一种脑缺血靶向纳米递药系统的制备方法及用途与流程

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种脑缺血靶向纳米递药系统的制备方法及用途。

背景技术

丹参酮iia（tanshinoneiia，tsiia）又称为丹参醌iia，是丹参提取物中的主要化学成分之一，分子式c19h18o3，难溶于水，易溶于有机溶剂（比如丙酮、乙醇）中，丹参酮iia化学性质非常活泼，在体内容易发生多种生物化学反应，有良好的生物活性【李玉萍,顾兵,刘建涛,熊向源,周春丽,吴光杰.丹参酮iia的研究进展[j].时珍国医国药,2010,07:1770-1772】，其结构式如下：

研究表明，丹参酮iia具有广泛的药理作用，除具有传统的活血调经、祛瘀止痛、养心安神之功效外，还具有抗氧化、抗菌消炎、降低血液粘度、抑制凝血、促进纤溶、抑制血小板聚集、保护肝脏、抗肿瘤、调节机体免疫功能等作用【张民,张骅,徐鹏,苏仁意.丹参酮ⅱa的药理作用研究进展[j].医药导报,2008,(10):1237-1239】。并且近年来实验证明，丹参酮iia对于缺血缺氧引起的大脑中枢神经系统损伤，具有抗炎、延长血栓形成及促进血栓溶解、保护神经细胞、抑制细胞凋亡、抗氧化及清除氧自由基的作用，可以用来治疗脑缺血等疾病【李德川,鲍秀琦,孙华,张丹.丹参酮ⅱa对缺血性脑中风的神经保护作用研究进展[j].药学学报,2015,(06):635-639】。

由于丹参酮iia在化学结构上属于醌类化合物，难溶于水、体内半衰期短、生物利用度低、跨越血脑屏障的渗透性差、作用病变组织的靶向位点不明确等问题，限制了丹参酮iia在临床医学上的应用。目前，临床应用主要是对丹参酮iia进行磺酸化反应，转化为丹参酮iia磺酸钠注射液，但是丹参酮iia的利用率不高，而且反复给药对正常器官组织的副作用较大，容易产生抗药性，大幅度降低了丹参酮iia的治疗效果。

聚酰胺-胺树枝状大分子聚合物(polyamidoaminedendrimer,pamam)是当前广泛应用的一类树枝状高分子材料，直径范围1～16nm，内部具有空腔，表面活性氨基密度适中，结构较松散，适于包封或化学偶联药物，具有稳定、对生物活性物质转运效率高等优点，作为靶向递药载体具有独特的优越性：①分子结构中拥有巨大的空腔，可包载大量药物；②具有纳米级别的粒径且脂溶性高，可以更容易的穿过细胞膜和血脑屏障；③经peg修饰后可显著降低整代产物的细胞毒性，可被生物降解且降解产物无毒性；④包载药物，增加药物在体内的滞留时间，并且能够有效控制药物的释放；⑤pamam表面具有可被修饰的氨基基团，通过修饰引入疏水基团或靶向配体、抗体等，可提高生物的主动靶向性、生物相容性和生物利用度。因此，pamam树状大分子成为高分子药物载体研究的热点。

随着pamam代数的增加，容易引起一定的细胞毒性和溶血毒性，所以利用亲水性好的聚乙二醇（peg）对pamam进行修饰可以达到降低毒性、提高生物相容性的效果；而且利用靶向配体对pamam进行修饰，可提高其主动靶向性。t7肽是一类通过噬菌体展示技术筛选出来的短肽，其分子量小，当作为靶向头基时空间位阻小，具有稳定的化学性质，免疫原性小，结合位点明确，容易利用化学合成的方法得到，其作为特异性的靶向分子来修饰纳米粒药物载体，能提高pamam的靶向效果。

