本发明涉及医用材料技术领域，具体涉及一种表面镀有纳米碳晶薄膜的钛义齿材料的制备方法。
背景技术
金属是口腔义齿修复中必不可少的一种材料。由于口腔内复杂的酸碱环境和微生物环境，金属材料型义齿在口腔内使用一段时间后，表面会出现不同程度的腐蚀、变色、细菌粘附等现象，细菌在义齿表面粘附易导致义齿性口炎、牙龈炎、龋病、口腔异味等问题，严重影响修复体的美观和使用寿命，更严重的会导致危害人体健康的不良反应和并发症，因此，改善义齿金属材料的表面性能具有非常重要的临床意义。
同时，作为一种长期与口腔粘膜密切接触的义齿材料，材料表面的一些有害物质会向粘膜组织渗透转移并引发不同程度的组织炎症反应，包括色素沉积、溃疡、糜烂、过敏反应等。因此，义齿材料对口腔粘膜局部刺激的轻重主要取决于材料表面或者其自身的化学稳定性，化学稳定性越好，刺激程度越轻。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种表面镀有纳米碳晶薄膜的钛义齿材料的制备方法。
基于上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种表面镀有纳米碳晶薄膜的钛义齿材料的制备方法，包括以下步骤：
1）钛片预处理：抛光、超声清洗、干燥，得预处理钛片；
2）一次涂覆：将步骤1）预处理钛片置于丙酮中超声清洗30-40min、干燥后，浸入tio2浸涂溶液，静置50-60s、取出，于70-80℃下，干燥1-2h，然后于500-600℃下，热处理2-3h，冷却；
3）二次涂覆：将步骤2）一次涂覆后的预处理钛片浸入tio2/改性纳米碳晶浸涂溶液中，静置50-60s、取出，于70-80℃下，干燥1-2h，然后于400-500℃下，热处理2-3h，冷却；
4）三次涂覆：将步骤3）二次涂覆后的预处理钛片浸入改性纳米碳晶浸涂溶液中，静置50-60s、取出，于70-80℃下，干燥1-2h，然后于600-700℃下，热处理2-3h，冷却，得表面镀有纳米碳晶薄膜的义齿材料；
a)tio2浸涂溶液的制备：将20-30ml去离子水溶于200-230ml异丙醇中，搅拌30-40min，得溶液a；将14-15g钛酸四异丙酯溶于90-100ml的异丙醇中，搅拌30-40min，得溶液b，将溶液b以0.5-0.6ml/min滴入溶液a中后，继续反应30-40min，得白色悬浊液，抽滤，用去离子水洗涤2-5次，得白色沉淀物，将150-200ml去离子水加入白色沉淀物中，于60-70℃下，搅拌30-40min后，添加15-16g浓度为10%的硝酸，陈化20-24h，得tio2浸涂溶液；
b)tio2/改性纳米碳晶浸涂溶液的制备：将2-10g改性纳米碳晶加入步骤a）制得的tio2浸涂溶液中，超声分散1-2h，得tio2/改性纳米碳晶浸涂溶液；
c)改性纳米碳晶浸涂溶液的制备：将2-10g改性纳米碳晶加入20-25ml无水乙醇中，超声分散1-2h，得改性纳米碳晶浸涂溶液；
步骤b）和c）中改性纳米碳晶的制备方法：称取2-10g纳米碳晶置于回流装置中，加入30-50ml的浓硝酸，于90℃下，回流15-16h，分离，加入氢氧化钠溶液混合，离心，得沉淀物为改性纳米碳晶。
步骤1）钛片预处理方法：将钛片用砂纸磨光，再用粒度为0.5um的氧化铝抛光2次，清除钛片表面的氧化铝后，依次置于丙酮、无水乙醇、蒸馏水中进行超声清洗，吹干，得预处理钛片。
