一种具有催化NO长期稳定释放功能的超亲水涂层及其制备方法与流程

本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种具有催化no长期稳定释放功能的超亲水涂层及其制备方法，可用于抗凝血、抗增生、促内皮、抗肿瘤等材料的表面改性研究。

背景技术

优良的血液相容性和细胞相容性是生物材料必须满足的条件之一，特别是对于直接与血液接触的心血管植入器械(例如：血管支架、心脏瓣膜、人工血管、起搏器等)，良好的血液相容性是至首要考虑的因素。一氧化氮(no)是调节心血管系统功能的重要细胞信使分子，在一氧化氮合成酶(nos)的催化作用下，l-精氨酸(l-argininehydrochloride)转化生成l-胍氨酸(l-citrulline)和一氧化氮。no在体内发挥着非常重要的生物学功能，包括舒张血管，神经传递，免疫调节，心脏收缩，促进内皮细胞粘附和增殖，抑制血小板黏附、聚集和激活，抑制平滑肌细胞增生和迁移，抑制肿瘤细胞的增生。近年来，no已被广泛应用于心血管材料领域研究，主要包括no供体型材料和no产生型材料。其中，no供体型材料主要将可以释放no分子的物质装载在材料中，该材料在植入体内时其表面可直接释放出no，从而改善植入材料的抗凝血功能。然而这类材料存在很大的弊端如no的释放量有限、初期no释放速度过快。如果体内产生的no不足，将会引发心血管疾病，但如果体内产生的no过多，也会对生物体产生毒害作用，这是因为no会与超氧根离子(o^2-)反应，生成活性更高的过氧亚硝酸根离子(no3^-)，no3^-可与体内的酪氨酸发生硝化反应，硝基化后的酪氨酸能使体内的酶或者蛋白功能受损，导致其活性下降。所以no供体型材料根本无法实现no长期持续稳定的有效释放，从而限制了其在临床中的应用范围。no产生型材料表面有固定的催化剂，这一催化活性层可以诱导内源性供体rsno释放出no。人体血液中含有大量的内源性no供体，研究发现，在硫醇(rsh)存在的情况下，谷胱甘肽过氧化酶(glutathioneperoxidase，gpx)可以催化s-亚硝基谷胱甘肽(gsno)释放出no，从而在植入材料表面实现抑制血小板激活与聚集的目的。因此，原位构建催化no再生型材料可以实现体内的no持续稳定的有效释放，也只有保持no适量且稳定的释放，才能实现no的正常功能。但传统的no产生型材料都是将no催化剂接枝或固定在材料表面，表面接枝或固定的no催化剂含量有限，且不断从表面释放到血液中，在较短时间内催化剂可能完全释放，故不能实现no长期有效的释放。

超亲水表面的构建对于阻抗蛋白非特异性吸附已通过广泛的研究加以证实，在血液环境中，超亲水表面会形成一个水化层，可让血液流体环境下的纤维蛋白原在超亲水表面停留后维持其原有的构象，不会进一步交联形成纤维蛋白网络。在生物医用超亲水表面构建方面，有两类材料被广泛加以研究，一类是亲水性物质，另一类则是两性离子聚合物。亲水性物质的引入是靠物理接枝或涂覆在材料表面，两种方法都必须依赖分子的尺寸、构象、活性以及其在材料表面发挥亲水性作用的稳定性及持久性。生物分子一旦在服役过程中失活或大量丢失，便不能有效发挥其生物学功能；两性离子聚合物是通过离子键将水分子结合在其周围形成水合层，可以有效阻抗蛋白的非特异性吸附，然后两性离子聚合物对蛋白和细胞的阻抗具有非特异性，阻抗血液细胞和平滑肌细胞的粘附同时也阻抗内皮细胞的粘附。因此在材料表面构建具有特异性阻抗蛋白和细胞粘附的超亲水涂层至关重要。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种具有催化no长期稳定释放功能的超亲水涂层及其制备方法，在涂层的制备过程中，通过将no催化剂与酚羟基官能团相互作用或体系间π-π堆积作用组装到涂层中，其含量和释放速度可调控，可实现体内no长期稳定持续释放的功能。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种具有催化no长期稳定释放功能的超亲水涂层，其制备方法包括以下步骤：