研究发现，转铁蛋白(transferrin,tf)受体在血脑屏障（bloodbrainbarrier，bbb）表面的表达显著高于正常脑细胞。但是机体的内源性tf浓度高，竟争抑制tf修饰的纳米药物递释系统的靶向转运。近期发现，通过细菌展示肽技术得到的一种新型多肽-t7肽(序列chaiyprh)，能够与转铁蛋白受体（transferrinreceptor，tfr）特异性结合,结合常数高达10nmol·l^-1,并且由于结合位点的不同,内源性tf不会抑制反而会促进t7修饰的纳米粒与tfr特异性结合【袁端锋,宗太丽,高会乐,何勤.穿膜肽tat和脑肿瘤靶向肽t7双修饰脂质体的制备和体外靶向性评价[j].药学学报,2015,(01):104-110】。此外，t7为小分子多肽，可化学合成，稳定性好，作为靶向头基空间位阻小，临床应用前景好。

技术实现要素：

本发明的目的是为弥补传统药物传送体系的不足，提供一种脑缺血靶向纳米递药系统的制备方法及用途，既解决了抗脑缺血性药物，如丹参酮iia等药物分子水溶性差、生物利用度低、跨越血脑屏障的渗透性差等问题，同时利用纳米载体表面的t7肽与血脑屏障表面的受体通过胞吞作用，提高纳米载体跨越血脑屏障的效率和药物的生物利用度，降低药物的毒副作用，提高药物的生物利用度。

本发明采用聚酰胺-胺（pamam）树枝状大分子聚合物为基础药物载体，以小分子多肽-t7肽作为脑靶向头基，采用双官能团的聚乙二醇（peg）对pamam表面修饰，既有利于后续靶向多肽-t7肽的修饰，也有利于中和阳离子树状大分子（pamam）表面的正电性，以降低其毒性，最后通过物理包埋的方式包载治疗脑缺血药物，构建脑靶向纳米递药系统。

为了达到以上目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供的一种脑缺血靶向纳米递药系统的制备方法及用途，主要是由靶向多肽、双功能聚乙二醇nhs-peg-mal、高分子聚合物材料和抗脑缺血药物组成。其中所述的高分子聚合物材料与聚乙二醇(nhs-peg-mal)的摩尔比为1:5~1:20；所述的高分子聚合物材料与多肽的摩尔比为1:2~1:6；所述的高分子聚合物材料与抗脑缺血药物的质量比为1:2~1:30。

本发明中所述的高分子聚合物材料为3.0代~5.0代的聚酰胺-胺（pamam）树枝状分子；所述的靶向多肽为t7肽,序列为chaiyprh；所述的聚乙二醇分子链两端分别用马来酰亚胺（mal）和琥珀酰亚胺（nhs）基团修饰，分子量为2500~3400；所述的抗脑缺血药物为丹参酮iia、灯盏花乙素、三七皂苷、白藜芦醇苷、红景天苷等，纯度为98%。

本发明所提供的一种脑缺血靶向纳米递药系统的制备方法，其包括以下步骤：

（1）将第5代的pamam和nhs-peg-mal按摩比1:5~1:20溶于ph=7.4~8.5的磷酸缓冲溶液(pbs)中，室温下遮光搅拌反应2小时，使pamam表面的氨基与nhs-peg-mal的末端琥珀酰亚胺基团发生特异性反应；

（2）将反应后的溶液转移到超滤管（mw10kda），转数7000~10000r/min离心10~15min，每次用超纯水替换，用薄层色谱法一直检测到反应后溶液中无游离的peg，然后冷冻干燥得到peg-pamam；

（3）将冻干好的peg-pamam与t7肽按摩尔比为1:2~1:6溶于ph=7.0~7.4的pbs溶液中，室温下遮光反应24小时，将反应后的混合溶液转移到超滤管（mw10kda），转数7000~10000r/min离心10~15min，离心7次每次用超纯水替换除去未反应的t7肽，然后冷冻干燥得到t7-peg-pamam；

（4）将丹参酮iia先溶解在无水乙醇中，然后在搅拌的条件下并将其缓慢加入滴加到t7-peg-pamam溶液中，进行涡旋混匀，将反应液装入透析袋中透析10小时，每2小时用蒸馏水补充减少的的溶液以除去无水乙醇。最后加入吐温80溶液和的羧甲基纤维素钠溶液，室温下搅拌4小时进行冷冻干燥，即可得到t7肽修饰peg-pamam包载丹参酮iia纳米复合物。

