌10-20分钟；减压过滤所得混合物，得到白色粉末状的(反)-3-(3,5-二溴-4-甲氧基苯基氨基)-2-(4-甲氧基苯基)丙烯酸乙酯；
(4)室温下将(反)-3-(3,5-二溴-4-甲氧基苯基氨基)-2-(4-甲氧基苯基)丙烯酸乙酯溶解于15当量的乙醇中；向所得混合物加入0.8当量的h2so4，于50℃-70℃下搅拌4-10小时；当反应混合物冷却至室温，加入7倍体积的水并搅拌30-50分钟；减压过滤所得混合物，得到白色粉末状的5,7-二溴-6-甲氧基-3-(4-甲氧基苯基)喹啉-4(1h)-酮；
(5)0℃下，将5,7-二溴-6-甲氧基-3-(4-甲氧基苯基)喹啉-4(1h)-酮溶解于20当量的dmf和40当量的et2o的混合物中，然后逐滴加入pcl3，搅拌8-16小时；加入2倍体积的水并用力搅拌，所得混合物用3倍体积的acoet提取3次，用饱和盐溶液洗涤并用mgso4.干燥；除去acoet，得到白色粉末状的5,7-二溴-4-氯-6-甲氧基-3-(4-甲氧基苯基)喹诺酮。
实施例3
本发明的n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物的制备方法的一种实施例，包括如下步骤：
(1)室温下将1,3-二溴-2-甲氧基-5-硝基苯溶解于20当量的乙醇中；向所得溶液加入4当量的30％的na2s2o4水溶液，于60℃下搅拌3小时；当反应混合物冷却至室温，用acoet提取三次，每次用2-4倍体积；总提取物用饱和盐溶液洗涤并用mgso4干燥；减压去除acoet，得到白色粉末状的3,5-二溴-4-甲氧基苯胺；
(2)室温下将3,5-二溴-4-甲氧基苯胺溶解于20当量的ch(ome)3中，搅拌6-12小时；去除过量的ch(ome)3后得到白色粉末状的(顺)-n-3,5-二溴-4-甲氧基苯基甲酰亚胺；
(3)室温下将(顺)-n-3,5-二溴-4-甲氧基苯基甲酰亚胺溶解于10当量的无水meoh中；向上述混合物加入4当量的naome，搅拌15-45分钟；再加入3当量的2-(4-甲氧基苯基)乙酸乙酯，搅拌4-10小时；在除去过量的meoh后，加入同等体积的水并搅拌10-20分钟；减压过滤所得混合物，得到白色粉末状的(反)-3-(3,5-二溴-4-甲氧基苯基氨基)-2-(4-甲氧基苯基)丙烯酸乙酯；
(4)室温下将(反)-3-(3,5-二溴-4-甲氧基苯基氨基)-2-(4-甲氧基苯基)丙烯酸乙酯溶解于20当量的乙醇中；向所得混合物加入1当量的h2so4，于50℃-70℃下搅拌4-10小时；当反应混合物冷却至室温，加入10倍体积的水并搅拌30-50分钟；减压过滤所得混合物，得到白色粉末状的5,7-二溴-6-甲氧基-3-(4-甲氧基苯基)喹啉-4(1h)-酮；
(5)0℃下，将5,7-二溴-6-甲氧基-3-(4-甲氧基苯基)喹啉-4(1h)-酮溶解于30当量的dmf和30当量的et2o的混合物中，然后逐滴加入pcl3，搅拌8-16小时；加入4倍体积的水并用力搅拌，所得混合物用2倍体积的acoet提取3次，用饱和盐溶液洗涤并用mgso4.干燥；除去acoet，得到白色粉末状的5,7-二溴-4-氯-6-甲氧基-3-(4-甲氧基苯基)喹诺酮。
实施例4
本发明的一种n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物在抗肝癌药物中的应用。
所述n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物(即本文中的newtectorigenin)，其化学结构式为：
所述n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物通过抑制raf/mek/erk通路和jak/stat通路抑制肝癌细胞增殖；所述n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物通过抑制p13k/akt/mtor通路促进肝癌细胞凋亡；所述n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物通过上调抗细胞凋亡信号p53和抗细胞凋亡信号pten基因从而促进肝癌细胞凋亡。
所述n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物通过上调抗细胞凋亡信号p53的表达水平，提高ros的生成，增加线粒体膜的通透性与引起内质网过度应激相结合从而诱导肝癌细胞凋亡；所述n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物通过调控新生血管异常增生通路的相关基因的表达防止肝癌细胞迁移。
所述n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物通过下调akt、erk、perk的表达水平，从而抑制肝癌细胞的增殖；所述n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物在治疗肝癌过程中提高肿瘤对药物的敏感性、降低耐药性。
