本发明属于天然物质提取领域，具体涉及一种以多聚体多酚为主的荔枝皮总酚提取物及其应用。
背景技术：
美白祛斑一直是人们健康美丽的追求。肤色很大程度决定于黑色素的生成、移行和分布。目前，美白祛斑研究重点集中在阻断黑色素的形成。黑色素为高分子生物色素，皮肤细胞“生产”黑色素的起始原料是酪氨酸。酪氨酸是人体内非常普通的一种氨基酸，在黑素细胞黑素体内，酪氨酸由酪氨酸酶催化后生成多巴，多巴脱氢后形成多巴醌，并重新排列成5,6羟基吲哚，吲哚聚合后与黑素体内的结构蛋白相结合形成黑素蛋白。因此，抑制酪氨酸酶的活性是阻断黑色素的关键。在加工、贮藏及销售过程中，新鲜的水果蔬菜易发生褐变，其不仅影响果蔬的价值，同时也降低了果蔬内在的营养品质。目前很多国内外专家对酪氨酸酶进行了研究，认为植物组织中的褐变过程主要由此种酶引起。因此，抑制酪氨酸酶的活性可以阻止及延缓水果、蔬菜的褐变。
荔枝(litchichinensissonn.)营养价值高，风味独特，被誉为“岭南佳果”，具有荔枝多酚等多种活性物质，对降血压、降血脂、抗肿瘤、防止动脉粥样硬化、增强免疫力均有一定功效。荔枝多酚在荔枝果皮、叶、果肉中都有分布，荔枝果皮和果肉多酚提取已有大量报道，但是传统提取方法提取的多酚对酪氨酸酶的抑制活力较差，大大限制了广泛使用。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种以多聚体多酚为主的荔枝皮总酚提取物及其应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种以多聚体多酚为主的荔枝皮总酚提取物，由包括以下步骤的方法制备得到：
1)将新鲜荔枝果皮和体积浓度50％～90％乙醇水溶液在23～27℃条件下提取浸泡2～3次，每次提取浸泡7～8d，过滤，合并滤液；
2)将所述滤液固液分离，收集上清液，得到药液；
3)将所述药液进行柱层析纯化，用体积分数为40％～80％的乙醇水溶液洗脱，得到提取物洗脱液；所述柱层析纯化的条件包括：上样液质量浓度为1.0～4.0mg/ml，药液的ph值为2.5～5.0，上样速率为2～5bv/h；洗脱液的流速为2～8bv/h；
4)将所述提取物洗脱液在真空度95～99kpa、加热浴温度30～50℃和冷却水温度0℃～30℃的条件下进行减压浓缩，将得到的回流液进行喷雾干燥，得到以多聚体多酚为主的荔枝皮总酚提取物。
优选的，所述步骤2)中固液分离为离心；所述离心的转速为3500～4500rpm；所述离心的时间10～60min。
优选的，所述步骤1)中乙醇水溶液的体积浓度为80％。
优选的，所述步骤3)中洗脱用乙醇水溶液的体积浓度为60％。
优选的，所述步骤3)中洗脱的时间为1～3h。
优选的，所述洗脱液的流速为6bv/h。
优选的，所述步骤3)中柱层析纯化的条件包括：上样液质量浓度为3.5mg/ml，药液的ph值为4.5，上样速率为4bv/h。
本发明提供了所述的荔枝皮总酚提取物在美白化妆品或果蔬保鲜剂中的应用。
优选的，所述荔枝皮总酚提取物在美白化妆品中的有效浓度为1％～5％
优选的，所述荔枝皮总酚提取物在果蔬保鲜中的有效浓度为0.1％～1％。