其中，所述步骤（3）中多肽通过peg链连接于pamam树枝状大分子，多肽与peg的连接方法优选t7肽的疏基，与peg链一端的马来酰亚胺基团反应连接制得。

其中，所述步骤（4）中所用透析袋的截留分子量3000~4000，加入吐温-80(tween-80)溶液的质量分数的量为0.1%~0.5%，加入的体积为t7-peg-pamam溶液总量的0.5%~2%；加入羧甲基纤维素钠溶液的质量分数为的量为0.1%~2%，加入的体积为t7-peg-pamam溶液总量的5%~20%。

本发明的脑缺血靶向纳米递药系统与未修饰脑靶向头基的系统包载荧光染料dir后，经尾静脉注射到裸鼠体内后，利用活体成像仪考察纳米递药系统在体内分布特性，观察结果显示，脑靶向组在脑部的蓄积明显高于非靶向组，结果表明，t7肽可高效的介导脑靶向纳米递药系统的入脑。

本发明构建的脑缺血靶向纳米递药系统适用于靶向脑缺血细胞。

本发明的优点是：

1．本发明设计合理，工艺简单，节能环保。采用聚酰胺-胺（pamam）树状分子作为药物载体，并利用亲水性强的双功能聚乙二醇（nhs-peg-mal）对其修饰合成peg-pamam药物载体，包载丹参酮iia，可降低pamam引起的细胞毒性和溶血，增加丹参酮iia在水中的单分散性，解决了丹参酮iia水溶性差的问题。同时利用peg-pamam载体表面的t7肽与血脑屏障表面的受体通过胞吞作用，提高纳米载体跨越血脑屏障的效率和药物的生物利用度和脑靶向性，降低药物的毒副作用；

2．本发明所制备脑缺血靶向纳米递药系统，在体内不会形成给药栓塞，可用于静脉注射。可使药物选择性的向脑缺血病灶部位富集，达到更优越的药效。

附图说明

图1中的a图和b图分别是制备的纳米载体peg-pamam和t7-peg-pamam的核磁共振氢谱图。

图2是制备的纳米载体t7-peg-pamam的扫描电镜图。

图3是制备的纳米载体t7-peg-pamam的纳米粒径分布图。

图4是制备的纳米载体t7-peg-pamam的zeta电位分布图。

图5是脑靶向纳米递药系统体外释放曲线图。

图6是采用单纯t7-peg-pamam/dir纳米粒、pamam-peg/dir纳米粒、pamam/dir纳米粒尾静脉注射icr小鼠体内，利用活体成像法测定各组的体内的荧光分布图。

图7是各组大鼠脑梗死面积百分比的测定分布图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。

实施例1

分别称取13mg5.0代pamam树状大分子和31.0mg的mal-peg-nhs，两者的摩尔比为1:10，溶于10mlph8.38的pbs溶液中，室温下n2保护遮光搅拌反应2h，双功能聚乙二醇(mal-peg-nhs)中的nhs基团与pamam表面的氨基特异性的反应，将反应后的溶液转移至离心超滤管（mw10kda）中，转速8000~10000rpm/min，离心10~15min，离心5~8次，每次用去离子水替换缓冲溶液，除去未反应的mal-peg-nhs，冷冻干燥即制得peg-pamam，并进行核磁共振氢谱(h¹-nmr)表征，如图1中的a所示。

实施例2

分别称取13mg5.0代pamam树状大分子和31.0mg的mal-peg-nhs，两者的摩尔比为1:10，溶于10mlph8.38的pbs溶液中，室温下n2保护遮光搅拌反应2h，nhs基团与pamam表面的氨基特异性的反应，将反应后的溶液转移至离心超滤管（mw10kda）中，转速8000~10000rpm/min，离心10~15min，离心5~8次，每次用去离子水替换缓冲溶液，除去未反应的mal-peg-nhs，冷冻干燥即制得peg-pamam，按pamam与t7肽摩尔比为1：5的比例，分别取1mgt7肽与14.5mgpeg-pamam溶于2mlph7.00的pbs溶液中，室温下n2保护遮光搅拌反应24h，将反应后的溶液转移至离心超滤管（mw10kda），转速8000~10000rpm/min，离心10~15min，离心5~8次，每次用去离子水替换缓冲溶液，除去未反应的t7肽，即制得t7-peg-pamam纳米复合物，用重水作为h¹-nmr谱的测试溶剂，进行核磁共振氢谱的表征，如图1中的b所示。

