内皮祖细胞在制备治疗恢复期和/或后遗症期的缺血性脑卒中药物中的应用的制作方法

本发明涉及干细胞药物技术领域，特别涉及内皮祖细胞在制备治疗恢复期和/或后遗症期的缺血性脑卒中药物中的应用。

背景技术

脑卒中(cerebralstroke)，又称“中风”或“脑梗死”，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一种急性脑血管疾病，包括出血性卒中和缺血性卒中。其中缺血性卒中(ischemicstroke，is)的发病率高于出血性卒中，约占脑卒中总数的60～80％。缺血性脑卒中是严重危害人类健康的重大疾病，所以治疗缺血性脑卒中的意义重大。目前治疗缺血性脑卒中的方法主要是在发病的6小时内进行溶栓，防止血栓进展，同时进行抗凝、降纤、抗血小板聚集和保护脑细胞等辅助治疗。然而，对于恢复期和后遗症期的患者却缺乏根本有效的治疗手段。近年来，国内外学者提出了干细胞移植治疗脑卒中的手段，为治疗缺血性脑卒中的治疗开辟了新的途径，已有大量的临床研究和基础研究证实了干细胞治疗缺血性脑卒中的有效性和安全性。

1997年，asaharat等从人外周血中分离出一种具有干细胞和内皮细胞特性的细胞，这些细胞还能在体内通过整合至新生血管部位而参与缺血损伤后的血管再生，这些细胞被称为内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells,epcs)。epcs是源于脐带血、外周血或者骨髓组织的单核细胞，可以在体外培养，它们在细胞表面同时表达造血干细胞表面标志分子(cd34、cd133)和内皮细胞表面标记分子(cd31、kdr、vegfr2)，另外cd45、c-kit/cd117、cxcr4及ccr2也能被表达出来。它能增殖分化为成熟的血管内皮细胞，具备可修复受损伤微小血管的独特优势，当机体缺血、低氧或血管损伤刺激机体时，epcs会动员、迁移到缺血缺氧和损伤处，在血管损伤后内皮的修复和形成新生血管方面发挥着重要的作用。同时，epcs能通过旁分泌作用分泌血管内皮生因子、成纤维细胞生长因子-2、粒细胞克隆刺激因子等，进而促进血管生长和神经恢复。因此，在缺血性脑卒中中，epcs可以参与受损血管内皮的修复和新生血管的形成，促进侧支循环的建立，为神经生长提供血液环境，进而促进神经生长，给脑卒中的治疗带来新的希望。

在急性卒中发生时，依靠机体内源性epcs的代偿修复能力很难形成足够的新生血管网来支持神经功能的恢复，而外源性epcs又受制于供体来源的影响，获取得到的epcs数量有限，致使目前epcs临床推广应用存在一定局限性。目前对于epcs治疗缺血性脑卒中的效果，以及是否有利于恢复期和后遗症期的神经功能缺损的恢复仍有待于探究。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了内皮祖细胞在制备治疗恢复期和/或后遗症期的缺血性脑卒中药物中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了内皮祖细胞在制备治疗恢复期和/或后遗症期的缺血性脑卒中药物中的应用。

作为优选，内皮祖细胞为脐血来源的内皮祖细胞。

作为优选，内皮祖细胞为p3代的内皮祖细胞。

作为优选，治疗恢复期和/或后遗症期的缺血性脑卒中药物还包括药学上可接受的辅料。

作为优选，治疗恢复期和/或后遗症期的缺血性脑卒中药物的剂型为注射剂。

作为优选，注射剂中内皮祖细胞的密度为(1～10)×10⁶cell/ml。

作为优选，注射剂的溶媒为氯化钠注射液、葡萄糖注射液或氨基酸注射液。

作为优选，注射剂的输注方式为静脉滴注。

作为优选，治疗恢复期和/或后遗症期的缺血性脑卒中药物还包括用于治疗缺血性脑卒中的其它药物。

本发明提供了内皮祖细胞在制备治疗恢复期和/或后遗症期的缺血性脑卒中药物中的应用。本发明具有的技术效果为：

(1)本发明采用的是脐血来源的epcs，通过有效的分离培养方法可得到足量的epcs细胞；

(2)本发明采用的是静脉滴注epcs的方法，因为此方法简单快捷，并发症少；

(3)本发明利用脐血epcs制备出一种治疗恢复期和后遗症期缺血性脑卒中患者的制剂，能够有效改善患者的症状。

附图说明

图1示镜下观察的epcs细胞克隆(40×)；

图2示镜下观察的epcs细胞形态(100×)；

图3示p3代epcs细胞的流式检测结果。

具体实施方式

本发明公开了内皮祖细胞在制备治疗恢复期和/或后遗症期的缺血性脑卒中药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