本发明的一种n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物在制备抑制raf/mek/erk通路、jak/stat通路和p13k/akt/mtor通路促进肝癌细胞凋亡并抑制肝癌的药物或者制剂中的应用。
本发明的一种n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物在制备下调抗细胞凋亡信号p53和pten基因从而促进肝癌细胞凋亡并抑制肝癌的药物或者制剂中的应用。
本发明的一种n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物在制备上调抗细胞凋亡信号p53，下调akt、erk、perk的表达水平，提高ros的生成，增加线粒体膜的通透性与引起内质网过度应激相结合从而诱导肝癌细胞凋亡并抑制肝癌的药物或者制剂中的应用。
本发明的一种n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物在制备调控新生血管异常增生通路的抑癌基因p53、erk1/2基因、akt基因的表达防止肝癌细胞迁移并抑制肝癌侵袭和转移药物或者制剂中的应用。
本发明的一种n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物在制备提高肝癌对药物的敏感性、降低肝癌耐药性、在治疗肝癌过程中同时可提高机体免疫力的药物或者制剂中的应用。
实施例中所用的试剂药品如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司；所研究的新化合物newtectorigenin由南京大学朱海亮教授提供。
本发明所研究的新化合物newtectorigenin，是以鸢尾黄素的结构式为基础，经结构优化而合成的n电子等排体鸢尾黄素衍生物。鸢尾黄素即5，7，4-三羟基-6-甲氧基异黄酮，是鸢尾属植物的主要成分，常见于中药射干与鸢尾中。其具有类雌激素、抗氧化、保肝、抗癌等生物活性与药理作用。
体外实验进一步表明，鸢尾黄素对hl-60细胞(白血病细胞)有很强的抑制作用，对bgc细胞(人体胃腺癌细胞)的增殖也有一定程度的抑制作用。thelenpetal.的动物实验也表明，鸢尾黄素有明显的抑制肿瘤的作用，发现其可以作为预防和治疗人的前列腺癌的药物。saratikov，a.s.etal.的研究表明，鸢尾黄素等多羟基化合物能抑制肝细胞的坏死，阻止肝内脂肪和蛋白质的失衡，使转氨酶和谷氨酰基转移酶的活性正常化，防止了肝纤维化的发展，起到保护肝脏、恢复肝功能的作用。
但是由于鸢尾黄素在中药射干中的含量较低，且分离纯化的难度较大，不易获得。因此，南京大学课题组结合自身技术优势，利用电子等排设计的思想，对鸢尾黄素进行了全合成研究，并以此研究为基础，设计、合成了一系列200多个n电子等排体鸢尾黄素衍生物。
在此系列鸢尾黄素衍生物中，newtectorigenin的活性最强，同时具有很好的安全性和稳定性。然而，newtectorigenin作为鸢尾黄素衍生物，在抑制肝癌细胞增殖、保护肝脏、功能方面未见报道。因此，本研究的目的在于通过实验探究，newtectorigenin抗肝癌活性及其抗肝癌的分子作用靶点。
试验1
newtectorigenin对小鼠肝癌模型的抑制作用
1.1小鼠肝癌模型建立
1.1.1二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine，den)化合物诱导法
将60只健康雌性小鼠随机分为正常对照组、den小组、newtectorigenin与den喂养组，每20只。正常对照组给予正常饲料，den组和newtectorigenin与den喂养组，用0.25％den水溶液按10mg/kg体重灌胃每周一次，其余时间0.025％den水溶液由其自由饮用，而newtectorigenin与den喂养组加喂newtectorigenin(100mg/kg)，喂养约4个月。
1.1.2移植法
将70只健康昆明种小鼠随机分为对照组、newtectorigenin组、模型组、阳性对照组与高、中、低剂量newtectorigenin喂养模型组，每组10只，雌雄各半。除对照组、newtectorigenin组外，于每只小鼠的右前肢腋部皮下注射2×107的hepg2细胞悬液0.2ml。接种第二天开始，newtectorigenin组、高、中、低剂量喂养newtectorigenin组每天灌胃给药1次，连续给药10天；阳性药物组每天灌胃给药1次；对照组和模型组灌胃等体积的0.9％氯化钠溶液。
给药前及末次给药后次日称取小鼠体质量，切除各组肝癌组织，称取瘤块组织质量，研究对小鼠体质量的影响及通过计算抑瘤率研究瘤质量的影响。
1.2冰冻切片：
处死小鼠取其肝脏，解剖显微镜下观察计算肝脏大小，并拍照，然后进行冰冻切片。将肝脏组织在固定液固定，固定后充分水洗，洗净,不宜选用含甲醛类固定液。组织水洗后浸入12.5％明胶水溶液(以1％石碳酸水溶液配制)，于37℃温箱浸6-24h。移至25％明胶溶液内浸6-24h。25％明胶包埋，连同包埋器放入冰箱内使明胶迅速凝固，取出后在空气中蒸发10min。放入组织固定液固定明胶块1-2日。再用蒸馏水洗后，置冰冻切片机或滑动式切片机切片。切片保存于10％甲醛液中。用不同试剂染色，染色后不经乙醇脱水及二甲苯透明，而用明胶溶液或其他类似的明胶溶液封片：果糖26g,明胶1.1g，钾矾0.75g，麝香草酚水溶液1.15ml。
