本发明属于水产品疾病防控领域，特别涉及一种防控南美白对虾急性肝胰腺坏死综合症的复合微生态制剂及其应用。
背景技术：
南美白对虾急性肝胰腺坏死综合症(ahpns)是以对虾肝胰腺坏死从而引发对虾突发性偷死为主要特征的一种疾病，是近年来影响对虾养殖最为严重的疾病之一。该病早期主要发生于对虾苗期，统称为早期死亡综合症(earlymortalitysyndrome，ems)。现已发现一些携带有特定致病基因的弧菌是导致该病发生的病原，其中主要是副溶血弧菌。tran等对从越南ahpns发病虾池中分离出1株哈维氏弧菌(vibrioharveyi)，浸泡感染后对虾死亡率达100％。joshi等从泰国病虾中分离出了数株副溶血弧菌，肌注感染对虾，其中一组24h内死亡100％，菌株检测均为ahpns阳性。liu在上海的ahpns发病虾池中分离出1株欧文斯氏弧菌，认为该菌株为ahpns致病菌株。xuan等认为从病虾体内分离的1株坎氏弧菌可导致ahpns的发生。
pirvpab基因编码的二元毒素是病原弧菌的主要毒力因子，产生的二元毒素结构与苏云金芽孢杆菌所产生的伴孢晶体结构相似，毒力效应也与苏云金芽孢杆菌cry蛋白毒力作用相似，都表现为插入宿主细胞膜上形成穿模孔洞，细胞内外渗透压发生改变，使靶细胞损伤甚至死亡。
已有部分科研人员开始着眼于微生态制剂的研发，但是专门针对南美白对虾急性肝胰腺坏死综合症的微生态制剂目前并没有任何文献发表。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种防控南美白对虾急性肝胰腺坏死综合症的复合微生态制剂及其应用，克服了现有产品中还没有专门针对南美白对虾急性肝胰腺坏死综合症的微生态制剂的缺陷。
本发明提供了一种防控南美白对虾急性肝胰腺坏死综合症的复合微生态制剂，所述复合生态制剂包括普罗威登斯菌(providenciasp.)和肠杆菌(enterobactersp.)；其中，普罗威登斯菌保藏号为cgmccno.15415，肠杆菌保藏号为cgmccno.15416。
本发明所采用的普罗威登斯菌(providenciasp.)，保藏单位名称：cgmcc中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmccno.15415，保藏日期为2018年3月6日。建议分类命名为：普罗威登斯菌(providenciasp.)。
本发明所采用的肠杆菌(enterobactersp.)，保藏单位名称：cgmcc中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmccno.15416，保藏日期为2018年3月6日。建议分类命名为：肠杆菌(enterobactersp.)。
所述普罗威登斯菌和肠杆菌分别培养至浓度1.0×108cfu/ml后混合备用。
采用的培养基配方为：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸高铁0.01g，乙酸钠3g，磷酸氢二钾1g，陈海水1000ml，ph值7.6～7.8。
所述普罗威登斯菌和肠杆菌经液体发酵后的配制比例为1:0.5-2。
所述普罗威登斯菌和肠杆菌占复合微生态制剂的比例为2-3％。
本发明还提供了防控南美白对虾急性肝胰腺坏死综合症的复合微生态制剂的应用，所述复合微生态制剂加入饲料中投喂。不可与抗生素混合使用，用量为：每公斤饲料添加复合微生态制剂20～40ml，饲喂周期3～5d。
本发明主要用于防控南美白对虾急性肝胰腺坏死综合症，抑制急性肝胰腺坏死致死性弧菌的生长，降低因急性肝胰腺坏死综合症导致的高死亡率。
普罗威登斯菌cgmccno.15415具有合成或半合成内酰胺抗生素活性物质的能力，能产生脂肽类抗菌物质，较强抑制南美白对虾致病菌。
肠杆菌cgmccno.15416可以调节肠道菌群平衡，能产类细菌素和乳酸，抑制病原菌生长，提高南美白对虾机体免疫力和抗病力。