术语解释：

内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells,epcs)是源于脐带血、外周血或者骨髓组织的单核细胞，可以在体外培养，它们在细胞表面同时表达造血干细胞表面标志分子(cd34、cd133)和内皮细胞表面标记分子(cd31、kdr、vegfr2)，另外cd45、c-kit/cd117、cxcr4及ccr2也能被表达出来。它能增殖分化为成熟的血管内皮细胞，具备可修复受损伤微小血管的独特优势，当机体缺血、低氧或血管损伤刺激机体时，epcs会动员、迁移到缺血缺氧和损伤处，在血管损伤后内皮的修复和形成新生血管方面发挥着重要的作用。

本发明提供的内皮祖细胞在制备治疗恢复期和/或后遗症期的缺血性脑卒中药物中的应用中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1、制备脐血epcs制剂

1、铺板：用生理盐水将纤连蛋白(sigma公司，#f2006)稀释至10μg/ml包被10cm(5ml/皿)细胞培养皿，37℃孵育45min以上；

2、原代epcs细胞分离培养：按照1：1比例加入生理盐水稀释脐血，将稀释后的脐血按2∶1缓慢加入到含有淋巴细胞分离液的50ml离心管中，800g室温离心30min(取消升降速)，然后吸出单个核细胞层于新的离心管中，加入生理盐水至50ml，500g离心10min洗涤1次，留细胞沉淀弃上清，用生理盐水(40ml)重悬细胞沉淀并充分混匀，计数，然后再离心(500g,10min)，弃上清，用egm-2mv培养基(lonza公司，#cc3202)调整细胞密度为1.5×10⁶/cm²，接种于培养皿(10ml/孔)，放入培养箱中培养，隔天进行换液；

3、p0代epcs细胞传代培养：根据epcs细胞的克隆生长情况，于培养第10至14天进行传代培养。利用0.05％胰酶-edta消化收集细胞，500g离心5min，弃上清、计数，然后利用egm-2mv培养基重悬细胞，按照2.0×10⁴/cm²传到10cm培养皿中，放入培养箱中培养；

4、p1代epcs细胞传代培养：待原代epcs细胞培养至细胞汇合点达到约90％后，利用0.05％胰酶-edta消化收集细胞，500g离心5min，弃上清、计数后，利用egm-2mv培养基重悬细胞，按照1.0×10⁴/cm²传到15cm培养皿培养，待epcs细胞培养至细胞汇合点达到约90％后，按上述步骤进行后续的传代培养；

5、epcs细胞流式检测：取1×10⁵个生长状态良好的epcs细胞与1％bsa稀释的抗体cd34-fitc、cd133-fitc和cd309-fitc(100μl/管)，在冰上避光孵育40分钟，继而加入1ml的pbs洗2次，混匀后1500r/min离心5分钟，弃上清，再加入500μlpbs重悬细胞，然后利用流式细胞仪分析。

结果显示：在光学显微镜下观察原代epcs细胞大约培养至第4-8天后可见epcs克隆出现(见图1)，约继续培养至第12-14天，镜下可见细胞克隆数较多，且扩增明显；待原代epcs培养至细胞汇合点达到约90％后进行细胞传代，可得到形态均一，呈梭形的epcs细胞(见图2)。流式结果发现epcs细胞的cd34阳性率为21.0％、cd133的阳性率为0.4％、cd309的阳性率为89.7％(见图3)。