本发明提供了一种以多聚体多酚为主的荔枝皮总酚提取物，包括以下步骤制备得到，采用体积浓度40％～80％乙醇水溶液在23～27℃条件下浸泡荔枝皮，提取的活性物质溶于乙醇水溶液中，得到的浸泡液经固液分离，去除杂质，得到溶液有多酚活性物质的药液；将所述药液经柱层析纯化，将提取的极性活性物质吸附在层析柱上，采用体积浓度为60％的乙醇水溶液洗脱，去除药液中不必要的极性活性物质，得到的洗脱液经浓缩和喷雾干燥制备得到以多聚体多酚为主的荔枝皮总酚提取物。本发明提供的以多聚体多酚为主的荔枝皮总酚提取物对酪氨酸酶的单酚酶和二分酶具有较强的抑制作用，其中对单酚酶的抑制率提高了13.62倍，对二分酶的抑制率提高了28.04倍。
基于上述制备的以多聚体多酚为主的荔枝皮总酚提取物对酪氨酸酶具有较强的抑制率，本发明提供了所述的荔枝皮总酚提取物在美白化妆品或果蔬保鲜剂中的应用。所述应用大大扩宽了荔枝皮总酚提取物在工业生产的价值，为美白化妆品和果蔬保鲜领域提供了新思路；同时本发明提供的应用大大减少了荔枝皮总酚提取物的使用量，降低了生产成本，使荔枝果皮原料得到充分利用。
附图说明
图1为荔枝皮总酚提取物各极性部分多酚含量比例图。
具体实施方式
本发明提供了一种以多聚体多酚为主的荔枝皮总酚提取物，由包括以下步骤的方法制备得到：
1)将新鲜荔枝果皮和体积浓度50％～90％乙醇水溶液在23～27℃条件下提取浸泡2～3次，每次提取浸泡7～8d，过滤，合并滤液；
2)将所述滤液固液分离，收集上清液，得到药液；
3)将所述药液进行柱层析纯化，用体积分数为40％～80％乙醇水溶液洗脱，得到提取物洗脱液；所述柱层析纯化的条件为：上样液质量浓度为用80％乙醇水溶液稀释至药液的浓度为1.0～4.0mg/ml，药液的ph值为2.5～5.0，上样速率为2～5bv/h；洗脱液的流速为2～8bv/h；
4)将所述提取物洗脱液在真空度95～99kpa、加热浴温度30℃～50℃和冷却水温度0～30℃的条件下进行减压浓缩，将得到的回流液进行喷雾干燥，得到以多聚体多酚为主的荔枝皮总酚提取物。
本发明将新鲜荔枝果皮和体积浓度50％～90％乙醇水溶液在23～27℃条件下提取2～3次，每次浸泡7～8d，过滤，合并滤液。
在本发明中，所述乙醇水溶液的体积浓度优选为80％。所述乙醇水溶液中乙醇优选为分析纯。本发明对所述乙醇的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的乙醇即可。所述新鲜荔枝果皮和乙醇水溶液的料液比没有特殊选限制，以新鲜荔枝果皮浸没在乙醇水溶液中即可。
在本发明中，所述提取的温度优选为24～26℃，更优选为25℃。所述提取温度有利于提取过程中保护极性活性物质不被高温破坏。
得到滤液后，本发明将所述滤液固液分离，收集上清液，得到药液。
在本发明中，所述固液分离优选为离心；所述离心的转速优选为3500～4500rpm，更优选为4000rpm。所述离心的时间优选为10～60min，更优选为30min。本发明对所述离心用仪器没有特殊限制，采用本领域所熟知的离心机即可。在本发明实施例中，所述离心用仪器为型号为tgl-16r型的高速冷冻离心机，购自珠海黑马医学仪器有限公司。
得到药液后，本发明将所述药液进行柱层析纯化，用体积分数为40％-80％乙醇水溶液洗脱，得到提取物洗脱液；所述柱层析纯化的条件为：上样液质量浓度为1.0～4.0mg/ml，药液的ph值为2.5～5.0，上样速率为2～5bv/h；洗脱液的流速为2～8bv/h。所述上样液质量浓度优选用80％乙醇水溶液稀释至药液至目标浓度。
