一种微孔隙脱细胞猪主动脉基质的制作方法

本发明涉及组织工程领域，具体涉及一种微孔隙脱细胞猪主动脉基质。

背景技术

以主动脉瘤、血管夹层、动脉粥样硬化为代表的血管性疾病不仅是发达国家，还是发展中国家的首要致死性病变之一。外科手术置换病变血管是血管性疾病治疗的最终手段，因而需要各种血管置换材料。另外，随着食管癌发病率的逐年增高，人工食管置换材料的需求也越来越多。

同种组织置换虽然是理想的置换材料，但来源少、存在伦理学限制。而当前随着生物科技的发展，现已研发出多种高分子生物合成材料作为人工组织置换材料。例如，pet(polyethyleneterephthalate,dacron)和eptfe(expandedpolytetra-fluoroethylene)、聚氨酯(polyurethane)因其具有较好的生物力学性能和体内相容性而广泛应用于心血管外科手术。但是合成材料在临床应用时也有局限性，例如合成生物材料与天然组织不匹配是导致移植失败的重要因素，增加患者死亡率。另外，持续的慢性炎症反应所导致的移植组织内膜增生、慢性感染等风险增加了移植后期衰败的发生率。

因此，研发一种在组织结构和功能上和正常主动脉、食管相类似的替代物至关重要。基于此原因，脱细胞猪主动脉因其在大体、显微镜下以及生理功能上类似于人主动脉而受到越来越多的关注。并且，有研究表面猪主动脉在功能上也可以代替食管。

脱细胞是组织工程研究中降低移植组织免疫原性、保留移植物三维组织结构、生物力学性能、生物活性的重要方法，并且，脱细胞方法已成功应用于心脏瓣膜、前列腺、角膜、跟腱等组织工程研究中。现有技术一般使用去污剂来处理猪主动脉从而实现脱细胞的目的，虽然这种方法能取得良好的脱细胞效果，但是通过这种方法得到的脱细胞猪主动脉基质往往残存毒性，并且其生物力学性能也遭到了破坏。此外，大量研究表明脱细胞的猪主动脉的细胞外基质结构致密，因此，应用于宿主体内时细胞很难内生性生长，在宿主体内重塑效果不佳。

技术实现要素：

本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种微孔隙脱细胞猪主动脉基质。

本发明提供了一种微孔隙脱细胞猪主动脉基质，具有这样的特征：微孔隙脱细胞猪主动脉基质具有微孔结构，微孔结构的微孔的形状为圆形或椭圆形，其中，微孔隙脱细胞猪主动脉基质是通过将猪主动脉在真空条件下置于低浓度去污剂缓冲液中进行多次冻融后再依次在低浓度去污剂缓冲液、无菌去离子水以及磷酸盐溶液中进行震荡清洗后得到的。

在本发明提供的微孔隙脱细胞猪主动脉基质中，还可以具有这样的特征：其中，微孔大小不一，微孔的直径最大可达70μm。

在本发明提供的微孔隙脱细胞猪主动脉基质中，还可以具有这样的特征：其中，低浓度去污剂缓冲液包括tris缓冲液、十二烷基硫酸钠以及脱氧胆酸钠，tris缓冲液的浓度范围为8～12mmol/l，ph值为7.4～7.8，十二烷基硫酸钠在tris缓冲液的体积分数范围为0.1％～0.5％w/v，脱氧胆酸钠在tris缓冲液的体积分数范围为0～0.8％w/v。

在本发明提供的微孔隙脱细胞猪主动脉基质中，还可以具有这样的特征：其中，将猪主动脉在真空条件下置于低浓度去污剂缓冲液中进行2～10次冻融，每次冻融的冷冻时间为2～6h。

在本发明提供的微孔隙脱细胞猪主动脉基质中，还可以具有这样的特征：其中，经过冻融后的猪主动脉瓣在低浓度去污剂缓冲液中进行震荡处理需要在30～50℃摇床中震荡处理28～96h。

在本发明提供的微孔隙脱细胞猪主动脉基质中，还可以具有这样的特征：其中，对猪主动脉用无菌去离子水震荡清洗12～48h。

在本发明提供的微孔隙脱细胞猪主动脉基质中，还可以具有这样的特征：其中，对猪主动脉用磷酸盐溶液震荡清洗48～96h。

发明的作用与效果

根据本发明所涉及的微孔隙脱细胞猪主动脉基质，因为具有微孔结构，微孔结构的微孔的形状为圆形或椭圆形，微孔直径大小不一，最大直径可达70μm，这样的微孔结构能够促进去污剂侵入组织内部去除细胞，进而能够减少去污剂的使用浓度，有效保留猪主动脉组织的三维结构及生物力学性能，并且显著降低去污剂的残留毒性。此外，这样的微孔结构能够促进纤维母细胞和血管内皮细胞浸润性生长，从而促进血管与胶原新生，使得微孔隙脱细胞猪主动脉基质在宿主体内具有很好的重塑性。因此，微孔隙脱细胞猪主动脉基质非常适用于血管、食管等临床组织工程移植。