试验2
newtectorigenin对hepg2细胞的抑制作用
2.1复苏hepg2细胞
将冻存的hepg2细胞从液氮罐中拿出，迅速置于38℃恒温水浴锅中，快速摇动，待其消融后，在超净工作台中用离心管转移细胞悬液，用800rpm，25℃的条件离心5min后，收集细胞沉淀，添加适量培养液(使用低糖dmem培养液，含有2％100u/ml双抗和10％fbs)吹打混匀后转到培养瓶，放到培养箱中培养。培养条件：5％co2、37℃饱和湿度。培养12h后，使用倒置相差显微镜观察复苏hepg2细胞的效果，未贴壁漂浮的为死细胞或细胞碎片，已贴壁或已分化的为活细胞。
2.2newtectorigenin处理hepg2细胞
待hepg2细胞贴壁长至80％以上时，用pbs缓冲液清洗2次，再用0.25％trypsin酶解3min，最后以大约1.0×105个/ml的密度分到六孔板中，实验组添加不同剂量的newtectorigenin(使得终浓度分别为2μmol/l、4μmol/l、8μmol/l、12μmol/l、16μmol/l)，对照组则以dmem培养液等量代替，置于培养箱中培养24h，在倒置显微镜下分别观察hepg2细胞的生长情况并拍照记录。在相同处理条件下重复三次实验。
如图1所示，随着newtectorigenin浓度的上升，与对照组相比，细胞数量和密度逐渐减少，细胞边缘逐渐不明显，或堆积成团，或皱缩成圆形，或断裂成碎片。当newtectorigenin浓度为4μm时，细胞数量和密度降低不明显；当newtectorigenin浓度为8μm时，相对与对照组hepg2细胞数量和密度明显减少，而且开始出现细胞碎片和皱缩成圆形的细胞；而当newtectorigenin浓度达到32μm时，绝大部分hepg2细胞死亡，只剩下皱缩成圆形的即将凋亡的细胞和细胞裂解死亡的细胞碎片。因此实验初步表明newtectorigenin能抑制hepg2细胞的增殖和生长。
试验3
mtt比色法检测hepg2细胞活性
为了进一步探究newtectorigenin对hepg2细胞的抑制作用，用mtt比色法检测细胞存活率，通过具体数据更能表明newtectorigenin对hepg2细胞的抑制作用。
具体方法如下：体外培养hepg2细胞至生长对数期，数量达90％后用0.25％trypsin酶解成单细胞悬液，分到96孔板中，密度为1.0×105个/ml，置于培养箱中培养24h。待细胞贴壁后，按前面设计的剂量添加newtectorigenin，每个浓度设5个复孔，对照组加入等量无菌pbs，继续培养24h和48h。培养后每孔添加20μlmtt，在培养箱中孵育4h，将原培养液吸掉，每个孔添加150μldmso，用微量振荡器震动10min，使甲瓒充分溶解。在酶标仪上用空白对照组进行凋零，490nm波长下测定各孔的od值，重复三次实验。根据od值算出细胞的存活率和生长抑制率：
公式1细胞存活率的计算公式
公式2细胞生长抑制率的计算公式
如图2所示，用不同剂量的newtectorigenin处理hepg2细胞24h和48h后，hepg2细胞的活性均明显降低，生长抑制率明显升高，且48h的抑制作用均比24h要大。说明newtectorigenin具有一定的细胞毒性，且随着newtectorigenin剂量的增加，对hepg2细胞的生长抑制率逐渐加大，具有剂量效应和时程效应，差异具有显著性(p＜0.05)。
试验4newtectorigenin对细胞核核型的影响
上述实验结果表明newtectorigenin在一定浓度范围内会影响hepg2细胞的活性，抑制hepg2细胞生长，引发hepg2细胞凋亡。为进一步观察其凋亡特征，采用hochest33258荧光染色法，观察加药后，hepg2细胞核型的变化。
具体方法如下：体外培养hepg2细胞至生长对数期，数量达90％后用0.25％trypsin酶解成单细胞悬液，分到六孔板中，密度为1.0×105个/ml，置于培养箱中培养。待细胞贴壁后，按前面设计的剂量添加newtectorigenin，对照组则用等量的dmem培养液来代替。在培养箱中培养48h后，吸净原培养液，用pbs清洗3遍，每个孔加入0.5ml固定液(甲醇：冰ch3cooh＝3:1，现配使用)固定20min。而后弃固定液，用pbs以3min一次清洗3次，每孔避光添加0.5mlhochest33258染色液，室温孵育15min，吸走染色液，用pbs以3min一次清洗3次，避光风干即可使用荧光显微镜进行显色观察，并拍照记录。
结果如图3所示，未经newtectorigenin处理的空白对照组的细胞核呈现弥散均匀的荧光，这说明大多都是活细胞。而实验组经newtectorigenin处理48h后的hepg2细胞的细胞核呈现浓染致密的荧光，核仁裂解，呈颗粒块状，出现凋亡小体。随着newtectorigenin浓度的加大，hepg2细胞凋亡的特征更加明显，具有一定的剂量效应。
试验5newtectorigenin对细胞线粒体膜电位(mmp)的影响
