本发明涉及化学药物技术领域，进一步涉及物质的新的医药用途，具体涉及奥美拉唑用于制备肝癌干细胞抑制剂的应用。
背景技术：
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下它可以分化成成为多种功能细胞。干细胞由于其增殖和分化的特性在细胞替代和组织再生治疗方面中被寄予厚望，不仅可以用于神经退行性病变、糖尿病等由明确细胞类型病变所致的疾病治疗，还能够通过组织工程和器官再造技术用于组织修复和器官移植，及新药开发、基因治疗、免疫调控治疗等领域。癌干细胞又称为肿瘤干细胞，是指具有干细胞性质的癌细胞，也就是具有自我复制以及具有多细胞分化等能力。通常这类的细胞被认为有形成肿瘤，发展成癌症的潜力，特别是随着癌症转移后，产生新型癌症的来源。癌干细胞存在于癌细胞中，是癌症复发和转移的元凶。由于存在数量极少，因此很难被发现，抗癌药物也很难对其产生效果。
现有技术研究认为，在慢性肝病介导下或肝细胞的再生过程中，正常肝干细胞的基因表达及遗传调控发生异常而导致肝癌干细胞(lcsc)产生；此外，肝细胞所处微环境的改变，导致正常肝脏细胞脱分化也是产生肝癌干细胞的因素之一。lcsc关系到肝癌起病、进展及治疗的预后，因此对肝癌干细胞的靶向抑制作用对癌症病情的延缓具有积极作用。
奥美拉唑，5-甲氧基-2-[[(4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基]亚磺酰基]-1h-苯并咪唑，为质子泵抑制剂，是一种脂溶性弱碱性药物。现有技术研究发现，奥美拉唑易浓集于酸性环境中，特异性地作用于胃黏膜壁细胞顶端膜构成的分泌性微管和胞质内的管状泡上，即胃壁细胞质子泵(h+，k+-atp酶)所在部位，并转化为亚磺酰胺的活性形式，通过二硫键与质子泵的巯基发生不可逆行的结合，从而抑制h+，k+-atp酶的活性，阻断胃酸分泌的最后步骤，使壁细胞内的h+不能转运到胃腔中，使胃液中的酸含量大为减少。对基础胃酸和刺激引起的胃酸分泌都有很强的抑制作用。对组胺、五肽胃泌素及刺激迷走神经引起的胃酸分泌有明显的抑制作用，对h2受体拮抗剂不能抑制的由二丁基环腺苷酸引起的胃酸分泌也有强而持久的抑制作用。目前的医疗实践中，奥美拉唑主要用于十二指肠溃疡和卓-艾综合征，也可用于胃溃疡和反流性食管炎；静脉注射可用于消化性溃疡急性出血的治疗。现有技术认为奥美拉唑并不具有肿瘤抑制作用。
技术实现要素：
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供奥美拉唑用于制备肝癌干细胞抑制剂的应用，以解决现有技术中缺乏一种针对肝癌干细胞抑制药物的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是如何实现对肝脏肿瘤的治疗。
本发明要解决的再一技术问题是如何拓展奥美拉唑的医药用途范围。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
本发明首先提供了奥美拉唑用于制备肝癌干细胞抑制剂的应用。
作为以上技术方案的一种优选技术方案，所述肝癌干细胞抑制剂同时缓解肝脏肿瘤患者的氧化性损伤。
作为以上技术方案的一种优选技术方案，所述肝癌干细胞抑制剂同时降低肿瘤患者肝脏组织中sod、gsh-px、cat活性。
作为以上技术方案的一种优选技术方案，所述肝癌干细胞抑制剂同时降低肿瘤患者肝脏组织中谷草转氨酶、谷丙转氨酶含量。
作为以上技术方案的一种优选技术方案，所述肝癌干细胞抑制剂抑制肝癌干细胞的生长或分化。