步骤2）、3）和4）中，取出时，垂直提拉速度均为1.5-2.0mm/s；步骤b）和c）超声分散条件：超声功率为90w、超声频率为59khz。
步骤2）一次涂覆、3）二次涂覆和4）三次涂覆的涂层总厚度为100-150μm。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明采用阶梯涂覆的方法，有效提高纳米碳晶涂层的应力稳定性，所制得的义齿材料无任何刺激，具有较好的生物相容性，同时可以有效改善义齿金属材料的细菌粘附性能；
2、本发明将纳米碳晶薄膜引入到口腔修复学领域，有效改善口腔修复材料的表面性能，提高义齿质量和使用寿命，减少或避免与义齿有关的临床并发症以及不良反应，具有良好的应用前景。
具体实施方式
实施例1
一种表面镀有纳米碳晶薄膜的钛义齿材料的制备方法，包括以下步骤：
1）钛片预处理：将直径为30mm、长300mm的纯钛棒材（ti99.9wt%）加工成直径12mm的圆棒，然后采用线切割的方法截取直径为12mm、厚度为2mm的钛片，共60个，将钛片依次用400目、600目、800目、1000目、1200目、1500目耐水型砂纸磨光，再用粒度为0.5um的氧化铝抛光2次，每次每个钛片抛光5min，清除钛片表面的氧化铝后，依次置于丙酮、无水乙醇、蒸馏水中超声清洗各10min，然后钛片表面用气枪吹干，得预处理钛片（密封保存备用）；
2）一次涂覆：将步骤1）预处理钛片（随机选取30个预处理钛片）垂直浸入置于丙酮中超声清洗30min、干燥后，浸入tio2浸涂溶液，静置55s、以垂直提拉速度为1.5mm/s取出，于70℃下，干燥2h，然后置于马弗炉中，以1.5℃/min升温至500℃，热处理3h，冷却至室温；
3）二次涂覆：将步骤2）一次涂覆后的预处理钛片垂直浸入tio2/改性纳米碳晶浸涂溶液中，静置55s、以垂直提拉速度均为1.5mm/s取出，于70℃下，干燥2h，然后置于马弗炉中，以1.5℃/min升温至400℃下，热处理3h，冷却至室温；
4）三次涂覆：将步骤3）二次涂覆后的预处理钛片垂直浸入改性纳米碳晶浸涂溶液中，静置55s、以垂直提拉速度均为1.5mm/s取出，于70℃下，干燥2h，然后置于马弗炉中，以1.5℃/min升温至600℃下，热处理3h，冷却至室温，得表面镀有纳米碳晶薄膜的义齿材料；
a)tio2浸涂溶液的制备：将20ml去离子水溶于200ml异丙醇中，搅拌30min，得溶液a；将14g钛酸四异丙酯溶于90ml的异丙醇中，搅拌30min，得溶液b，将溶液b以0.5ml/min滴入溶液a中后，继续反应30min，得白色悬浊液，抽滤，用去离子水洗涤2次，得白色沉淀物，将150ml去离子水加入白色沉淀物中，于60℃下，磁力搅拌30min后，添加15g浓度为10%的硝酸，陈化20h，得tio2浸涂溶液；
b)tio2/改性纳米碳晶浸涂溶液的制备：将2g改性纳米碳晶加入步骤a）制得的tio2浸涂溶液中，超声功率为90w、超声频率为59khz下，超声分散1h，得tio2/改性纳米碳晶浸涂溶液；
c)改性纳米碳晶浸涂溶液的制备：将2g改性纳米碳晶加入20ml无水乙醇中，超声功率为90w、超声频率为59khz下，超声分散1h，得改性纳米碳晶浸涂溶液；
步骤b）和c）中改性纳米碳晶的制备方法：称取2g纳米碳晶置于锥形回流管中，加入30ml的浓硝酸，于90℃下，回流15h，分离，加入氢氧化钠溶液混合（中和残留浓硝酸），离心，得沉淀物为改性纳米碳晶。
步骤2）一次涂覆、3）二次涂覆和4）三次涂覆的涂层总厚度为150μm。