两者按照本发明的比例组合使用能够使得引起南美白对虾急性肝胰腺坏死致病性副溶血性弧菌的抑制性能进一步增强，另外，两者搭配可以抑制江苏省范围内的10个细菌株型的南美白对虾急性肝胰腺坏死致病性副溶血性弧菌。而目前市场上已有的枯草芽孢杆菌和乳酸菌的组合仅可以一定程度上抑制常规的副溶血性弧菌，却无法抑制多个细菌株型的南美白对虾急性肝胰腺坏死致病性副溶血性弧。本发明两株细菌的组合，对江苏省范围内的10个细菌株型的南美白对虾急性肝胰腺坏死致病性副溶血性弧菌具有明确的特异性。
有益效果
本发明的复合微生态制剂具有较强的抑制副溶血性弧菌的功效，具有显著的应用效果，是实现南美白对虾绿色养殖的重要途径之一，具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
本实施例提供了一种复合微生态制剂，包括普罗威登斯菌(providenciasp.)和肠杆菌(enterobactersp.)；其中，普罗威登斯菌保藏号为cgmccno.15415，肠杆菌保藏号为cgmccno.15416。两种菌分别经液体发酵后按1:1比例配制而成。两种菌预先分别培养至浓度1.0×108cfu/ml后混合备用。其中，培养基配方为：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸高铁0.01g，乙酸钠3g，磷酸氢二钾1g，陈海水1000ml，ph值7.6～7.8。
复合微生态制剂的使用方法如下：
将普罗威登斯菌及肠杆菌培养混合液加入南美白对虾颗粒饲料，混合比例为1:50，将混匀的饲料投喂南美白对虾，并观察饵料台的吃食情况。每天上午8:00～9:00的当天首次投喂，每天投喂一次，喂食时间2小时，共投喂7d。
复合微生态制剂的效果实验如下：
一、抑制急性肝胰腺坏死致死性弧菌试验
试验选取江苏某地9个虾苗来源、生长状态一致的对虾养殖温棚，均感染爆发急性肝胰脏坏死综合症(约0.7亩/棚)，随机分为3组，对照一组按养殖户通常模式饲养(不添加任何微生态制剂)，对照二组在饲料中添加枯草芽孢杆菌和乳酸菌，试验组饲料中添加普罗威登斯菌和肠杆菌复合微生态制剂，在第0、1、3、5、7天取池塘中发病虾样(每个池塘取3处不同位置的虾样，取虾样中的肝胰脏，混匀)，采用分子生物学方法，对肝胰脏组织中的急性肝胰腺坏死致死性弧菌进行定性分析，同时观察对虾死亡情况。
表1水体中弧菌数量变化
注：不同字母表示差异显著(p<0.05)，相同字母表示差异不显著(p>0.05)
从表1中可以看出，对照一组未添加任何微生态制剂，虾体内急性肝胰腺坏死综合病病原一直存在，死亡个体数量极显著增加，至第5天全部死亡。对照二组使用枯草芽孢杆菌和乳酸菌作为复合微生态制，虾体内急性肝胰腺坏死综合病病原一直存在，死亡个体数量极显著增加，至第5天全部死亡，与对照一组没有显著性差异。试验组投喂复合微生态制剂第3天后，急性肝胰腺坏死综合病病原检测呈弱阳性，第5天后呈阴性，死亡个体从第3天后开始显著性减少，第7天未见死亡个体，与使用前相比差异显著(p<0.05)。由此可见，本实施例的使用效果显著优于对照组一和二。
二、致病性弧菌平板抑制实验
试验选取3株急性肝胰腺坏死综合症致死性弧菌，以噬弧菌、芽孢杆菌、乳酸菌及本复合菌发酵液设置拮抗实验。随机分为四组，第一对照组为噬菌体，第二对照组为芽孢杆菌，第三对照组为乳酸菌，实验组为本复合菌。3株病原菌从江苏省内发病虾分离、纯化，经分子生物学鉴定均含有急性肝胰腺坏死综合症毒力基因pira及pirb，编号为hys-ahpnd-1，hys-ahpnd-2，hys-ahpnd-3，三株菌以菌浓度为106cfu/ml涂布于lb平板上，以四种微生物发酵液(噬弧菌、芽孢杆菌、乳酸菌及本复合菌)做药敏纸片，28℃下培养48小时，测量抑菌圈的直径，实验结果见表2。结果表明，本发明的复合制剂对江苏三株南美白对虾急性肝胰腺坏死综合症致死性弧菌的抑菌效果极显著高于噬弧菌、芽孢杆菌、乳酸菌(p<0.01)。
表2菌株对南美白对虾急性肝胰腺坏死综合症致死性菌株的抑菌活性
注：不同字母表示差异显著(p<0.05)，相同字母表示差异不显著(p>0.05)。