上述实验说明了newtectorigenin对hepg2细胞核的影响，为了进一步探究newtectorigenin对线粒体膜电位的影响，本团队进行了罗丹明123染色试验。
具体方法如下：按上述加药方法相应处理hepg2细胞，培养24h后，小心吸出原培养液，用pbs清洗1次后，每个孔分别加入1ml罗丹明123工作染液，置于co2培养箱中孵育30min。之后吸弃染液，用正常低糖培养基对孔内细胞清洗2次，在荧光显微镜下观察线粒体的形态和分布，并比较各实验组及对照组的荧光强度。罗丹明123染液可使活细胞中的线粒体呈现绿色荧光，为短棒状或颗粒状。
如图4所示，用不同浓度的newtectorigenin处理hepg2细胞后，与对照组相比，细胞内的荧光程度有所降低，且浓度越大，荧光越弱，具有浓度效应。结果提示，newtectorigenin导致线粒体膜的通透性增加，使mmp降低。
试验6newtectorigenin对calnexin的亚细胞定位的影响
为观察newtectorigenin对hepg2细胞内质网的影响，用calnexin抗体对细胞进行染色。
具体方法如下：按上述加药方法相应处理hepg2细胞，培养24h后，吸走六孔板内培养液，再小心加入现配固定液覆盖孔的表面，固定40min。用pbs以5min一次清洗2次后，每孔加入1ml5％bsa，放到摇床上慢速进行细胞封闭。1h后吸走孔内液体，加入一抗稀释液(含有calnexin)，摇床上慢速孵育1h后，置于4℃冰箱过夜。第二天吸走孔内液体，用pbs以5min一次清洗3次，加入rabbitanti-mouse二抗稀释液，继续在摇床上孵育1h，结束后用pbs以5min一次清洗3次，再加入dab显色工作液，显色3min左右，最后用苏木素染液复染30s，脱水，空中风干，封片，于显微镜下观察内质网的染色情况。
结果如图5所示，newtectorigenin处理后的实验组染色相较对照组要浅，且随着newtectorigenin浓度的加大，颜色逐渐变浅，具有浓度效应。这表明新合成的蛋白与calnexin结合减少，错误折叠或未组装的蛋白亚基被滞留在内质网内，导致颜色变浅。newtectorigenin引起内质网过度应激，从而诱导hepg2细胞凋亡。
试验7newtectorigenin对hepg2细胞内ros的影响
ros可对细胞膜结构、核酸和蛋白分子产生氧化作用，引起其结构和功能障碍。ros增多导致机体氧化应激反应(oxidativestress)造成细胞损伤，参与多种病理机制。为了测定newtectorigenin对细胞内ros的含量的影响，利用荧光探针dcfh-da进行活性氧检测。
具体方法如下：培养hepg2细胞，接6孔板，接种密度在3-4×105/ml，等细胞贴壁后去血清化12h；换含血清的培养基继续培养3-6h后加newtectorigenin处理。newtectorigenin24h处理后收集细胞，加含血清的培养基终止消化，离心弃上清，加400ulpbs重新悬浮细胞；超声裂解40-60w，每次超3-4次，总共3次(在冰上操作；4度离心12000转，15min。加入试剂盒(二氯荧光黄活性氧检测试剂盒)的试剂，按说明书的方法用酶标仪测定每组的od值。
从图6的染色结果可以看出，newtectorigenin处理后的给药组染色相较对照组要深，且随着newtectorigenin浓度的加大，颜色逐渐变深面积更大，具有浓度效应。
试验8westernblot检测newtectorigenin对pi3k、akt、caspase-3、p53、bax、bcl-2蛋白表达的影响
上述实验结果表明，newtectorigenin对hepg2细胞的生长具有明显的抑制作用，为探究其凋亡的作用机制，发明人检测了给药后hepg2细胞内pi3k、akt、caspase-3、p53、bax、bcl-2蛋白表达。
具体方法如下：按上述加药方法相应处理hepg2细胞，连续培养48h后。在冰上操作，弃掉六孔板中的原培养液，用预冷的pbs清洗3次，每孔加入80μl裂解液(lysisbuffer)裂解细胞，用细胞刮刀往同一方向刮下贴壁细胞，分别将细胞收集到ep管中，置冰中于摇床上至少裂解30min。之后在13200rpm，4℃的条件下，离心10min，收集上清液。用考马斯亮蓝g-250法测定每组蛋白质的浓度，用可见分光光度计在595nm波长下测定吸光度，绘制蛋白标准曲线，分别计算每组蛋白质的浓度，根据蛋白浓度和加样蛋白量，计算加样蛋白体积。
将测定后的蛋白等量上样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)电泳。电泳结束后，将蛋白转膜到硝酸纤维膜(pvdf)上。用5％脱脂奶粉于摇床上封闭1h。用pi3k、akt、erk、p-erk(1:1000)等一抗置于冰上摇床孵育1h，置于4℃冰箱过夜。用tbs×1洗膜3次，每次5min，用goatanti-rabbit(1:1000)二抗于室温摇床慢速孵育1h，tbs×1洗膜5次，每次5min，再进行ecl检测，显影，定影，扫描观察。