(1)对基底材料表面进行预处理；

(2)将处理后的基底材料置于ph值为2-7的缓冲液中，接着加入多酚化合物、多胺基化合物、no催化剂和水溶性氧化剂，使得多酚化合物、多胺基化合物、no催化剂和水溶性氧化剂的终浓度分别为0.01-10mg/ml、0.01-10mg/ml、0.01-10mg/ml和0.01-10mg/ml，然后在4-50℃反应0.1-48h；

(3)将步骤(2)所得物浸没于去离子水中，超声清洗3-4次，每次4-5min，然后在氮气条件下干燥，制得。

进一步地，基底材料为金属基生物材料、陶瓷基生物材料、高分子基生物材料或复合生物材料。

进一步地，缓冲液为乙酸-乙酸盐缓冲液、2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

进一步地，多酚化合物为单宁酸、没食子酸、丹酚酸b、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、表没食子儿茶素、邻苯二酚、邻苯三酚、黄酮类、花色素苷、鞣花酸和原花色素a2中的一种或几种混合。

进一步地，多胺基化合物为l-精氨酸、乙二胺、戊二胺、2,2,4-三甲基六亚甲基二胺、1,8-二氨基辛烷、甲基环己烷二胺、1,3-二氨基甲基环己烷、2,4,6-三氨甲基环己烷、1,4-双二氨已基环己烷和2-(3,4-二羟基苯基)乙胺中的一种或几种混合。

进一步地，no催化剂为胱胺、依布硒啉、硒代胱胺、硒代胱氨酸、胱氨酸、cucl2和cucl中的一种或几种混合。

进一步地，水溶性氧化剂为过氧化氢、过硫酸铵、浓硝酸、高碘酸钠、高锰酸钾和重铬酸钾中的一种或几种混合。

本发明提供的具有催化no长期稳定释放功能的超亲水涂层及其制备方法，具有以下有益效果：

采用本发明方法，通过四组分(多酚化合物、多胺基化合物、no催化剂及氧化剂)相互作用的方式制备改性涂层，将no催化剂与酚羟基官能团相互作用或体系间π-π堆积作用或氢键作用组装到血液接触类材料表面，可以同时获得有效控制no的释放速度和获得no的长期持续稳定释放，具有较高的应用价值。

多酚类化合物在氧化剂作用下较容易被氧化脱氢，其结构中的邻苯二酚则转化成邻苯二醌结构，该结构可进一步与含有氨基的化合物发生迈克尔加成反应和希夫碱反应；同时没有与氨基发生反应的邻苯二醌结构在氧化剂的作用下形成羧基结构。因此将多酚类化合物与分子结构中含两个或两个以上氨基的化合物反应，能形成聚合涂层或交联聚合物涂层。胱胺和硒代胱胺具有两端氨基的分子结构，能与多酚类化合物发生迈克尔加成反应和希夫碱反应，能在材料表面形成交联聚合涂层，同时金属离子(cu²⁺、cu⁺)能与多酚化合物发生螯合反应和氧化还原反应，因此就能实现有no催化剂在血液接触材料表面的负载，获得具有原位催化no再生的催化活性表面。同时涂层表面因含大量的亲水基团而具有超亲水性，该超亲水表面具有很好的抗污性，可以有效阻抗纤维蛋白原的粘附和变性，进一步抑制血小板在材料表面粘附和激活，且涂层中过量未反应的多酚可以发挥其良好的生物学功能，包括抗氧化性、抗炎症反应、抗菌性、对内皮细胞友好且抑制平滑肌细胞增殖等等。多酚、多胺基和no催化剂复合涂层在材料表面改性能力主要基于其可以在不同的材料表面自选择地以共价、氢键、疏水作用力及超分子作用力等多种模式与材料表面发生物理/化学沉积，形成多酚涂层，且多酚类化合物的分子结构中含有大量的邻位酚羟基，因此涂层中这些邻位酚羟基可与金属形成稳定螯合作用，多酚交联涂层能在金属表面形成较稳定的结合，该交联聚合涂层还能通过分子间疏水相互作用和氢键作用与陶瓷生物材料、高分子生物材料形成较稳定的结合，这样的涂层与各类生物材料基底具有优良的结合力。因此，该涂层可广泛地应用于几乎所有的生物材料表面。