实施例2、治疗恢复期和后遗症期的缺血性脑卒中患者

本实施例通过公开招募纳入恢复期和后遗症期的缺血性脑卒中患者，其纳入标准为：⑴18～65周岁的脑梗死患者(发病时间≤3年)，性别不限；⑵经影像学确诊大脑中动脉供血区域的明确脑梗死灶；⑶有明确的神经功能缺损表现，如运动、认知等功能障碍(美国国立卫生研究院卒中量表nihss＞7分)；⑷同意在研究期间采取有效避孕措施者，且育龄期妇女妊娠试验阴性；(5)签署患者知情同意书，并同意按照研究方案的要求参加所有的访视、检查和治疗。其排除标准为：⑴腔隙性脑梗塞；⑵急性期脑梗死，发病时间＜2周；⑶烟雾病、血管畸形、血管瘤、颈动脉狭窄超过70％，或存在主动脉弓斑块的患者；⑷严重心瓣膜病或确诊为顽固性房颤的患者；(5)合并颅内出血或肿瘤；⑹血液系统疾病所致脑梗死患者；⑺乙型肝炎病毒5项(hbsag、hbsab、hbeag、hbeab、hbcab)、丙型肝炎病毒(hcv)抗体、人免疫缺陷病毒(hiv)抗体以及梅毒螺旋体检查任意一项阳性者；⑻严重的呼吸系统或循环系统或肝肾功能不全无法耐受治疗和检查者；⑼近3个月内出现严重的发热性疾病或病毒性疾病；⑽恶性肿瘤；⑾自身免疫性疾病；⑿既往有药物过敏史；⒀妊娠或哺乳期妇女；⒁入组前3个月内正在参加或已参加过本研究或参加了其他临床试验者；⒂研究者认为不适合参与本研究的其他情况。

纳入患者后随机分为epcs治疗组和常规治疗组，其中常规治疗组给予调脂治疗(阿托伐他汀或瑞舒伐他汀)，抗血小板聚集(阿司匹林或氯吡格雷)；降低同型半胱胺酸(甲钴胺或叶酸治疗)；按标准治疗高血压和糖尿病等基础疾病；

而epcs治疗组在常规治疗的基础上移植epcs，具体方式为：采用静脉滴注移植p3代的epcs细胞，分两次移植，每次移植的剂量为2×10⁶/kg体重，每次体积为80ml±5ml，两次移植的时间间隔为1周。分别在移植前和移植治疗后第6和12个月进行美国国立卫生研究院卒中量表(nihss)、日常生活活动能力量表(barthel指数，bi)和改良rankin修订量表(mrs)评分。

其中，nihss量表主要应用在脑中风之神经方面严重度之评估检查的标准，其量表内容共有11项评估构面，包括意识水平、凝视功能、视野、面瘫、上肢运动功能、下肢运动功能、肢体协调、感觉功能、语言、构音和忽视，其评分范围为0-42分，分数越高表示神经受损越严重，0-1分表示正常或趋近于正常，1-4分表示轻微中风，5-15分表示中度中风，15-20分表示中重度中风，20分以上为重度中风，分数越高表示病况越严重。

而barthel指数记分主要适用于检测老年人治疗前后的独立生活活动能力变化，反映了老年人需要护理的程度，其量表将日常生活活动能力分成良、中、差三级：>60分为良，有轻度功能障碍，能独立完成部分日常活动，需要部分帮助；60～41分为中，有中度功能障碍，需要极大的帮助方能完成日常生活活动；≤40分为差，有重度功能障碍，大部分日常生活活动不能完成或需他人服侍。

另外，mrs量表主要适用于评价脑卒中患者预后状况，康复期患者功能残疾水平的疗效判定，其量表共分为7个等级：0分代表无症状；1分代表尽管有症状，但未见明显残障；能完成所有经常从事的职责和活动；2分代表轻度残障，不能完成所有以前能从事的活动，但能处理个人事务而不需帮助；3分代表中度残障，需要一些协助，但行走不需要协助；4分代表重度残障，离开他人协助不能行走，以及不能照顾自己的身体需要；5分代表严重残障，卧床不起、大小便失禁、须持续护理和照顾；6分代表死亡。

结果显示：本实施例共纳入20例患者，随机分为epcs治疗组和常规治疗组，每组10例，其患者的临床资料如下表1所示。两组患者的nihss评分、bi评分和mrs评分在治疗前相比无统计学差异(p＞0.05)，而在治疗后的第6个月和12个月比常规治疗组相比，epcs治疗组的疗效指标得到改善，差异具有统计学意义(p＜0.05)(见表2-3)。

因此，利用本发明的脐血epcs制剂治疗恢复期和后遗症期的缺血性脑卒中患者具有明显的疗效。

表1.两组患者的临床资料

表2.常规治疗组治疗前及治疗后的nihss、bi和mrs评分(n＝10)

表3.两组治疗前及治疗后的nihss、bi和mrs评分(n＝10)

注：^*1代表p＜0.05，与本组治疗前相比具有显著性差异；^*2代表p＜0.05，与常规治疗组同时间点相比具有显著性差异。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。