实验结果如图7所示，首先，p53表达增加，将诱导hepg2细胞内凋亡因子caspase-3的表达，使细胞进入程序化死亡。同时，线粒体凋亡途径中的促凋亡蛋白bax表达水平上升，抑凋亡蛋白bcl-2表达水平下降，上述作用共同导致hepg2细胞凋亡。其次，如图8所示，newtectorigenin对pi3k、akt蛋白表达具有抑制作用，并具有浓度效应。活化的akt可以直接使前体凋亡蛋白磷酸化并产生短期效应以防止激活导致细胞死亡的凋亡途径。pi3k、akt表达减少，抑制hepg2细胞增殖。
试验9westernblot检测newtectorigenin对erk1/2蛋白表达的影响
为了进一步探究newtectorigenin抑制hepg2细胞增殖机制，发明人还检测了给药后hepg2细胞内erk和perk蛋白表达。
具体实验方法同试验8所述。
实验结果如图9所示，newtectorigenin对erk蛋白表达具有抑制作用，并具有浓度效应，ras/raf/mek/erk信号转导通路在细胞的生理过程如增殖、存活、分化、凋亡、运动和代谢方面发挥了至关重要的作用。erk表达减少，导致下游的相关蛋白也表达减少，hepg2细胞的生长增殖受抑制。
实施例5newtectorigenin对h22肝癌移植肿瘤的抑制作用
(1)异位移植
一、h22细胞复苏
从液氮中拿出装有h22细胞冻存管，在37℃的水浴中快速摇动，待冻存管中的冰块接近完全融化时，马上在无菌环境将已融化的冻存液转移到离心管中，1000rpm，25℃离心3min，弃上清液，用新配的培养液轻轻吹打散细胞，再转移到培养瓶当中并补加培养液到3ml，在37℃，5％co2饱和湿度的培养箱培养。
二、h22皮下移植瘤模型建立
待h22细胞长到对数期时，将h22细胞1000rpm，25℃离心3min，弃培养液，pbs洗三次，用pbs稀释为1x106。
于3只裸鼠腹腔注射0.2ml1x106h22细胞，饲养7天左右，饲养条件为：基础饲料，自由取食，空气湿度50±5％，温度20～25℃。
7天后无菌条件取小鼠乳白色腹水，pbs洗三次，pbs稀释为1x107。
每只裸鼠右前肢皮下注射约0.2ml无菌h22肝癌细胞悬液(含2.0×106个细胞),接种后每2d用尺测量瘤体最长径与最短径,计算肿瘤体积,
肿瘤长(l)和宽(w)
v＝1/2*lw2
4天后待肿瘤体积长至约0.2cm3后随机分为3组:分别为模型组，低浓度组(7mg/kg)，高浓度组(14mg/kg)。模型组每天以0.2ml的生理盐水灌胃，低浓度以0.2mll7mg/ml的newtectorigenin灌胃，低浓度以0.2ml14mg/ml的newtectorigenin灌胃。连续处理14天。
末次用药后第2天将裸鼠处死。分离肿瘤称质量，计算抑瘤率:抑瘤率(％)＝(对照组瘤质量-实验组瘤质量)/对照组瘤质量×100％。
裸鼠处死后取肿瘤组织与脏器。
三、肿瘤组织h&e染色
肿瘤组织取下后立即浸泡到10％甲醛溶液中，放置4℃下固定肿瘤组织24h，取大小约1cm×1cm×0.5cm的组织块，经常规脱水、透明、浸蜡后石蜡包埋。置于切片机上连续切片，切片厚度5μm，温水中展开于载玻片上，室温保存备用。通过7分钟苏木素染色液染色，用长流自来水缓慢冲洗多余的染色液，直至流出的水无色为止(约6分钟)，轻微甩干，再伊红染色液染色1分钟，再进行常规脱水、透明、中性树胶封片。在光学显微镜下进行病理形态学观察，并拍照。
四、免疫组化测肿瘤组织arg-1(精氨酸酶-1)、afp(甲胎蛋白)、ca125(糖蛋白)、gpc3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)表达量
取上述实验的石蜡包埋好的肿瘤组织，常规切片，再经常规脱蜡与脱水，用3％h2o2室温封闭10min，pbs洗涤3次；吸干水分，用山羊血清封闭液室温封闭20min；滴加一抗盖住组织，放4℃过夜；第二天放置至室温，pbs洗涤3次；滴加适当量链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温孵育1h，pbs洗涤3次；滴加dab显色，直至染色合适为止，pbs洗涤3次、苏木复染、1％盐酸酒精分化，脱水、中性树胶封片，显微镜下观察拍照。
五、elisa法测血液cea含量
严格按照试剂盒说明书进行。将所取血液在3000转，30分钟条件下离心，取上清。将标准品样按每个孔50μl加入，样本孔则按待测样本10μl，样本稀释液40μl加入，空白孔不加。将100μl检测抗体溶液加入到标准品孔与样本孔中，用封板膜封闭，放在37℃恒温箱中孵育60min。去除所有液体，在吸水纸上拍干，每孔加入1x洗涤液，放置1min，甩去洗涤液，并在吸水纸上拍干，重复5次。每孔加入底物a、b各50μl，37℃避光孵育15min。每孔加入反应终止液50μl，在450nm波长处测定各孔的od值。绘制标准曲线：浓度作横坐标，od值作纵坐标，绘制线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。
(2)原位移植
从液氮中拿出装有h22细胞冻存管，在37℃的水浴中快速摇动，待冻存管中的冰块接近完全融化时，马上在无菌环境将已融化的冻存液转移到离心管中，1000rpm，25℃离心3min，弃上清液，用新配的培养液轻轻吹打散细胞，再转移到培养瓶当中并补加培养液到3ml，在37℃，5％co2饱和湿度的培养箱培养。