实施例2
一种表面镀有纳米碳晶薄膜的钛义齿材料的制备方法，包括以下步骤：
1）钛片预处理：将直径为30mm、长300mm的纯钛棒材（ti99.9wt%）加工成直径12mm的圆棒，然后采用线切割的方法截取直径为12mm、厚度为2mm的钛片，共60个，将钛片依次用400目、600目、800目、1000目、1200目、1500目耐水型砂纸磨光，再用粒度为0.5um的氧化铝抛光2次，每次每个钛片抛光8min，清除钛片表面的氧化铝后，依次置于丙酮、无水乙醇、蒸馏水中超声清洗各10min，然后钛片表面用气枪吹干，得预处理钛片（密封保存备用）；
2）一次涂覆：将步骤1）预处理钛片（随机选取30个预处理钛片）垂直浸入置于丙酮中超声清洗40min、干燥后，浸入tio2浸涂溶液，静置60s、以垂直提拉速度为2.0mm/s取出，于80℃下，干燥1h，然后置于马弗炉中，以1.5℃/min升温至600℃，热处理2h，冷却至室温；
3）二次涂覆：将步骤2）一次涂覆后的预处理钛片垂直浸入tio2/改性纳米碳晶浸涂溶液中，静置55s、以垂直提拉速度均为2.0mm/s取出，于80℃下，干燥1h，然后置于马弗炉中，以1.5℃/min升温至500℃下，热处理2h，冷却至室温；
4）三次涂覆：将步骤3）二次涂覆后的预处理钛片垂直浸入改性纳米碳晶浸涂溶液中，静置55s、以垂直提拉速度均为2.0mm/s取出，于80℃下，干燥1h，然后置于马弗炉中，以1.5℃/min升温至700℃下，热处理2h，冷却至室温，得表面镀有纳米碳晶薄膜的义齿材料；
a)tio2浸涂溶液的制备：将30ml去离子水溶于230ml异丙醇中，搅拌40min，得溶液a；将15g钛酸四异丙酯溶于100ml的异丙醇中，搅拌40min，得溶液b，将溶液b以0.6ml/min滴入溶液a中后，继续反应40min，得白色悬浊液，抽滤，用去离子水洗涤5次，得白色沉淀物，将200ml去离子水加入白色沉淀物中，于70℃下，磁力搅拌40min后，添加16g浓度为10%的硝酸，陈化24h，得tio2浸涂溶液；
b)tio2/改性纳米碳晶浸涂溶液的制备：将10g改性纳米碳晶加入步骤a）制得的tio2浸涂溶液中，超声功率为90w、超声频率为59khz下，超声分散2h，得tio2/改性纳米碳晶浸涂溶液；
c)改性纳米碳晶浸涂溶液的制备：将10g改性纳米碳晶加入25ml无水乙醇中，超声功率为90w、超声频率为59khz下，超声分散2h，得改性纳米碳晶浸涂溶液；
步骤b）和c）中改性纳米碳晶的制备方法：称取10g纳米碳晶置于回流装置（锥形回流管）中，加入50ml的浓硝酸，于90℃下，回流16h，分离，加入氢氧化钠溶液混合（中和残留浓硝酸），离心，得沉淀物为改性纳米碳晶。
步骤2）一次涂覆、3）二次涂覆和4）三次涂覆的涂层总厚度为100μm。
实施例3
一种表面镀有纳米碳晶薄膜的钛义齿材料的制备方法，包括以下步骤：
1）钛片预处理：将直径为30mm、长300mm的纯钛棒材（ti99.9wt%）加工成直径12mm的圆棒，然后采用线切割的方法截取直径为12mm、厚度为2mm的钛片，共60个，将钛片依次用400目、600目、800目、1000目、1200目、1500目耐水型砂纸磨光，再用粒度为0.5um的氧化铝抛光2次，每次每个钛片抛光6min，清除钛片表面的氧化铝后，依次置于丙酮、无水乙醇、蒸馏水中超声清洗各10min，然后钛片表面用气枪吹干，得预处理钛片（密封保存备用）；