在本发明中，所述柱层析纯化优选采用xda-7大孔树脂进行柱层析。所述柱层析纯化的条件优选为：上样液质量浓度为3.5mg/ml，药液的ph值为4.5，上样速率为4bv/h；洗脱液的流速为6bv/h。所述洗脱用乙醇水溶液的体积浓度优选为60％。所述洗脱的时间优选为1～3h。采用xda-7大孔树脂进行柱层析，吸附药用极性活性物质，当采用洗脱用乙醇水溶液洗脱时，将以多聚体多酚为主的多酚活性物质洗脱下来溶解到洗脱液中，部分极性物质残留在层析柱中，实现活性物质的分离。基于此，通过上述分离纯化操作，将部分活性物质从药液中去除，解除了活性物质间的拮抗作用，有利于以多聚体多酚为主的多酚活性物质发挥酪氨酸酶抑制作用，大大提高了抑制活性。
将所述提取物洗脱液在真空度95～99kpa，加热浴温度30～50℃，冷却水温度0～30℃的条件下进行减压浓缩，将得到的回流液进行喷雾干燥，得到以多聚体多酚为主的荔枝皮总酚提取物。
在本发明中，所述减压浓缩进一步分离多酚活性物质，并且具体限定了冷却水的温度，有目的地收集的回流液，保证目标物进一步分离纯化。
在本发明中，所述喷雾干燥的进料速率为51ml/min，进风温度160℃，排风温度60℃，料液浓度22％，雾化器转速21000r/min。
采用上述方法制备的荔枝皮总酚提取物对酪氨酸二酚酶的抑制浓度ic50为0.289～0.382μg/ml，较常规提取方法有极大的提高。
本发明提供了所述的荔枝皮总酚提取物在美白化妆品或果蔬保鲜剂中的应用。
在本发明中，所述荔枝皮总酚提取物在美白化妆品中的有效浓度优为1％～5％，更优选为1.5％。所述美白化妆品还包括化妆品可接受的辅料。本发明对所述化妆品的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的化妆品的制备工艺即可。所述美白化妆品的使用方法也没有特殊限制，采用本领域所熟知的美白化妆品的用法和用量即可。
在本发明中，所述荔枝皮总酚提取物在果蔬保鲜剂中的有效浓度优选为0.1％～1％，更优选为0.3％。所述果蔬保鲜应用时，优选将荔枝皮总酚提取物配制成有效浓度的果蔬保鲜剂。本发明将制备的果蔬保鲜剂喷在待保鲜的瓜果蔬菜上。所述喷液的使用量为1～20ml/kg。
下面结合实施例对本发明提供的一种以多聚体多酚为主的荔枝皮总酚提取物及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将新鲜荔枝果皮和体积浓度80％乙醇水溶液在23℃条件下提取2次，每次浸泡8d，过滤，合并滤液；将所述滤液3500rpm条件下离心10min，收集上清液，得到药液；将药液过xda-7大孔树脂进行柱层析纯化，用体积分数为60％乙醇水溶液洗脱，得到提取物洗脱液；所述柱层析纯化的条件为：上样液质量浓度为3.5mg/ml，药液的ph值为4.5，上样速率为4bv/h；洗脱液的流速为6bv/h；将所述提取物洗脱液在真空度95kpa，加热浴温度40℃，冷却水温度15℃的条件下进行减压浓缩，将得到的回流液进行喷雾干燥进料速率51ml/min，进风温度160℃，排风温度60℃，料液浓度22％，雾化器转速21000r/min，得到以多聚体多酚为主的荔枝皮总酚提取物。
采用folin-酚比色法进行测定，测得多酚含量为77.8％。
实施例2