待h22细胞长到对数期时，将h22细胞1000rpm，25℃离心3min，弃培养液，pbs洗三次，用pbs稀释为1x106。
于3只裸鼠腹腔注射0.2ml1x106h22细胞，饲养7天左右，饲养条件为：基础饲料，自由取食，空气湿度50±5％，温度20～25℃。
7天后无菌条件取小鼠乳白色腹水，pbs洗三次，pbs稀释为1x107。
以5％水合利醛0.1ml/10g的量进行小鼠腹腔麻醉，2-3min后，查看小鼠活动是否停止，但还有呼吸，待麻醉完全后，取仰卧位并固定四肢于实验板上，用10％硫化钠脱去体毛，73％乙醇消毒后，沿腹白线逐层开腹，暴露小鼠腹腔，轻压小鼠胸腔，肝脏便跳出腹腔，选取最接近体表的肝叶种植肿瘤。注射针头斜行进针，针尖与水平面呈20°，刺入肝脏约1cm左右，轻推注射器针芯，缓慢注入细胞悬液0.05ml，约106个h22个细胞。缓慢退针，并立即用灼红的铁丝轻轻灼烧针孔，再轻送肝脏还纳腹腔，逐层关腹。
(3)实验结果：
一、h22荷瘤小鼠肿瘤大小变化
如图10实验结果显示，接种第7天出现肉眼可见大小肿瘤，所有组从11天起肿瘤体积增长速率加大，从17天起模型肿瘤体积开始大幅度上升，但是newtectorigenin低浓度和高浓度组肿瘤体积增幅较模型组平缓，第21天肿瘤大小如图11，到26天所有组增幅趋于平缓。实验结束时，肿瘤大小见图12，低浓度和高浓度组平均瘤体积与模型组相比都具有显著性差异(p<0.05)，且高浓度效果比低浓度效果更好。因此初步显示newtectorigenin对h22荷瘤小鼠肿瘤具有显著的抑制作用。
二、newtectorigenin对h22荷瘤小鼠内脏指数及抑瘤率的影响
从表1可以看出，实验结束后，模型组小鼠较空白组小鼠脾指数显著升高(p<0.05)，而与模型组小鼠脾指数相比，低浓度和高浓度newtectorigenin脾指数显著降低(p<0.05)，而低、高浓度的newtectorigenin脾指数与空白组更接近。与模型组相比正常组、低、高浓度newtectorigenin组肝指数无明显差异，说明newtectorigenin对肝脏没有毒副作用。此外，低、高浓度newtectorigenin组小鼠肿瘤质量相比模型组显著降低(p<0.05)呈浓度依赖效应。以上结果说明，newtectorigenin不仅能显著抑制小鼠肿瘤的生长，还对免疫器官具有一定的保护作用。
表1newtectorigenin对h22小鼠脏器指数与抑瘤率的影响
注：x±s，n＝4，与模型组比较，*p＜0.05。
三、h22荷瘤小鼠cea含量的变化
cea(carcinoembryonicantigen)癌胚抗原，癌胚抗原是一个广谱性肿瘤标志物，它能反映出多种肿瘤的存在。实验结果显示出(表2)，模型组、低浓度组与高浓度组cea含量相对于空白组显著性升高(p<0.05)，低浓度组与高浓度组相对于模型组cea含量显著降低(p<0.05)，证明newtectorigenin能通过减少cea的生成来抑制h22荷瘤小鼠肿瘤的生长，且高浓度组降低的幅度比低浓度组大(p<0.05)，呈浓度依赖效应。
表2newtectorigenin对h22小鼠cea含量的影响
注：x±s,n＝4，与模型组比较，*p＜0.05。
四、h22荷瘤小鼠肿瘤组织h&e染色
由图13可以看出，模型组肿瘤细胞整体排列整齐，细胞之间空隙较小，细胞形态正常细胞核清晰完整，且细胞间质内新生毛细血管丰富，而与模型组相比，newtectorigenin低浓度组细胞较为稀疏，出现大小不一，细胞膜破损，细胞核皱缩的呈现典型凋亡特征的细胞，newtectorigenin高浓度组出现凋亡细胞的面积增加，肿瘤组织更为松散，毛细血管数量减少。结果说明newtectorigenin具有明显抑制肿瘤血管生长与诱导肿瘤凋亡作用，且高浓度浓度抑制效果与低浓度相比具有明显差异，呈现一定的剂量依赖效应。
五、免疫组化测h22荷瘤小鼠肿瘤组织arg-1、afp、ca125、gpc3表达量
用免疫组化的方法进一步检测肝癌标志物arg-1在各组h22荷瘤小鼠肿瘤组织中的表达。sabc(streptavidin-biotincomplex)，即链霉亲和素-生物素复合物，是免疫组化染色方法之一，阳性细胞表现为细胞内出现棕黄色物质。如图14所示，arg-1在细胞质与细胞核中均有表达，模型组棕黄色区域较少，阳性细胞较少，arg-1表达较低，newtectorigenin低浓度与高浓度组中arg-1则表达较高。而afp、ca125、gpc3的模型组阳性区域面积比newtectorigenin低浓度与高浓度高，且高浓度比低浓度阳性区域要低，具有一定的剂量效应。以上结果表明newtectorigenin能增加肿瘤细胞内arg-1的表达，并降低afp、ca125、gpc3的表达。
肝癌实体动物模型是探讨临床前抗肝癌药物药效与开发的重要途径，高效且准确，能促进实验室成果的转化。而newtectorigenin作为新抗肝癌药物，还未探讨其在抑制实体动物肝癌模型的作用。
