具有双功能的脂质材料及制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法

本发明属于制药领域，涉及具有双功能作用的脂质材料合成、载药纳米粒制备和在制备抗肿瘤靶向纳米药物中的应用。
背景技术：
癌症目前仍是横亘于人类健康面前的巨大障碍和极大威胁，在我国癌症已经成为城市居民的首位死因，根据美国癌症协会2017年最新年度数据预测2017年美国将会有近169万新增肿瘤病例和60多万死亡人数,抗癌药物的发展成为了全世界医药行业的当务之急。化学治疗仍然是恶性肿瘤治疗最常用的方法，但化疗的安全性与耐药性问题仍然是治疗路上的绊脚石，固有的或获得性的耐药在临床上造成了超过90％的治疗失败。为了解决化疗药物的安全性、低疗效问题，药物制剂研究工作者通过制剂手段---纳米给药系统的设计帮助实现药物治疗高效、低毒的目的。因载体粒径呈纳米态,可透过细胞膜和穿透血脑屏障等,更有效地向靶器官、靶细胞和靶分子输送药物,起到更好的治疗效果。尺寸在10～1000nm的纳米给药系统远小于细胞器尺寸,使其可有效负载药物分子进入细胞或各种细胞器,并通过增强渗透和保留作用(enhancedpermeationandretention,epr)实现药物在肿瘤部位的蓄积。靶向修饰后的纳米给药系统可将药物浓集于病杜部位实现靶向治疗。靶向给药系统包括脂质体、聚合物胶束、树枝状聚合物、聚合物前药、纳米囊、纳米球以及脂质纳米粒等。近十几年来，脂质纳米粒已经被用于提高许多难递送药物的口服生物利用度，受到很大关注。脂质纳米粒以脂质为载体，药物吸附或包裹于脂质核中，形成脂质纳米给药系统，具有良好的生理相容性，可提高不稳定药物的稳定性，包载难溶性药物，同时也适用于一些亲水性的多肽药物，核酸如microrna和药物联合治疗等。其具有缓控释、长效作用，适合于静脉注射、口服等多种途径给药。可采用一定比例的液态油或混合脂质可克服固体脂质材料结晶度高、载药量低等特点。也可对纳米粒表面进行修饰，改善动物体内分布，起到肿瘤靶向及增强药效的作用，兼具脂质体与聚合物纳米粒的优势。同时与其他纳米载体材料相比，脂质材料结构简单，材料安全，主要包括单甘酯，双甘酯，其他类甘油酯，磷脂，鞘脂类等，具有极高的生物安全性、生产规模性。但脂质纳米给药系统存在双相药物释放的特点，前期突释，后期缓释，体外释放可进行到96h,不能在肿瘤部位实现敏感释放，这可能是影响包载化疗药物脂质纳米粒并没有非常杰出的药效结果的原因之一。在维持体系稳定和促进靶部位药物释放的问题上,传统的纳米给药系统并不十分理想。因此有关智能型药物递释系统的设计已逐渐成为药剂学领域的研究热点之一。环境响应性药物递释系统可针对肿瘤与正常组织的生理差异,在维持其体循环稳定的同时,特异性响应物理(如光敏感)、化学(如针对肿瘤内部偏酸性而设计的ph敏感，针对肿瘤细胞内高还原物质浓度设计的还原敏感)、生物(如基质金属蛋白酶)等内源性或外源性的刺激,在接近药物作用位点位置,响应内外环境条件,触发释放药物,选择性地富集于肿瘤组织,实现靶部位的环境响应性药物递释,提高抗肿瘤疗效并降低毒副作用。但目前通过这些手段进行改造的药物递释系统主要是结构有较大可调控改造性的聚合物胶束，及具有光热敏感、还原敏感特性的脂质体，少有具有敏感特性的脂质纳米粒的报道，我们设想能通过脂质材料的结构改造设计敏感特性。针对化疗过程中固有的或获得性的耐药问题，大量体外研究已证实abc转运蛋白如p-糖蛋白(p-gp)和多药耐药蛋白(mrp)在药物外排方面起到的作用，这些蛋白能主动转运药物出细胞尤其是天然疏水性药物如紫杉烷,蒽环类和长春碱类。与多药耐药相关的p-gp蛋白在很多耐药细胞和许多白血病和实体瘤中都被发现存在过表达。在天然产物中研究表明黄酮类物质有很好的抑制p-gp作用。