采用本发明方法制备的新型催化no长期稳定释放的超亲水涂层，具有优异的催化人体内源性no供体释放no和阻抗纤维蛋白原粘附的能力，能有效的抑制血小板在材料表面的激活和聚集，发挥较好的抗凝血功能，可用于抗凝血、抗增生、促内皮、抗肿瘤等材料的表面改性研究。

附图说明

图1为传统涂层和本发明制得的涂层抗血小板粘附的扫描电镜(sem)图。

具体实施方式

实施例1

一种具有催化no长期稳定释放功能的超亲水涂层，其制备方法包括以下步骤：

(1)对医用不锈钢材料进行抛光、清洗和干燥处理；

(2)将处理后的基底材料置于ph值为4的乙酸-乙酸钠缓冲液中，接着加入没食子酸、l-精氨酸、胱胺和质量分数为65％-68％的浓硝酸，没食子酸、l-精氨酸、胱胺和浓硝酸的终浓度分别为0.01mg/ml、0.01mg/ml、0.01mg/ml，浓硝酸的质量分数为34％，然后在40℃反应30h；

(3)将步骤(2)所得物浸没于去离子水中，超声清洗3次，每次5min，然后在氮气条件下干燥，制得。

实施例2

一种具有催化no长期稳定释放功能的超亲水涂层，其制备方法包括以下步骤：

(1)对镍钛合金材料进行抛光、清洗和干燥处理；

(2)将处理后的基底材料置于ph值为3.5的邻苯二甲酸-盐酸缓冲液中，接着加入表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)、乙二胺、氯化铜和质量分数为30％的过氧化氢溶液，表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)、乙二胺、氯化铜的终浓度分别为1mg/ml、2mg/ml、1mg/ml，过氧化氢溶液的质量分数为15％，然后在30℃反应10h；

(3)将步骤(2)所得物浸没于去离子水中，超声清洗3次，每次5min，然后在氮气条件下干燥，制得。

实施例3

一种具有催化no长期稳定释放功能的超亲水涂层，其制备方法包括以下步骤：

(1)对聚四氟乙烯材料进行清洗和干燥处理；

(2)将处理后的基底材料置于ph值为6的2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，接着加入表儿茶素没食子酸酯(ecg)、1,8-二氨基辛烷、硒代胱胺和高碘酸钠溶液，表儿茶素没食子酸酯(ecg)、1,8-二氨基辛烷、硒代胱胺和高碘酸钠溶液的终浓度分别为2mg/ml、4mg/ml、2mg/ml和4mg/ml，然后在25℃反应2h；

(3)将步骤(2)所得物浸没于去离子水中，超声清洗3次，每次5min，然后在氮气条件下干燥，制得。

实施例4

一种具有催化no长期稳定释放功能的超亲水涂层，其制备方法包括以下步骤：

(1)对聚氨酯材料进行清洗和干燥处理；

(2)将处理后的基底材料置于ph值为6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，接着加入没食子酸、1,4-双二氨已基环己烷、硒代胱氨酸和过硫酸铵溶液，没食子酸、1,4-双二氨已基环己烷、硒代胱氨酸和过硫酸铵溶液的终浓度分别为2mg/ml、5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml，然后在20℃反应18h；