本实施例通过培养h22细胞，以1×106个细胞/ml，0.2ml的量注射到裸鼠的腹腔，7天后取裸鼠腹水，pbs洗3次，用pbs稀释为1×107个细胞/ml，以0.2ml的量注射到裸鼠鼠的右前肢皮下，待裸鼠右前肢长出肉眼可见的肿瘤，将肿瘤长势与大小相同的小鼠随机分成3组，分别为模型组，低浓度组(7mg/kg)，高浓度组(14mg/kg)，模型组每天以0.2ml的生理盐水灌胃，低浓度以0.2ml7mg/ml的newtectorigenin灌胃，低浓度以0.2ml14mg/ml的newtectorigenin灌胃。以上述方法灌胃14天后，断颈法处死，剥取肿瘤，10％甲醛溶液保存，2天内进行石蜡切片。再进行h&e染色与组织免疫染色显微观察。
对各组肿瘤大小的分析，发现随着newtectorigenin浓度的增大，小鼠肝癌肿瘤的大小减小。h&e染色发现随着newtectorigenin浓度的增大出现凋亡细胞的面积增加。而血液cea检测发现newtectorigenin能减少cea的生成。免疫组织染色发现newtectorigenin能增加肿瘤细胞内arg-1的表达，并降低afp、ca125、gpc3的表达。因此，newtectorigenin能显著抑制h22肝癌移植肿瘤的增殖，对抗肝癌药物的开发具有重要的意义。
实施例6newtectorigenin对hepa1-6肝癌移植肿瘤的抑制作用
(1)异位移植
一、hepa1-6细胞复苏
从液氮中拿出装有hepa1-6细胞冻存管，在37℃的水浴中快速摇动，待冻存管中的冰块接近完全融化时，马上在无菌环境将已融化的冻存液转移到离心管中，1000rpm，25℃离心3min，弃上清液，用新配的培养液轻轻吹打散细胞，再转移到培养瓶当中并补加培养液到3ml，在37℃，5％co2饱和湿度的培养箱培养。
二、hepa1-6皮下移植瘤模型建立
待hepa1-6细胞长到对数期时，将hepa1-6细胞1000rpm，25℃离心3min，弃培养液，pbs洗三次，用pbs稀释为1x106。
于3只裸鼠腹腔注射0.2ml1x106hepa1-6细胞，饲养7天左右，饲养条件为：基础饲料，自由取食，空气湿度50±5％，温度20～25℃。
7天后无菌条件取小鼠乳白色腹水，pbs洗三次，pbs稀释为1x107。
每只裸鼠右前肢皮下注射约0.2ml无菌hepa1-6肝癌细胞悬液(含2.0×106个细胞),接种后每2d用尺测量瘤体最长径与最短径,计算肿瘤体积,
肿瘤长(l)和宽(w)
v＝1/2*lw2
4天后待肿瘤体积长至约0.2cm3后随机分为3组:分别为模型组，低浓度组(7mg/kg)，高浓度组(14mg/kg)。模型组每天以0.2ml的生理盐水灌胃，低浓度以0.2mll7mg/ml的newtectorigenin灌胃，低浓度以0.2ml14mg/ml的newtectorigenin灌胃。连续处理14天。
末次用药后第2天将裸鼠处死。分离肿瘤称质量,计算抑瘤率:抑瘤率(％)＝(对照组瘤质量-实验组瘤质量)/对照组瘤质量×100％。
裸鼠处死后取肿瘤组织与脏器。
三、肿瘤组织h&e染色
肿瘤组织取下后立即浸泡到10％甲醛溶液中，放置4℃下固定肿瘤组织24h，取大小约1cm×1cm×0.5cm的组织块，经常规脱水、透明、浸蜡后石蜡包埋。置于切片机上连续切片，切片厚度5μm，温水中展开于载玻片上，室温保存备用。通过7分钟苏木素染色液染色，用长流自来水缓慢冲洗多余的染色液，直至流出的水无色为止(约6分钟)，轻微甩干，再伊红染色液染色1分钟，再进行常规脱水、透明、中性树胶封片。在光学显微镜下进行病理形态学观察，并拍照。
四、免疫组化测肿瘤组织arg-1(精氨酸酶-1)、afp(甲胎蛋白)、ca125(糖蛋白)、gpc3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)表达量
取上述实验的石蜡包埋好的肿瘤组织，常规切片，再经常规脱蜡与脱水，用3％h2o2室温封闭10min，pbs洗涤3次；吸干水分，用山羊血清封闭液室温封闭20min；滴加一抗盖住组织，放4℃过夜；第二天放置至室温，pbs洗涤3次；滴加适当量链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温孵育1h，pbs洗涤3次；滴加dab显色，直至染色合适为止，pbs洗涤3次、苏木复染、1％盐酸酒精分化，脱水、中性树胶封片，显微镜下观察拍照。
五、elisa法测血液cea含量
严格按照试剂盒说明书进行。将所取血液在3000转，30分钟条件下离心，取上清。将标准品样按每个孔50μl加入，样本孔则按待测样本10μl，样本稀释液40μl加入，空白孔不加。将100μl检测抗体溶液加入到标准品孔与样本孔中，用封板膜封闭，放在37℃恒温箱中孵育60min。去除所有液体，在吸水纸上拍干，每孔加入1x洗涤液，放置1min，甩去洗涤液，并在吸水纸上拍干，重复5次。每孔加入底物a、b各50μl，37℃避光孵育15min。每孔加入反应终止液50μl，在450nm波长处测定各孔的od值。绘制标准曲线：浓度作横坐标，od值作纵坐标，绘制线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。
(2)原位移植
从液氮中拿出装有hepa1-6细胞冻存管，在37℃的水浴中快速摇动，待冻存管中的冰块接近完全融化时，马上在无菌环境将已融化的冻存液转移到离心管中，1000rpm，25℃离心3min，弃上清液，用新配的培养液轻轻吹打散细胞，再转移到培养瓶当中并补加培养液到3ml，在37℃，5％co2饱和湿度的培养箱培养。