槲皮素是在大量植物果实，根，茎，花中发现的丰富存在的天然多酚类黄酮，有多种生理活性，如诱导凋亡，血管生成抑制，抑制癌细胞和氧化应激、突变的活性。许多研究证明槲皮素能有效抑制abc转运子，如p-gp，mrp1和bcrp。有研究报道槲皮素能直接与纯化的p-gp蛋白相互作用，有效抑制其活性。它也能以剂量依赖的方式下调p-gp表达，经研究是通过抑制热休克蛋白-dna结合行为或抑制β-连环蛋白信号通路。已有研究将槲皮素用于壳寡糖胶束结构改造并取得了很好的p-gp抑制效果。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供一种具有双功能的脂质材料，是一种槲皮素-脂质分子通过二硫键共价结合的脂质材料，具有如下结构式：其中：r1和r2代表h或当脂质分子为辛癸酸甘油酯时，r1中n＝7，r2中n＝9。除了辛癸酸甘油酯还可以选用其他含羟基脂质；当脂质分子为单硬脂酸甘油酯时，r1中n＝17，r2为h；当脂质分子为山嵛酸甘油酯时，r1中n＝21，r2为h。包括且并不局限于以下几种，如单硬脂酸甘油酯、山嵛酸甘油酯等。本发明的第二个目的是提供所述槲皮素-脂质分子的合成方法，通过以下步骤实现：以摩尔数为单位份数，称取1份3,3'-二硫代二丙酸(3,3'-dithiodipropionicacid,dtpa)，0.2份4-二甲基氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine,dmap)和1份1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,edc)溶于无水n,n-二甲基甲酰胺(n,n-dimethylformamide,dmf)，45℃恒温水浴搅拌30min以活化dtpa的一端羧基，活化结束后加入1份槲皮素，氮气保护反应12h。完成后于反应中继续加入1份dmap和1份edc活化dtpa另一端的羧基，30min后加入1份脂质分子，氮气保护反应12h。反应完成后将反应液倒入冰水中析出沉淀，离心(4000rpm，10min)得到沉淀进行冻干。冻干后样品以洗脱剂为二氯甲烷：甲醇(25：1，v/v)作为洗脱剂，通过硅胶柱层析进行纯化，得到槲皮素-脂质分子通过二硫键共价结合的脂质材料。其中按照摩尔比1:1选用槲皮素与脂质分子。所述脂质分子为含羟基脂质分子，选用辛癸酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、山嵛酸甘油酯等。以辛癸酸甘油酯为例的合成路线如下：本发明的第三个目的是提供载紫杉醇脂质纳米粒，通过以下步骤实现：采用溶剂扩散法制备载紫杉醇槲皮素-脂质分子的脂质纳米粒，将10mg槲皮素-脂质分子，0.5～3mg紫杉醇溶于1ml无水乙醇，于70℃恒温水浴搅拌溶解作为有机相，水相为10ml含有0.1％泊洛沙姆188的水溶液，70℃恒温水浴加热。将有机相快速均匀注入水相中，加热搅拌5min，冷却至室温，即得到所需载紫杉醇脂质纳米粒。所述脂质分子选用辛癸酸甘油酯脂质、槲皮素-单硬脂酸甘油酯脂质、槲皮素-山嵛酸甘油酯脂质。本发明的第四个目的是提供载紫杉醇脂质纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。结果表明载紫杉醇脂质纳米粒具有还原响应释放药物的特点，在高浓度还原条件下载体快速裂解，大量完全地释放药物。同时裂解产生的槲皮素具有p-gp抑制作用。本发明的有益之处是：通过槲皮素与脂质的二硫键连接，实现了脂质纳米粒在肿瘤细胞内高浓度还原物质下的响应性裂解，快速释放大量游离药物与靶作用点结合发挥药效，而在正常细胞内不会产生明显的载体裂解，不会快速释放游离药物，对正常细胞的安全性较好。