另外，由于本制备方法是以猪主动脉为研究对象，因此，本制备方法的成本低廉，节省了数亿元的宝贵的医疗资源，为组织工程血管、食管的临床应用及脱细胞基质的优化研发提供了实验依据和指针。

附图说明

图1是本发明的实施例中猪主动脉和微孔隙脱细胞猪主动脉基质的示意图；

图2是本发明的实施例中猪主动脉和微孔隙脱细胞猪主动脉基质的扫描电镜示意图；以及

图3是本发明的实施例中猪主动脉和微孔隙脱细胞猪主动脉基质的组织学示意图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例结合附图对本发明微孔隙脱细胞猪主动脉基质作具体阐述。

图1是本发明的实施例中猪主动脉和微孔隙脱细胞猪主动脉基质的示意图。

图2是本发明的实施例中猪主动脉和微孔隙脱细胞猪主动脉基质的扫描电镜示意图。

图3是本发明的实施例中猪主动脉和微孔隙脱细胞猪主动脉基质的组织学示意图。

如图1～3所示，图1(a)、图2(a)、图3(a)表示正常的猪主动脉，图1(b)、图2(b)、图3(b)表示微孔隙脱细胞猪主动脉基质。如图1～3所示，本实施例中的微孔隙脱细胞猪主动脉基质具有连续的微孔结构。微孔结构的微孔的形状为圆形或椭圆形微孔直径大小不一，最大直径可达70μm。微孔隙脱细胞猪主动脉基质不含细胞以及细胞碎片。

本实施例中的微孔隙脱细胞猪主动脉基质的制备过程如下：

步骤一，在真空条件下，将猪主动脉置于低浓度去污剂缓冲液中冷冻2～6h，低浓度去污剂缓冲液包括：tris缓冲液、十二烷基硫酸钠以及脱氧胆酸钠。tris缓冲液的浓度范围为8～12mmol/l，ph值为7.4～7.8，十二烷基硫酸钠在tris缓冲液的体积分数范围为0.1％～0.5％w/v，脱氧胆酸钠在tris缓冲液的体积分数范围为0～0.8％w/v。在本实施例中，缓冲液、十二烷基硫酸钠以及脱氧胆酸钠的配比为：tris缓冲液的浓度为10mmol/l、ph为7.6，每100ml的tris缓冲液中加入0.1～0.4g十二烷基硫酸钠和0.1～0.5g的脱氧胆酸钠。猪主动脉在低浓度去污剂缓冲液中的冷冻时间为4～5h。

步骤二，冷冻结束后，将冷冻后的猪主动脉放置在温度为30～50℃的水浴中溶解。

步骤三，重复步骤一与步骤二1～10次，将猪主动脉进行多次冻融。

步骤四，将多次冻融后的猪主动脉从低浓度去污剂缓冲液中取出，然后放置于去污剂缓冲液中，并在30～50℃摇床中处理震荡28～96h。

步骤五，用无菌去离子水对震荡后的猪主动脉震荡清洗12～48h。在本实施例中，无菌去离子水对猪主动脉的震荡清洗时间为24～36h，优选震荡时间为24h。

步骤六，用磷酸盐溶液对无菌去离子水清洗后的猪主动脉震荡清洗48～96h后，得到猪主动脉细胞的脱细胞基质，即微孔隙脱细胞猪主动脉基质。在本实施例中，磷酸盐溶液对猪主动脉的震荡清洗时间为72h。

以本实施例中的微孔隙脱细胞猪主动脉基质为实验组，以正常的猪主动脉(tris缓冲液同步处理)为对照组，进行结构以及性能测定，其得到的结果如下：

(一)微孔隙脱细胞猪主动脉基质不含细胞以及细胞碎片

dna定量检测结果为：对照组的dna含量为1254.2±263.9ng/mg湿重组织；实验组的dna含量为497.5±323.6ng/mg湿重组织。实验组中的dna含量明显低于对照组(p<0.05)，说明微孔隙脱细胞猪主动脉基质dna含量显著降低，该结果与图3所示的结果完全一致，即正常的猪主动脉内含有很多细胞，而微孔隙脱细胞猪主动脉基质不含有细胞及细胞碎片。