作为以上技术方案的一种优选技术方案，所述肝癌干细胞抑制剂还包括以下成分：儿茶素，硫酸巴龙霉素，利巴韦林。
作为以上技术方案的一种优选技术方案，在所述肝癌干细胞抑制剂中奥美拉唑，儿茶素，硫酸巴龙霉素，利巴韦林四者的质量比为23:1:3:8。
作为以上技术方案的一种优选技术方案，所述肝癌干细胞抑制剂还包括pi3k抑制剂zstk474，奥美拉唑与所述zstk474的质量比为23:11。
作为以上技术方案的一种优选技术方案，所述肝癌干细胞抑制剂同时降低细胞因子il-1β、il-6、tnf-α的表达量。
作为以上技术方案的一种优选技术方案，所述肝癌干细胞抑制剂的剂型为口服剂。
本发明提供了奥美拉唑用于制备肝癌干细胞抑制剂的应用。该技术方案取hepg2细胞作为肝癌细胞系，以cd133作为分子标记进行了细胞分选，从而得到lcsc细胞；同时，以实验动物构建了移植瘤模型。基于以上实验对象，本发明考察奥美拉唑对肝癌干细胞的抑制作用，实验结果表明，应用奥美拉唑能直接抑制lcsc细胞的增殖，并降低实体肿瘤的增殖速率；此外，奥美拉唑对伴随肿瘤所发生的氧化损伤和炎性损伤具有缓解作用，有助于肝功能的恢复；另外，通过对比实验发现，含有奥美拉唑的肝癌干细胞抑制剂对lcsc细胞的抑制作用具有一定的靶向性，对普通肝癌细胞的抑制作用相对较弱。而且，本发明还发现，在添加了儿茶素，硫酸巴龙霉素，利巴韦林等成分的情况下能对该抑制剂起到一定程度的增效作用。基于以上有益的发现，本发明确定了利用奥美拉唑制备肝癌干细胞抑制剂的应用，从而为肝脏肿瘤的治疗提供了一种新途径，同时拓展了奥美拉唑的医药用途范围。
附图说明
图1是本发明实施例3中肝癌干细胞抑制剂对lcsc以及实体肿瘤的抑制实验结果；图中，a部分是对lcsc细胞的生长抑制作用；b部分是对实体肿瘤的增殖抑制作用；s0是空白对照组；s1是实施例1所提供的肝癌干细胞抑制剂的药效结果；s2是实施例2所提供的肝癌干细胞抑制剂的药效结果。
图2是本发明实施例3中肝癌干细胞抑制剂对肿瘤所致氧化性损伤的缓解作用实验结果；图中，s0是空白对照组；s1是实施例1所提供的肝癌干细胞抑制剂对3种氧化性因子活力的抑制作用；是实施例2所提供的肝癌干细胞抑制剂对3种氧化性因子活力的抑制作用；
图3是本发明实施例3中肝癌干细胞抑制剂对患癌动物肝脏谷丙转氨酶和谷草转氨酶活力的影响；图中，s0是空白对照组；s1是实施例1所提供的肝癌干细胞抑制剂的药效结果；s2是实施例2所提供的肝癌干细胞抑制剂的药效结果。
图4是本发明实施例3中肝癌干细胞抑制剂对患癌动物肝脏炎性细胞因子的抑制作用实验结果；图中，s0是空白对照组；s1是实施例1所提供的肝癌干细胞抑制剂的药效结果；s2是实施例2所提供的肝癌干细胞抑制剂的药效结果。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
实施例1
一种肝癌干细胞抑制剂，其中含有奥美拉唑；该肝癌干细胞抑制剂的有效浓度以其中奥美拉唑的浓度来评价，奥美拉唑的有效浓度为0.2mg/ml。该肝癌干细胞抑制剂的制备方法如下：取淀粉1100g与400g水制成淀粉浆，向该淀粉浆中加入奥美拉唑230g混匀，而后制粒，过筛，干燥，装胶囊。
实施例2
一种肝癌干细胞抑制剂，其中含有奥美拉唑，儿茶素，硫酸巴龙霉素，利巴韦林，所述奥美拉唑，儿茶素，硫酸巴龙霉素，利巴韦林四者的质量比为23:1:3:8。该肝癌干细胞抑制剂的有效浓度以其中奥美拉唑的浓度来评价，奥美拉唑的有效浓度为0.2mg/ml。该肝癌干细胞抑制剂的制备方法如下：取淀粉1100g与400g水制成淀粉浆，向该淀粉浆中加入奥美拉唑230g、儿茶素10g、硫酸巴龙霉素30g、利巴韦林80g混匀，而后制粒，过筛，干燥，装胶囊。