2）一次涂覆：将步骤1）预处理钛片（随机选取30个预处理钛片）垂直浸入置于丙酮中超声清洗35min、干燥后，浸入tio2浸涂溶液，静置50s、以垂直提拉速度为1.8mm/s取出，于75℃下，干燥2h，然后置于马弗炉中，以1.5℃/min升温至550℃，热处理3h，冷却至室温；
3）二次涂覆：将步骤2）一次涂覆后的预处理钛片垂直浸入tio2/改性纳米碳晶浸涂溶液中，静置55s、以垂直提拉速度均为1.8mm/s取出，于75℃下，干燥2h，然后置于马弗炉中，以1.5℃/min升温至450℃下，热处理3h，冷却至室温；
4）三次涂覆：将步骤3）二次涂覆后的预处理钛片垂直浸入改性纳米碳晶浸涂溶液中，静置55s、以垂直提拉速度均为1.8mm/s取出，于75℃下，干燥2h，然后置于马弗炉中，以1.5℃/min升温至650℃下，热处理3h，冷却至室温，得表面镀有纳米碳晶薄膜的义齿材料；
a)tio2浸涂溶液的制备：将25ml去离子水溶于220ml异丙醇中，搅拌40min，得溶液a；将15g钛酸四异丙酯溶于90ml的异丙醇中，搅拌40min，得溶液b，将溶液b以0.6ml/min滴入溶液a中后，继续反应30min，得白色悬浊液，抽滤，用去离子水洗涤4次，得白色沉淀物，将180ml去离子水加入白色沉淀物中，于65℃下，磁力搅拌40min后，添加16g浓度为10%的硝酸，陈化22h，得tio2浸涂溶液；
b)tio2/改性纳米碳晶浸涂溶液的制备：将6g改性纳米碳晶加入步骤a）制得的tio2浸涂溶液中，超声功率为90w、超声频率为59khz下，超声分散2h，得tio2/改性纳米碳晶浸涂溶液；
c)改性纳米碳晶浸涂溶液的制备：将6g改性纳米碳晶加入23ml无水乙醇中，超声功率为90w、超声频率为59khz下，超声分散2h，得改性纳米碳晶浸涂溶液；
步骤b）和c）中改性纳米碳晶的制备方法：称取6g纳米碳晶置于回流装置（锥形回流管）中，加入40ml的浓硝酸，于90℃下，回流15h，分离，加入氢氧化钠溶液混合（中和残留浓硝酸），离心，得沉淀物为改性纳米碳晶。
步骤2）一次涂覆、3）二次涂覆和4）三次涂覆的涂层总厚度为120μm。
实施例4性能测试
4.1体外细胞毒性实验
从实施例1制成的义齿材料中随机选取3个组成实验组，从实施例1步骤1）尚未镀膜的预处理钛片中随机选取3个组成阴性对照组。试验组和对照组的钛片均依次放入丙酮、无水乙醇、蒸馏水中进行超声清洗各10min，用气枪吹干，密封备用。
根据iso10993-5和iso10993-12，配制含小牛血清的细胞培养液，将实验组和阴性对照组试件分别加入上述细胞培养液中，置于37℃培养24h，得到浸提液。将传代培养48h的l-929成纤维细胞株用细胞培养液制备成1×105个/ml的细胞悬液。将1×105个/ml的细胞悬液接种于36孔细胞培养板，其中36孔平均分为3组，前2组分别加入实验组浸提液和阴性对照组浸提液，第3组为空白对照。然后将细胞培养板置于37℃二氧化碳培养箱中培养24h，等细胞贴壁生长后，去除上清液。分别在培养1、3、5天后取出，用酶联免疫检测仪在波长为490nm下测定其吸光度od值。
以计算各组细胞的相对增值率（rgr），并按照毒性评级标准来评价材料的细胞毒性。毒性评级≤1级表示材料无细胞毒性。rgr=各实验组的od均值/阴性对照组od均值×100%。实验结果如表1所示。
