Jolkinol型（Ⅱ-2a）千金烷型二萜在逆转肿瘤多药耐药中的应用的制作方法

本发明属于植物药用成分和逆转肿瘤多药耐药技术领域，特别涉及jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜在逆转肿瘤多药耐药中的应用。

背景技术

据国家癌症中心发布的《2017中国癌症报告》显示，我国每天约有1万人确诊癌症，而癌症总人数将近占全球癌症患者总数的40％，而目前化疗仍是主要有效治疗恶性肿瘤的方法，如果在患者体内有残存的肿瘤干细胞，则容易形成耐药性，常常导致对阿霉素、紫杉醇等药物的敏感性降低，并引起肿瘤的复发以及转移。据美国癌症协会估计，90％以上的癌症患者均死于不同程度的耐药。虽然国内外相关的研究者相继发现了多种钙离子拮抗剂、双苄基异喹啉类生物碱和环孢菌素a的衍生物等能在体外能够逆转肿瘤多药耐药(mdr)的活性，但是，由于这些药物对脏器的毒性过大，影响药物在体内的分布及代谢等，因此大多数没有能进入临床研究，最终成为治疗药物。而我国物种丰富，中药更是有着悠久的历史，因此，利用提取分离技术有利于从中国传统中药中得到逆转肿瘤多药耐药的化合物。

千金子，大戟科植物，又名千两金，菩萨豆，续随子等，始载于《蜀本草》，具有治疗水肿、毒蛇咬伤、血吸虫病腹水的功效。现代药理学实验表明，从千金子中分离得到单体化合物可治疗白血病、用于美白、生发等，从千金子中分离得到的jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜，目前尚未发现关于逆转肿瘤多药耐药的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜新的医药用途，即在逆转肿瘤多药耐药中的应用。

所述应用是以jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜为活性成分与其它活性成分配合使用发挥逆转肿瘤多药耐药的药理作用，更具体的是在以逆转肿瘤多药耐药现象为目的的调节剂的应用，以化疗药物为主要成分，调节剂为辅治疗癌症。

所述应用是以jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜与抗肿瘤药物如阿霉素、紫杉醇等配合使用发挥逆转肿瘤多药耐药的药理作用。

所述应用是以jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜为主，加入硬脂酸镁等润滑剂、羧甲基淀粉钠等崩解剂、乳糖等填充剂以及其它辅料，可以制成胶囊、滴丸、片剂、注射剂等多种形式。

所述jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜是从千金子(euphorbialathyris)中分离得到的活性成分，具有如下结构：

所述jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜是从千金子中提取分离方法主要采用乙醇、石油醚、硅胶等廉价易得的原料进行提取分离，工艺简单，容易操作，可用于工业化生产。

本发明利用体外逆转肿瘤多药耐药模型，通过mtt实验评估jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜对细胞株增殖的影响，jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜对正常细胞没有细胞毒性，应用于肝癌hepg2/adr细胞结果显示，jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜在单独作用于hepg2/adr细胞株时，对其增殖没有抑制作用，而当jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜与阿霉素或紫杉醇联用时，hepg2/adr细胞活度明显下降，说明jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜具有逆转肿瘤多药耐药的药理活性，具有潜在的应用价值。

本发明jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜能够显著抑制人肝癌抗肿瘤药物如阿霉素、紫杉醇等耐药细胞的增殖，考虑到其安全性高、易分离获得，jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜可作为一类逆转肿瘤多药耐药的调节剂，适合推广应用。

附图说明

图1为实施例2中jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜对hepg2/adr细胞株的细胞活度影响结果示意图；

图2为实施例3中jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜(20μmol/l)与阿霉素(20μmol/l)联用时对肝癌耐药株hepg2/adr的细胞活度影响结果示意图；

图3为实施例3中jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜(0.8μmol/l)与不同浓度阿霉素联用时对肝癌耐药株hepg2/adr的细胞活度影响结果示意图；

图4为实施例3中jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜(4μmol/l)与不同浓度阿霉素联用时对肝癌耐药株hepg2/adr的细胞活度影响结果示意图；

图5为实施例3中jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜(20μmol/l)与不同浓度阿霉素联用时对肝癌耐药株hepg2/adr的细胞活度影响结果示意图。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本实施例中试剂如无特殊说明的，均为常规市售试剂或按常规方法制备的试剂。

实施例1

jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜的提取，具体步骤如下：

(1)取干燥的千金子种子，用体积分数95％乙醇溶液室温浸泡3次，首次浸泡时间为48h，第二次、第三次浸泡时间为24h，合并三次提取液后，减压回收乙醇，之后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物；

(2)将石油醚萃取物上硅胶柱，先收集纯丙酮、甲醇洗脱下来的样品并称重，之后再重新拌硅胶上柱，并用体积比为50:1至0:1的石油醚/丙酮依次进行梯度洗脱，收集洗脱液，最终得到7个部分的分离液，编号为fr1～fr7，之后，将编号为fr3的分离液半制备hplc，最终得到jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜，其结构如下所示。