待hepa1-6细胞长到对数期时，将hepa1-6细胞1000rpm，25℃离心3min，弃培养液，pbs洗三次，用pbs稀释为1x106。
于3只裸鼠腹腔注射0.2ml1x106hepa1-6细胞，饲养7天左右，饲养条件为：基础饲料，自由取食，空气湿度50±5％，温度20～25℃。
7天后无菌条件取小鼠乳白色腹水，pbs洗三次，pbs稀释为1x107。
以5％水合利醛0.1ml/10g的量进行小鼠腹腔麻醉，2-3min后，查看小鼠活动是否停止，但还有呼吸，待麻醉完全后，取仰卧位并固定四肢于实验板上，用10％硫化钠脱去体毛，73％乙醇消毒后，沿腹白线逐层开腹，暴露小鼠腹腔，轻压小鼠胸腔，肝脏便跳出腹腔，选取最接近体表的肝叶种植肿瘤。注射针头斜行进针，针尖与水平面呈20°，刺入肝脏约1cm左右，轻推注射器针芯，缓慢注入细胞悬液0.05ml，约106个hepa1-6个细胞。缓慢退针，并立即用灼红的铁丝轻轻灼烧针孔，再轻送肝脏还纳腹腔，逐层关腹。
(3)实验结果：
一、hepa1-6荷瘤小鼠模型
实验结果如图15、16显示，实验结束时，newtectorigenin低浓度与高浓度肿瘤体积较模型组的小(p<0.05)。因此初步显示newtectorigenin同样对hepa1-6荷瘤小鼠肿瘤具有抑制作用。
二、newtectorigenin对hepa1-6荷瘤小鼠的抑瘤率
从表3和图17可以看出，newtectorigenin低浓度组与高浓度组肿瘤质量明显比模型组的轻(p<0.05)，抑瘤率达到43.97％与70.07％，具有统计学意义。因此，newtectorigenin能显著抑制hepa1-6荷瘤小鼠肿瘤的生长。
表3newtectorigenin对hepa1-6小鼠抑瘤率的影响
注：x±s，n＝4，与模型组比较，*p＜0.05。
三、hepa1-6荷瘤小鼠cea含量的变化
如表4所示，与空白组相比模型组cea含量显著升高(p<0.05)、newtectorigenin低浓度组与高浓度组cea含量比模型组低，低浓度组cea含量与模型组没有显著性差异，但高浓度组cea含量与模型组比，具有显著性差异(p<0.05)。这说明newtectorigenin同样能通过减少cea的生成来抑制hepa1-6荷瘤小鼠肿瘤的生长。
表4newtectorigenin对hepa1-6小鼠cea含量的影响
注：x±s,n＝4，与模型组比较，*p＜0.05。
四、hepa1-6荷瘤小鼠肿瘤组织h&e染色
如图18所示，模型组肿瘤组织细胞完整，细胞核清晰可见，排列紧密。而newtectorigenin低浓度组与高浓度组可见一定坏死区域，坏死区域细胞松散，染色较浅。这表明newtectorigenin对hepa1-6荷瘤小鼠肿瘤组织细胞具有一定抑制作用。
五、免疫组化测hepa1-6荷瘤小鼠肿瘤组织arg-1、afp、ca125、gpc3表达量
从图19可以看出，arg-1模型组棕黄色阳性区域较newtectorigenin低浓度组与高浓度组的要小，而高浓度阳性区域明显比低浓度的要大，具有一定的剂量依赖效应。而ca125模型组阳性区域比低浓度与高浓度的都要大，阳性细胞较多，具有明显差异。但低浓度与高浓度无明显差异。afp与gpc3模型组与低浓度、高浓度组比较，阳性细胞明显增多。因此newtectorigenin能上调arg-1的表达，抑制afp、ca125、gpc3的表达。
肝癌实体动物模型是探讨临床前抗肝癌药物药效与开发的重要途径，高效且准确，能促进实验室成果的转化。而newtectorigenin作为新抗肝癌药物，还未探讨其在抑制实体动物肝癌模型的作用。
本实施例通过培养hepa1-6细胞，以1×106个细胞/ml，0.2ml的量注射到裸鼠的腹腔，7天后取裸鼠腹水，pbs洗3次，用pbs稀释为1×107个细胞/ml，以0.2ml的量注射到裸鼠鼠的右前肢皮下，待裸鼠右前肢长出肉眼可见的肿瘤，将肿瘤长势与大小相同的小鼠随机分成3组，分别为模型组，低浓度组(7mg/kg)，高浓度组(14mg/kg)，模型组每天以0.2ml的生理盐水灌胃，低浓度以0.2ml7mg/ml的newtectorigenin灌胃，低浓度以0.2ml14mg/ml的newtectorigenin灌胃。以上述方法灌胃14天后，断颈法处死，剥取肿瘤，10％甲醛溶液保存，2天内进行石蜡切片。再进行h&e染色与组织免疫染色显微观察。
对各组肿瘤大小的分析，发现随着newtectorigenin浓度的增大，小鼠肝癌肿瘤的大小减小。h&e染色发现随着newtectorigenin浓度的增大出现凋亡细胞的面积增加。而血液cea检测发现newtectorigenin能减少cea的生成。免疫组织染色发现newtectorigenin能增加肿瘤细胞内arg-1的表达，并降低afp、ca125、gpc3的表达。因此，newtectorigenin能显著抑制hepa1-6肝癌移植肿瘤的增殖，对抗肝癌药物的开发具有重要的意义。
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