由表1可知，各组的od值都随着时间的延长而增加；各时间点，实验组的细胞相对增值率均大于100%，毒性评级均0级。由此得知，本发明制备的义齿材料具有良好的生物相容性，原因在于，纳米碳晶薄膜由碳元素构成，而碳元素对人体无毒；其次，该薄膜具有良好的化学稳定性和耐腐蚀性，可以有效避免不良的化学反应。
4.2粘膜接触实验
本发明所制得的义齿材料表面所镀的纳米碳晶薄膜必将与口腔粘膜组织直接接触，因此，该薄膜是否会对口腔粘膜产生不良刺激是评价其生物相容性的关键因素。本实验严格按照gb/t16886医疗器械生物学评价标准对牙科纯钛表面所镀纳米碳晶薄膜进行粘膜接触实验。
实验选用日龄为60-70天的仓鼠10只，同一品系，雌雄不限，体质健康且双侧颊囊无任何病变。仓鼠称重后进行麻醉，用75%的医用酒精消毒仓鼠口腔内外，然后将实验组和阴性对照组的钛片（具体分组同4.1体外细胞毒性实验）依次缝合固定于仓鼠一侧颊囊的粘膜上。每只仓鼠的一侧缝合一个钛片，另一侧颊囊作为空白对照。本发明的镀膜面与颊囊粘膜紧密接触，缝合方式为贯通口腔内外的全层缝合。术后每日检查其固定情况，并记录钛片周围粘膜组织反应。14天后将所有仓鼠处死，切取与钛片接触区域颊囊粘膜组织进行肉眼评分，并在显微镜下进行组织学评分。评分结果如表2所示。
肉眼观察，各实验动物颊囊粘膜与钛片接触区域未见明显充血、红斑、腐烂等病理反应，实验组肉眼评价得分为0分。与实验组钛片接触的颊囊粘膜区域组织切片显示：粘膜上皮完好，粘膜基层和粘膜下层未见白细胞浸润、血管充血、水肿等病理现象；实验组组织学评价均为0分。最终得出实验组的刺激指数皆为0，表示对粘膜无刺激。
在整个实验阶段，仓鼠饮食正常，活动能力较强，对外界刺激反应灵敏，实验组钛片周围粘膜组织无明显充血、肿胀、腐烂等不良反应。这说明纳米碳晶薄膜对口腔组织无任何刺激，具有良好的生物相容性，可以应用于牙科钛片的表面处理。这是由于纳米碳晶有sp2和sp3碳原子构成，这两种化学键状态的碳元素结合稳定，既不容易析出，也不容易与周围物质发生化学反应，具有良好的耐腐蚀性能和化学稳定性，因而可以有效避免对所接触组织的不良刺激。
4.3细菌粘附实验
从实施例1制成的义齿材料中随机选取9个组成实验组，从从实施例1步骤1）尚未镀膜的预处理钛片中随机选取9个试件组成对照组。随后各组钛片被依次放入丙酮、无水乙醇、蒸馏水中进行超声清洗各10min，用气枪吹干，密封备用。
实验选用变性链球菌菌株、白色念珠菌菌株和粘性放线菌菌株作为实验菌种。将上述三种菌种在培养液中培养完成后，制成浓度为1.5×107个/ml的细菌悬液，随后将三种菌液分别接种到实验组和对照组试件的测试面上，然后接种到琼脂培养基上培养24h。最后，待培养结束时进行菌落记数。实验的过程重复3次，取每个试样3次菌落记数的均值进行分析。菌落计数结果如表3所示。
由表3可知，三种细菌的粘附情况均表明，对照组的细菌粘附数量明显高于实验组。将纳米碳晶应用于义齿材料的表面处理，其主要目的是改善义齿材料的表面性能，提高义齿的质量和使用寿命，减少或避免与义齿有关的临床并发症以及不良反应。细菌在义齿表面的粘附很容易导致义齿性口炎、牙龈炎、龋病、口腔异味等不良后果，严重威胁患者的身心健康，因此，改善义齿材料细菌粘附性能具有重要的临床意义。本实验结果表明，经过纳米碳晶薄膜表面处理后，义齿材料表面变性链球菌、白色念珠菌以及粘性放线菌的粘附水平出现明显的下降，由此可知，纳米碳晶薄膜可以显著减少牙科纯钛表面变性链球菌、白色念珠菌以及粘性放线菌的粘附数量，从而改善该金属表面的细菌粘附性能。