(3)将步骤(2)所得物浸没于去离子水中，超声清洗3次，每次5min，然后在氮气条件下干燥，制得。

实施例5

一种具有催化no长期稳定释放功能的超亲水涂层，其制备方法包括以下步骤：

(1)对各向同性热解碳ltic材料进行清洗和干燥处理；

(2)将处理后的基底材料置于ph值为4.5的邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液中，接着加入表儿茶素(ec)、2-(3,4-二羟基苯基)乙胺、胱氨酸和高碘酸钠溶液，表儿茶素(ec)、2-(3,4-二羟基苯基)乙胺、胱氨酸和高碘酸钠溶液的终浓度分别为5mg/ml、7mg/ml、3mg/ml和5mg/ml，然后在25℃反应6h；

(3)将步骤(2)所得物浸没于去离子水中，超声清洗3次，每次5min，然后在氮气条件下干燥，制得。

实施例6

一种具有催化no长期稳定释放功能的超亲水涂层，其制备方法包括以下步骤：

(1)对医用胶原材料进行清洗和干燥处理；

(2)将处理后的基底材料置于ph值为4的甘氨酸-盐酸缓冲液中，接着加入表没食子儿茶素(egc)、戊二胺、cucl和过硫酸铵溶液，表没食子儿茶素(egc)、戊二胺、cucl和过硫酸铵溶液的终浓度分别为0.1mg/ml、0.5mg/ml、0.5mg/ml和0.5mg/ml，然后在30℃反应12h；

(3)将步骤(2)所得物浸没于去离子水中，超声清洗3次，每次5min，然后在氮气条件下干燥，制得。

实施例7

一种具有催化no长期稳定释放功能的超亲水涂层，其制备方法包括以下步骤：

(1)对天然橡胶材料进行清洗和干燥处理；

(2)将处理后的基底材料置于ph值为5.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，接着加入邻苯三酚、1,3-二氨基甲基环己烷、依咘硒啉和高锰酸钾溶液，邻苯三酚、1,3-二氨基甲基环己烷、依咘硒啉和高锰酸钾溶液的终浓度分别为7mg/ml、10mg/ml、4mg/ml和10mg/ml，然后在40℃反应1h；

(3)将步骤(2)所得物浸没于去离子水中，超声清洗3次，每次5min，然后在氮气条件下干燥，制得。

实施例8

一种具有催化no长期稳定释放功能的超亲水涂层，其制备方法包括以下步骤：

(1)对生物活性玻璃陶瓷涂层增强的钛合金材料进行清洗和干燥处理；

(2)将处理后的基底材料置于ph值为4.5的柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液中，接着加入表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)、2,2,4-三甲基六亚甲基二胺、cucl2溶液和重铬酸钾溶液，表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)、2,2,4-三甲基六亚甲基二胺、cucl2溶液和重铬酸钾溶液的终浓度分别为6mg/ml、6mg/ml、4mg/ml和3mg/ml，然后在30℃反应5h；

(3)将步骤(2)所得物浸没于去离子水中，超声清洗3次，每次5min，然后在氮气条件下干燥，制得。

对比例1

传统多酚涂层是多酚在碱性环境中通过自氧化、交联沉积薄膜制得，即将不锈钢基底放在2mg/ml的ph为8.5的多巴胺溶液中静置3h，然后超声清洗3遍，每次5min。

用传统多酚涂层和实施例3制备的新型涂层做血小板粘附实验。首先，将样品放置于24孔板中，正面用紫外灭菌30min，待用；取兔子新鲜全血10ml，通过1500转速，离心15min，获得富含血小板血浆；在装有样品的孔板里加500ul的富血小板血浆，并浸没样品；然后将孔板放于37℃的恒温震荡摇床中孵育1h，取出；用pbs清洗3遍，每次3min，洗去没有粘附的血小板；用75％的乙醇固定12h；用临界点干燥；用扫描电镜(sem)观察，其结果见图1，其中，左边为传统涂层，右边为本发明制得的涂层。由图1可知，相比传统涂层，本发明制得的涂层表面血小板粘附数量、聚集和激活程度均得到明显抑制，说明本发明制得的涂层具有优异的抗凝血性能。