实施例3
本实施例用于考察以上实施例所提供的肝癌干细胞抑制剂对肝癌干细胞以及肝脏实体肿瘤的生长抑制作用。
1、材料与试剂
细胞培养基(dmem)和胎牛血清购自invitrogen公司；taq酶(hotstartversion)和dntps购自takara公司；去脂蛋白血清(lpds)以胎牛血清为原料，通过超速离心方法制备。
人肝母细胞瘤细胞株hepg2和人肝癌细胞株huh7购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所，用含10％胎牛血清的dulbecco'smodifiedeagle'smedium(dmem)培养基培养。培养基都加入100u/ml的氨苄青霉素和100μg/ml链霉素，细胞均在37℃、5％co2条件下培养。实验用培养基为含5％lpds的dmem培养基。
肝癌和癌旁组织及正常肝组织取自进行外科手术治疗的肝癌病人或肝移植志愿者。
2、肝癌干细胞的分选
取人肝癌细胞系hepg2细胞，用添加10％胎牛血清、1％双抗的dmem培养基于5％co2培养箱中37℃培养。将培养至指数期的hepg2细胞用胰酶消化后，再用含20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、20ng/ml表皮生长因子、10ng/ml肝生长因子、b27、1％甲基纤维素和1％双抗的dmem/f12培养基重悬，将细胞悬液以2000细胞/ml种入低黏附的12孔板，于5％co2培养箱中37℃培养。10～15天形成直径200μm左右微囊球。获得富集的肿瘤干细胞模型。
用流式细胞分选仪对细胞进行流式细胞分选。肝癌细胞首先用抗cd133单克隆抗体进行标记，然后经pbs洗涤并重悬于含2％胎牛血清的pbs中等待分选。分别将前20％表达cd133最强的细胞框选为cd133+的肝癌干细胞，将后20％表达cd133最弱的细胞框选为cd133-的非肝癌干细胞。用cd133细胞分选试剂盒对细胞进行磁珠分选。分选出的细胞纯度用流式细胞仪鉴定。
3、细胞生长实验
将肝癌干细胞接种于96孔板中，在细胞贴壁24小时后，将细胞培养基换成rpmi，同时加入实施例1、实施例2所提供的肝癌干细胞抑制剂混合物培养72小时后，细胞数目用cellcountingkitcck8试剂盒进行测定。
实验结果如图1所示，相较于空白对照，实施例1、实施例2所提供的肝癌干细胞抑制剂能显著抑制lcsc细胞增殖，同时，以动物构建的移植瘤模型作为实验对象，无论实施例1或实施例2所提供的肝癌干细胞抑制剂均能降低实体肿瘤的增重速率，而且，对实体肿瘤重量的抑制率与对lcsc细胞增殖速率的抑制率具有一定的相关性。此外，s2组实验结果明显优于s1组实验结果，从而验证表明，与当成分的奥美拉唑相比，采用奥美拉唑、儿茶素、硫酸巴龙霉素、利巴韦林四者联用对肝癌干细胞具有更加显著的生长抑制作用；对细胞增殖速率的抑制率达到41.2％，对实体肿瘤重量的抑制率达到32.7％。
4、肝组织中损伤性指标的测定