将新鲜荔枝果皮和体积浓度80％乙醇水溶液在27℃条件下提取2次，每次浸泡8d，过滤，合并滤液；将所述滤液3500rpm条件下离心10min，收集上清液，得到药液；将药液过xda-7大孔树脂进行柱层析纯化，用体积分数为60％乙醇水溶液洗脱，得到提取物洗脱液；所述柱层析纯化的条件为：上样液质量浓度为4.5mg/ml，药液的ph值为3.5，上样速率为2bv/h；洗脱液的流速为3bv/h；将所述提取物洗脱液在真空度99kpa，加热浴温度40℃，冷却水温度0℃的条件下进行减压浓缩，将得到的回流液进行喷雾干燥进料速率51ml/min，进风温度160℃，排风温度60℃，料液浓度22％，雾化器转速21000r/min，得到以多聚体多酚为主的荔枝皮总酚提取物。
采用folin-酚比色法进行测定，测得多酚含量为78.1％。
实施例3
将新鲜荔枝果皮和体积浓度80％乙醇水溶液在25℃条件下提取2次，每次浸泡7d，过滤，合并滤液；将所述滤液3500rpm条件下离心10min，收集上清液，得到药液；将药液过xda-7大孔树脂进行柱层析纯化，用体积分数为60％乙醇水溶液洗脱，得到提取物洗脱液；所述柱层析纯化的条件为：上样液质量浓度为1.0mg/ml，药液的ph值为2.5，上样速率为5bv/h；洗脱液的流速为8bv/h；将所述提取物洗脱液在真空度97kpa，加热温度40℃，冷却水温度30℃的条件下进行减压浓缩，将得到的回流液进行喷雾干燥进料速率51ml/min，进风温度160℃，排风温度60℃，料液浓度22％，雾化器转速21000r/min，得到以多聚体多酚为主的荔枝皮总酚提取物。
采用folin-酚比色法进行测定，测得多酚含量为76.8％。
实施例4
取实施例1制备的荔枝皮总酚提取物，用5倍去离子水充分溶解，用正己烷、乙酸乙酯/无水乙醚(1:1)分步萃取，得到荔枝皮总酚提取物浸提液的正己烷相、乙酸乙酯/无水乙醚相和水相，分别测定此三相中总酚的含量。
结果见图1。结果分析表明，水相的总酚含量最高，乙酸乙脂/无水乙醚相的总酚含量次之，正己烷相最小，根据calliste的研究成果：水相中含有的酚类物质为多酚的多聚体，而正己烷相及乙酸乙酯/无水乙醚相则为多酚的低聚体和单体。因此，荔枝皮总酚提取物主要以多酚的多聚体为主，其次是低聚体和单体，其中多聚体多酚约为79％。
实施例5
1.实验试剂及仪器
实验所用酪氨酸酶(25ku/mg)购自sigama公司，l-酪氨酸、l-多巴、购自aldrich公司，其它试剂均为国产分析纯。
rt-9100型半自动生化分析仪：深圳雷杜生命科学股份有限公司；tgl-16r型高速冷冻离心机：珠海黑马医学仪器有限公司；mettlerat200电子天平：梅特乐-托利多仪器上海有限公司。
2.实验方法
酪氨酸酶的单酚酶活力测定是以l-酪氨酸为底物(最终浓度为0.5mmol/l)，而二酚酶活力的测定则以l-多巴为底物最终浓度为0.5mmol/l)。测定单酚酶和二酚酶的活力时，酶的最终浓度分别为25μg/ml和5μg/ml。l-酪氨酸溶液、l-多巴溶液、酪氨酸酶溶液及荔枝皮总酚提取物样品溶液均以50mmol/l的磷酸缓冲液(ph＝6.8)配制。试管中首先加入l-酪氨酸(或者l-多巴)及荔枝皮总酚(或者磷酸缓冲液)，充分混匀，37℃水浴10min，然后加入酪氨酸酶溶液，迅速混匀，37℃水浴5min，立即在475nm处测定吸光度值。