同时裂解后产生的槲皮素能够与p-gp结合，抑制p-gp，从而减少了肿瘤细胞对游离药物的外排，增加了药物的胞内滞留，有利于提高疗效。附图说明图1是槲皮素(qu)，dtpa，辛癸酸甘油酯(gcc)，槲皮素-辛癸酸甘油酯脂质(qu-ss-gcc)核磁共振碳谱图。图2是不同浓度还原物质条件下(0，1，10mm谷胱甘肽)，载紫杉醇的槲皮素-辛癸酸甘油酯脂质纳米粒的释放情况。图3是未经处理(a)和经槲皮素-辛癸酸甘油酯脂质纳米粒共孵育后(b)，人乳腺癌耐药细胞mcf-7/adr中p-gp的表达变化。标尺，20μm。具体实施方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例一：槲皮素-辛癸酸甘油酯脂质合成与验证精密称取178mg3,3'-二硫代二丙酸(3,3'-dithiodipropionicacid,dtpa)，24.2mg4-二甲基氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine,dmap)和192mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,edc)溶于10ml无水n,n-二甲基甲酰胺(n,n-dimethylformamide,dmf)，45℃恒温水浴搅拌30min以活化dtpa的一端羧基，活化结束后加入302mg槲皮素，氮气保护反应12h。完成后于反应中继续加入24.2mgdmap和192mgedc活化dtpa另一端的羧基，30min后加入373mg辛癸酸甘油酯，氮气保护反应12h。反应完成后将反应液倒入100ml冰水中析出沉淀，离心(4000rpm，10min)得到沉淀进行冻干。冻干后样品以洗脱剂为二氯甲烷：甲醇(25：1，v/v)作为洗脱剂，通过硅胶柱层析进行纯化，得到目的产物槲皮素-辛癸酸甘油酯脂质。对产物进行核磁共振碳谱分析。因为槲皮素中7位羟基的活性最强，发生反应的可能性最大，经过薄层色谱监测和过柱纯化，核磁共振碳谱结果如图1，槲皮素-辛癸酸甘油酯中槲皮素的7位碳往高场发生了位移，说明槲皮素的7位羟基参与了反应，且槲皮素-辛癸酸甘油酯成功合成。实施例二：槲皮素-单硬脂酸甘油酯脂质合成精密称取178mg3,3'-二硫代二丙酸(3,3'-dithiodipropionicacid,dtpa)，24.2mg4-二甲基氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine,dmap)和192mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,edc)溶于10ml无水n,n-二甲基甲酰胺(n,n-dimethylformamide,dmf)，45℃恒温水浴搅拌30min以活化dtpa的一端羧基，活化结束后加入302mg槲皮素，氮气保护反应12h。完成后于反应中继续加入24.2mgdmap和192mgedc活化dtpa另一端的羧基，30min后加入359mg单硬脂酸甘油酯，氮气保护反应12h。反应完成后将反应液倒入100ml冰水中析出沉淀，离心(4000rpm，10min)得到沉淀进行冻干。冻干后样品以洗脱剂为二氯甲烷：甲醇(25：1，v/v)作为洗脱剂，通过硅胶柱层析进行纯化，得到槲皮素-单硬脂酸甘油酯脂质。对产物进行核磁共振氢谱分析。实施例三：槲皮素-山嵛酸甘油酯脂质合成精密称取178mg3,3'-二硫代二丙酸(3,3'-dithiodipropionicacid,dtpa)，24.2mg4-二甲基氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine,dmap)和192mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,edc)溶于10ml无水n,n-二甲基甲酰胺(n,n-dimethylformamide,dmf)，45℃恒温水浴搅拌30min以活化dtpa的一端羧基，活化结束后加入302mg槲皮素，氮气保护反应12h。