以动物构建的移植瘤模型作为实验对象，检测肝脏肿瘤对其氧化损伤因子活性的影响，进而考察本发明所提供的肝癌干细胞抑制剂对其缓解作用。其中，超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)活性，以及谷草转氨酶(ast)含量、谷丙转氨酶(alt)含量均采用相应试剂盒测定。按试剂盒说明书上的操作步骤进行检测和计算。实验结果如图2、图3所示，由图2可以发现，应用本发明所提供的肝癌干细胞抑制剂可对包括sod、cat、gsh-px在内的氧化性损伤因子活力起到一定的抑制作用，从而有助于缓解伴随肿瘤所产生的氧化性损伤；而在奥美拉唑的基础上进一步添加儿茶素、硫酸巴龙霉素、利巴韦林则对这一抑制作用具有促进效应。由图3可以发现，应用实施例1、实施例2所提供的肝癌干细胞抑制剂，对患癌动物谷草转氨酶、谷丙转氨酶的升高现象能起到一定的抑制作用，这表明服用本发明的肝癌干细胞抑制剂能对实验动物肝功能的恢复起到积极作用。
5、肝组织中免疫指标的测定
用预冷的生理盐水或者pbs(0.01m，ph7.0-7.4)冲洗组织，去除残余血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的pbs(一般按照1：9的重量体积比)加入组织匀浆器中，于冰上充分研磨，最后将匀浆液于4000×g离心15min，取上清检测。上清液可分装保存-80℃备用。免疫功能指标：il-1β、il-6、tnf-α；均采用酶联免疫吸附法(elisa)试剂盒检测。按照说明书上的操作步骤进行检测和计算。
实验结果如图4所示，奥美拉唑对患癌动物肝脏中包括il-1β、il-6、tnf-α在内的促炎性细胞因子具有抑制作用，这种抑制作用在实验条件一定的情况下稳定均一，这表明奥美拉唑不仅对lcsc细胞具有抑制作用，同时能缓解伴随肝癌所产生的炎性损伤。此外，值得注意的是，上述抑制作用不会因儿茶素、硫酸巴龙霉素、利巴韦林等物质的联用而加强，部分实验结果甚至产生了负面影响。
6、肝癌干细胞抑制剂对lcsc的特异性杀伤作用
1)体外杀伤实验
将1×105个经分选的lcsc细胞以及未经分选的普通肝癌细胞先用200nmcfse染色，经pbs洗涤后，接入96孔u型板中，然后，将实施例1、实施例2所提供的肝癌干细胞抑制剂按照奥美拉唑浓度为0.2mg/ml的用量加于孔内。另设一孔空白对照，用于检测lcsc细胞的自发凋亡。共同孵育5h洗涤后，加入10μg/ml的pi孵育20min，最后在fc500流式细胞仪中检测杀伤效果。实验结果表明，应用含有奥美拉唑的lcsc抑制剂，对经分选的lcsc细胞的增殖抑制作用是对未经分选的普通肝癌细胞增殖抑制作用的6.3～9.2倍；这表明虽然该抑制剂对普通肝癌细胞和肝癌干细胞均具有抑制作用，但对lcsc细胞的抑制作用明显强于前者，表现出了一定的靶向性和专一性。
2)体内杀伤实验
2×106经分选的lcsc细胞与0.2mg/ml的上述肝癌干细胞抑制剂混合后，种植于裸鼠皮下，对照组只单独注射lcsc细胞。每两天测量肿瘤大小，49天后处死所有裸鼠，取出移植瘤称重。实验结果表明，在奥美拉唑的干预下，肿瘤增重速率得到明显抑制，这一实验结果与以上第3节的实验结果相一致。
综上所述，本发明基于实验手段发现，应用奥美拉唑能直接抑制lcsc细胞的增殖，并降低实体肿瘤的增殖速率；此外，奥美拉唑对伴随肿瘤所发生的氧化损伤和炎性损伤具有缓解作用，有助于肝功能的恢复；另外，通过对比实验发现，含有奥美拉唑的肝癌干细胞抑制剂对lcsc细胞的抑制作用具有一定的靶向性，对普通肝癌细胞的抑制作用相对较弱。而且，本发明还发现，在添加了儿茶素，硫酸巴龙霉素，利巴韦林等成分的情况下能对该抑制剂起到一定程度的增效作用。基于以上有益的发现，本发明确定了利用奥美拉唑制备肝癌干细胞抑制剂的应用，从而为肝脏肿瘤的治疗提供了一种新途径，同时拓展了奥美拉唑的医药用途范围。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。