实施例3

分别称取13mg5.0代pamam树状大分子和37.3mg的mal-peg-nhs，两者的摩尔比为1:12，溶于10mlph8.38的pbs溶液中，室温下n2保护遮光搅拌反应2h，nhs基团与pamam表面的氨基特异性的反应，将反应后的溶液液转移至离心超滤管（mw10kda）中，8000~10000rpm/min，离心10~15min，离心5~8次，每次用去离子水替换缓冲溶液，除去未反应的mal-peg-nhs，冷冻干燥即制得peg-pamam。按pamam与t7肽摩尔比为1：5的比例，分别取1mgt7肽与14.5mgpeg-pamam溶于2mlph7.00的pbs溶液中，室温下n2保护遮光搅拌反应24h，将反应后的溶液转移至离心超滤管（mw10kda），8000~10000rpm/min，离心10~15min，离心5~8次，每次用去离子水替换缓冲溶液，除去未反应的t7肽，即制得t7-peg-pamam纳米药物载体。

实施例4

分别称取13mg5.0代pamam树状大分子和31.0mg的mal-peg-nhs，两者的摩尔比为1:10，溶于10mlph8.38的pbs溶液中，室温下n2保护遮光搅拌反应2h，nhs基团与pamam表面的氨基特异性的反应，将反应后的溶液液转移至离心超滤管（mw10kda）中，8000~10000rpm/min，离心10~15min，离心5~8次，每次用去离子水替换缓冲溶液，除去未反应的mal-peg-nhs，冷冻干燥即制得peg-pamam。按pamam与t7肽摩尔比为1：2的比例，分别取1mgt7肽与34.65mgpeg-pamam溶于2mlph7.00的pbs溶液中，室温下n2保护遮光搅拌反应24h，将反应后的溶液转移至离心超滤管（mw10kda），8000~10000rpm/min，离心10~15min，离心5~8次，每次用去离子水替换缓冲溶液，除去未反应的t7肽，即制得t7-peg-pamam纳米药物载体。

实施例5

称取制备的t7-peg-pamam60mg溶于10mlph=7.0的pbs溶液中，另称取丹参酮iia10mg溶于10ml无水乙醇中。在室温下将丹参酮iia乙醇溶液缓慢滴加到t7-peg-pamam溶液中，再加入20ul0.1%吐温-80(tween-80)溶液和1ml0.5%的羧甲基纤维素钠（cmc-na）溶液氮气保护下室温遮光搅拌反应5h，将反应后溶液转移到截留分子量2000的透析袋中透析12h，除去无水乙醇，进行冷冻干燥，即可得到t7肽修饰的脑缺血靶向纳米递药系统。

实施例6

将制备的t7-peg-pamam-丹参酮iia纳米颗粒，用导电胶固定到金属片上，真空下镀金，利用扫描电镜sem观察纳米粒的外观形貌及分散性，可以看出t7-peg-pamam-丹参酮iia纳米颗粒，具有较规整的球形以及分散性良好，结果如图2所示。

实施例7

将制备的t7-peg-pamam-丹参酮iia纳米粒和溶于蒸馏水中，制备成1mg/ml的溶液，经过0.22µm微孔滤膜过滤后，置于zeta-sizer电位粒度分析仪中检测粒径分布和电位分布，样品测试重复三次，取平均值，测得t7-peg-pamam-丹参酮iia的粒径为158.6±0.263nm，zeta电位为2.44±0.173mv，结果如图3和图4所示。