完成后于反应中继续加入24.2mgdmap和192mgedc活化dtpa另一端的羧基，30min后加入412mg山嵛酸甘油酯，氮气保护反应12h。反应完成后将反应液倒入100ml冰水中析出沉淀，离心(4000rpm，10min)得到沉淀进行冻干。冻干后样品以洗脱剂为二氯甲烷：甲醇(25：1，v/v)作为洗脱剂，通过硅胶柱层析进行纯化，得到槲皮素-山嵛酸甘油酯脂质。实施例四：载药脂质纳米粒的制备采用溶剂扩散法制备载紫杉醇脂质纳米粒。脂质合成方法如实施例一，二和三，将10mg槲皮素-辛癸酸甘油酯脂质(或槲皮素-单硬脂酸甘油酯脂质，或槲皮素-山嵛酸甘油酯脂质)，0.5～3mg紫杉醇溶于1ml无水乙醇，于70℃恒温水浴搅拌溶解作为有机相。水相为10ml含有0.1％泊洛沙姆188的水溶液，70℃恒温水浴加热。将有机相快速均匀注入水相中，加热搅拌5min，冷却至室温，即得到所需载紫杉醇脂质纳米粒。对载药纳米粒的粒径大小、包封率、载药量进行测定。不同投药量的载紫杉醇槲皮素-辛癸酸甘油酯脂质纳米粒的粒径、包封率、载药量如表1所示。表1不同投药量的载紫杉醇槲皮素-辛癸酸甘油酯脂质纳米粒的粒径、包封率、载药量投药量(％)粒径(nm)多分散系数包封率(％)载药量(％)590.4±2.00.13694.6±0.74.5±0.0310100.5±3.30.18893.5±0.98.6±0.120199.0±11.10.27889.2±1.515.1±0.230293.3±21.70.34687.9±1.920.9±0.4实施例五：脂质纳米粒的还原敏感释药脂质合成方法如实施例一，载药脂质纳米粒的制备方法如实施例四。制得投药量为10％的载紫杉醇槲皮素-辛癸酸甘油酯脂质纳米粒溶液。脂质纳米粒以含0.2％吐温-80的磷酸缓冲液(pbs)为释放介质,确保ptx释放符合漏槽条件。移取载紫杉醇槲皮素-辛癸酸甘油酯脂质纳米粒溶液1ml至透析袋(截留分子量7kda)中,置于含有不同浓度还原型谷胱甘肽(0mm,1mm,10mm)的释放介质中,37℃恒温振荡(100rpm)。在预设的时间点取样,并替换新鲜释放介质。样品经0.22μm微孔滤膜过滤,hplc法测定ptx浓度，得到不同浓度gsh条件下载紫杉醇槲皮素-辛癸酸甘油酯脂质纳米粒的释药能力差异。不同浓度gsh条件下载紫杉醇槲皮素-辛癸酸甘油酯脂质纳米粒的释药情况如图2。结果显示，在10mmgsh条件下，载紫杉醇在48h内药物释放量达到约95％，而在0mm和1mmgsh中差异不大，48h内药物释放量约为65％,说明具有载紫杉醇槲皮素-辛癸酸甘油酯脂质纳米粒具有还原敏感释放的作用。实施例六：脂质纳米粒的p-gp抑制脂质合成方法如实施例一，脂质纳米粒的制备方法如实施例四,制得槲皮素-辛癸酸甘油酯脂质纳米粒。取生长状态良好的p-gp多表达的人乳腺癌耐药细胞(mcf-7/adr),以3x104/ml密度接种至24孔板内培养12h，与50μm槲皮素-辛癸酸甘油酯脂质纳米粒共孵育作用12h后进行hoechst33342核染，pbs清洗3次，4％多聚甲醛固定，pbs再次清洗，2％bsa封闭1h后，加入适当稀释的p-gp一抗，室温孵育4h，pbs清洗除去未结合的抗体，加入绿色荧光标记的二抗，继续孵育2h，激光共聚焦显微镜观察比较。激光共聚焦显微镜结果如图3，经槲皮素-辛癸酸甘油酯脂质纳米粒共孵育后mcf-7/adr的p-gp免疫荧光减弱，说明槲皮素-辛癸酸甘油酯脂质纳米粒能够对mcf-7/adr表面的p-gp进行抑制。当前第1页12