3.实验结果
荔枝皮总酚提取物对酪氨酸酶单酚酶的抑制作用如表1所示。荔枝皮总酚提取物对酪氨酸酶二酚酶的抑制作用表2所示。
表1荔枝皮总酚提取物对酪氨酸酶单酚酶的抑制作用
根据spss软件计算ic50：第一次实验ic50＝0.272μg/ml；第二次实验ic50＝0.534μg/ml；第三次实验ic50＝0.307μg/ml；所以荔枝皮总酚提取物对酪氨酸酶单酚酶的ic50＝0.37±0.14μg/ml。
表2荔枝皮总酚提取物对酪氨酸酶二酚酶的抑制作用
根据spss软件计算ic50：第一次实验ic50＝0.382μg/ml；第二次实验ic50＝0.371μg/ml；第三次实验ic50＝0.289μg/ml；所以荔枝皮总酚提取物对酪氨酸酶单酚酶的ic50＝0.347±0.051μg/ml。
对比例1
按照现有技术公开的方案制备荔枝壳提取物，具体方案见参考文献(荔枝壳提取物对酪氨酸酶的抑制作用,王庆华,日用化学工业,2010年2月第40卷第1期，31～35.)。根据上述公开的提取方法制备得到荔枝皮提取物。
对比例2
将对比例1制备的荔枝皮提取物进行分离纯化，具体将所述荔枝皮提取物，加浓盐酸调ph3.0～4.0，静置后滤去杂质，在40℃调ph值至2.0，保温，静置2h，过滤，沉淀用水洗至ph值为中性，干燥沉淀，即得。
采用folin-酚比色法进行测定，测得多酚含量为60.1％。
对比例3
将对比例1制备的荔枝皮提取物进行分离纯化，具体将所述荔枝皮提取物，取上述待纯化样品溶液，上sephadexlh-20柱层析(0～100％甲醇，20％为一个梯度)进行梯度洗脱，经硅胶薄层层析跟踪检测，合并相近流份，50℃以下旋转蒸发仪真空减压浓缩至干，即得。
采用folin-酚比色法进行测定，测得多酚含量为73.5％。
对比例4
将对比例1制备的荔枝皮提取物和对比例2制备的精制荔枝皮提取物按照实施例5的方法测定提取物对酪氨酸酶单酚酶和酪氨酸酶二酚酶的抑制实验。
测定结果如表3和表4所示。
表3荔枝皮总酚提取物对酪氨酸酶单酚酶的抑制作用
根据spss软件计算ic50：第一次实验ic50＝5.16μg/ml；第二次实验ic50＝5.90μg/ml；第三次实验ic50＝4.07μg/ml；所以荔枝皮总酚提取物对酪氨酸酶单酚酶的ic50＝5.04±0.92μg/ml。
荔枝皮提取物对酪氨酸酶单酚酶的抑制浓度，其ic50＝5.04±0.92μg/ml；而本发明制备的提取物对酪氨酸酶单酚酶的抑制浓度为ic50＝0.37±0.14μg/ml；本发明提供了提取物对酪氨酸酶单酚酶的抑制活性提高了13.62倍。
表4荔枝皮总酚提取物对酪氨酸酶二酚酶的抑制作用
根据spss软件计算ic50：第一次实验ic50＝9.81μg/ml；第二次实验ic50＝8.09μg/ml；第三次实验ic50＝11.28μg/ml；所以荔枝皮总酚提取物对酪氨酸酶二酚酶的ic50＝9.73±1.60μg/ml。
由上述实施例可知，荔枝皮提取物对酪氨酸酶二酚酶的抑制浓度，其ic50＝9.73±1.60μg/ml；而本发明制备的提取物对酪氨酸酶二酚酶的抑制浓度为ic50＝0.347±0.051μg/ml；本发明提供了提取物对酪氨酸酶二酚酶的抑制活性提高了28.04倍。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。