实施例6t7肽修饰脑缺血靶向纳米递药系统体外释药的测定。

采用高效液相色谱测定t7肽修饰脑缺血靶向纳米递药系统中丹参酮iia的含量，测试条件:色谱柱：watersc18色谱柱（250mmx×4.6mm，5μm），流动相：甲醇：水=75:25（v/v）柱温：25℃流速：1.0ml/min紫外检测波长：268~270nm，进样量：20μl

采用透析法进行体外释药动力学研究，称取一定质量的pamam/tsiia、peg-pamam/tsiia、t7-peg-pamam/tsiia和等质量的tsiia，分别溶于0.02mol/l的ph=7.4pbs缓冲溶液中，转移至透析袋(截留分子量md=3500)中，以含0.2%tween-80的200mlph7.4pbs缓冲液为释放介质，在37±1℃100r/min恒温水浴摇床中。分别于0、15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h规定的时间点取样1ml，同时补充等体积的37℃新鲜pbs缓冲溶液。用0.22μm微孔滤膜过滤后，采用hplc法272nm测定tsiia的吸收峰，每个时间点采取的样品平行操作3次。根据tsiia标准曲线方程，计算不同时间段内的tsiia累计释放率，以累积释放率的平均值对时间绘制体外累计释放曲线。（如图5所示）。

实施例6所述t7肽修饰脑缺血靶向纳米递药系统在小鼠体内的分布评价

使用本发明制备的包载荧光探针dir的三种纳米化合物检测本发明的载药纳米递药系统的脑靶向作用。即为:包载荧光探针dir的pamam载药纳米颗粒(pamam-dir-nps)；包载荧光探针dir的peg-pamam的载药纳米颗粒(peg-pamam-dir-nps)；包载荧光探针dir的t7肽修饰peg-pamam的载药纳米颗粒(t7-peg-pamam-dir-nps)。

将上述三组化合物配置成10mg/m1的溶液。选取雄性icr小鼠9只，体重20±2g，每组小鼠分别尾静脉注射给药化合物，给药剂量按100mg/kg小鼠体重注射。在给药后30min、1h、3h的三个时间点，分别丛每组中随机抽取一只，腹腔注射0.2ml10%的水合氯醛溶液进行麻醉，并将其置入多光谱小动物活体成像系统中成像，观察各组包载荧光追踪剂的载药纳米颗粒在小鼠脑部的聚集程度，各组给药1h后的荧光强度图如图6所示。可见t7-peg-pamam-dir-nps组的脑部荧光强度明显强于peg-pamam-dir-nps组和pamam-dir-nps组。

实施例6t7肽修饰脑缺血靶向纳米递药系统在小鼠体内的分布评价

实验动物随机分为6组，每组10只大鼠。a组：为假手术组（sham）：只进行麻醉和血管分离，不结扎血管及导入尼龙线栓，手术后每日注射生理盐水2ml/kg；b组：为缺血再灌注模型组（mcao），手术后每日注射生理盐水2ml/kg；c组：为尼莫地平阳性药物对照组（positive），缺血后按10mg/kg每日注射尼莫地平注射液；d组为丹参酮iia原料药组（tsiia），缺血后每日按10mg/kgtsiia的剂量给予注射0.5%cmc-natsiia溶液，e组为t7-peg-pamam/tsiia组，缺血后每日按10mg/kgtsiia的剂量给予注射含0.5%cmc-na的t7-peg-pamam/tsiia溶液。将脑组织冠状切片置2％的2，3，5－三苯基氯化四氮唑（ttc）溶液中染色。ttc可被线粒体过氧化氢酶还原，生成红色、光敏脂溶性的三苯甲月替（ttf），正常组织染成红色，缺血区因无此反应而呈现白色。脑组织切片经ttc染色后，数码相机拍摄并输入计算机，利用“医学形态学图象分析系统”测量梗死面积占总面积的百分比。经过测量后各组的脑梗死面积百分比分布图如图7所示。

在上述实施例中，仅用于说明本发明但是不仅局限于此，应该理解在不脱离本发明的范围内还可以有多种变通或替换方案。