将编号为fr4的分离液过sephadexlx-20色谱柱，用体积比为1:1的氯仿/甲醇进行洗脱，收集洗脱液，并编号(fr4.1～fr4.3)；然后将fr4.3分离液用ods梯度洗脱，洗脱剂为50％、75％、85％、90％的甲醇水，收集洗脱液，编号为fr4.3.1～fr4.3.6，最后将fr4.3.5分离液用硅胶柱分离纯化，石油醚/丙酮(30:1)体系洗脱后，对fr4.3.5.2部分进行半制备hplc，得到jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜，其结构如下所示，与编号为fr3的分离液提取的相同。

实施例2

jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜体外毒性评估实验(噻唑蓝法)，采用的是实施例1提取的jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜，具体步骤如下：

(1)取对数期生长的hepg2/adr细胞，细胞计数稀释后在96孔板中每孔加入100μl细胞悬液(1×10⁴个/孔)，待细胞贴壁后，将细胞分成三组，即空白对照组、阳性对照组、实验组：

①空白对照组加入完全培养基；

②阳性对照组为20μmol/l阿霉素与20μmol/l维拉帕米联用；

③实验组加入20μmol/l化合物即jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜，下同；

每组设置3个复孔，加药后继续培养48h，之后加入5mg/ml噻唑蓝(mtt)，重新放回培养箱孵育4h后，然后每孔加入120μl的二甲基亚砜(dmso)溶解甲瓒，最后用酶标仪在490nm波长处检测每孔的吸光值；并通过spss软件分别计算细胞活度。

图1为jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜对hepg2/adr细胞株的影响结果示意图，从图中可知，20μmol/l的jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜对hepg2/adr细胞的增殖无明显影响，20μmol/l阿霉素与20μmol/l维拉帕米联用却能明显抑制肝癌耐药株hepg2/adr细胞的增殖。

实施例3

jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜体外逆转肿瘤多药耐药实验，采用的是实施例1提取的jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜，具体步骤如下：

(1)取对数生长期的hepg2/adr细胞，接种于96孔板中，接种密度、培养条件、等均与实施例2相同，待细胞贴壁后，将细胞分成空白对照组、阳性对照组、阴性对照组和实验组；

①空白对照组加入完全培养基；

②阳性对照组选用维拉帕米与阿霉素联用，终浓度均为20μmol/l；

③阴性对照组为化合物(终浓度分别为0.8μmol/l，4μmol/l，20μmol/l)；

④实验组ⅰ浓度为0.8μmol/l化合物与不同浓度的阿霉素(终浓度分别为40μmol/l，20μmol/l，5μmol/l，1.25μmol/l，0.3125μmol/l)联用；

实验组ⅱ浓度为4μmol/l化合物与不同浓度的阿霉素(终浓度分别为40μmol/l，20μmol/l，5μmol/l，1.25μmol/l，0.3125μmol/l)联用；

实验组ⅲ浓度为20μmol/l化合物与不同浓度的阿霉素(终浓度分别为40μmol/l，20μmol/l，5μmol/l，1.25μmol/l，0.3125μmol/l)联用；

(2)将各个分组继续培养48h后进行检测，检测条件及数据处理方法与实施例2一致；其中逆转倍数(rf)＝化合物与阿霉素联用的ic50/只加阿霉素的ic50。

图2为jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜(20μmol/l)与阿霉素(20μmol/l)联用时对肝癌耐药株hepg2/adr的影响结果示意图，从图中可知，实验结果显示，当20μmol/l的jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜与20μmol/l的阿霉素联合作用时，人肝癌阿霉素耐药株的细胞活度明显下降，比20μmol/l阿霉素与20μmol/l维拉帕米联用更能明显抑制肝癌耐药株hepg2/adr细胞的增殖。

图3为jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜(0.8μmol/l)与不同浓度阿霉素联用时对肝癌耐药株hepg2/adr的影响结果示意图，从图中可知，实验结果显示，jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜在0.8μmol/l时能在一定程度上抑制肝癌耐药株hepg2/adr的增殖，通过软件处理所得的数值可得出其ic50为159μmol/l，根据上述逆转倍数计算公式可得rf为4.5。

图4为jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜(4μmol/l)与不同浓度阿霉素联用时对肝癌耐药株hepg2/adr的影响结果示意图，从图中可知，实验结果显示，联合用药后能降低肝癌耐药株hepg2/adr的细胞活度，通过软件处理所得的数值可得出其ic50为26.03μmol/l，根据上述逆转倍数计算公式可得rf为28。

图5为jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜(20μmol/l)与不同浓度阿霉素联用时对肝癌耐药株hepg2/adr的影响结果示意图，从图中可知，实验结果显示，联合用药后能明显抑制肝癌耐药株hepg2/adr细胞的增殖，过软件处理所得的数值可得出其ic50为14.32μmol/l，根据上述逆转倍数计算公式可得rf为50。

以上实验结果显示，0.8μmol/l，4μmol/l，20μmol/l的jolkinol型(ⅱ-2a)千金烷型二萜与不同浓度的阿霉素联用时，能在不同程度上抑制肝癌耐药株hepg2/adr的增殖；其中在浓度为0.8μmol/l时，能在一定程度上逆转肿瘤的多药耐药，而在化合物浓度为20μmol/l时，能明显抑制肝癌阿霉素耐药株的多药耐药，即呈现浓度依赖性。

将阿霉素替换为紫杉醇等药物时，也可以得到和使用阿霉素同样的效果。