(二)微孔隙脱细胞猪主动脉基质具有连续的微孔结构

扫面电镜结果如图2所示，对照组的组织结构十分紧密，实验组呈疏松海绵状，具有连续的微孔结构。

(三)微孔隙脱细胞猪主动脉基质能保持猪主动脉生物力学性能和三维结构

生物力学性能检测结果如表1所示：

表1

如表1所示，长轴生物力学分析表明：与对照组相比，实验组的最大载荷、最大应力以及弹性模量均无明显统计学意义的改变(p>0.05)。

横轴生物力学分析表明，与对照组相比，实验组的最大载荷、最大应力以及弹性模量上升。

(四)微孔隙脱细胞猪主动脉基质无细胞毒性

抽提细胞毒性检测表明，与对照组相比，实验组能显著促进脐静脉内皮细胞和间充质干细胞的生长。实验组脐静脉内皮细胞的生长能力是正常培养基细胞生长能力的1.5±0.1倍，而对照组细胞的生长能力仅为正常培养基细胞生长能力的0.2±0.1倍。实验组间充质干细胞的生长能力是正常培养基细胞生长能力的1.1±0.1倍，而对照组细胞的生长能力仅为正常培养基细胞生长能力的0.5±0.1倍。实验组和对照组相比具有明显的统计学意义(p<0.05)。

接触细胞毒性检测表明，与对照组共培养的细胞相比，实验组共培养的脐静脉内皮细胞和间充质干细胞的生长状况良好。

(五)体内，微孔隙脱细胞猪主动脉基质的钙化及炎症反应轻

分别将对照组和实验组进行大鼠皮下包埋，在特定时间点取出检测钙化及炎症反应。

钙化结果表明：在第28天，对照组的钙化最为严重，钙盐沉积量为71.2±15.9/单位；实验组的钙化程度显著轻于对照组，为19.2±5.4/单位，两者相比具有明显的统计学意义(p<0.05)。

炎症反应结果表明：对照组主要导致cd4和cd8为主的慢性t淋巴细胞浸润；实验组急性炎症反应轻、消失早，并且t淋巴细胞浸润程度低于对照组。第28天，对照组中的cd4和cd8细胞的数量分别为106.0±20.5个/高倍镜视野、109.3±14.3个/高倍镜视野；而实验组中的cd4和cd8细胞的数量则分别为61.2±13.4个/高倍镜视野、57.8±30.8个/高倍镜视野。实验组和对照组相比具有明显的统计学意义(p<0.05)。

(六)体内，微孔隙脱细胞猪主动脉基质的血管和组织重塑显著

分别将对照组和实验组进行大鼠皮下包埋，在特定时间点取出后进行苏木素伊红(he)、免疫组织化学染色以及胶原染色检测。

he和免疫组织化学染色结果表明：28天时，对照组的猪主动脉中肌纤维母细胞只在移植动脉周围浸润，动脉中央无细胞；实验组的微孔隙脱细胞猪主动脉基质中肌纤维母细胞均匀分布于动脉各层，移植动脉外周及中央区肌纤维母细胞数目分别为127.5±20.3个/高倍镜视野、89.7±15.0个/高倍镜视野。

肌纤维母细胞是分泌胶原的重要细胞，与肌纤维母细胞分布一致，胶原染色表明：对照组只在移植动脉周围有新胶原形成，动脉中央无新胶原形成；实验组在动脉周围及中央区域均有新生胶原形成。

免疫组织化学结果表明：28天时，对照组中新生血管只在移植动脉周围浸润，动脉中央无血管；实验组中新生血管均匀分布于动脉各层，移植动脉外周及中央区血管数目分别为48.3±8.2个/高倍镜视野、39.3±11.9个/高倍镜视野。

实施例的作用与效果

根据本发明所涉及的微孔隙脱细胞猪主动脉基质，因为具有微孔结构，微孔结构的微孔的形状为圆形或椭圆形，微孔直径大小不一，最大直径可达70μm，这样的微孔结构能够促进去污剂侵入组织内部去除细胞，进而能够减少去污剂的使用浓度，有效保留猪主动脉组织的三维结构及生物力学性能，并且显著降低去污剂的残留毒性。此外，这样的微孔结构能够促进纤维母细胞和血管内皮细胞浸润性生长，从而促进血管与胶原新生，使得微孔隙脱细胞猪主动脉基质在宿主体内具有很好的重塑性。因此，微孔隙脱细胞猪主动脉基质非常适用于血管、食管等临床组织工程移植。

另外，由于本制备方法是以猪主动脉为研究对象，因此，本制备方法的成本低廉，节省了数亿元的宝贵的医疗资源，为组织工程血管、食管的临床应用及脱细胞基质的优化研发提供了实验依据和指针。

此外，在上述实施例中，因为制备微孔隙脱细胞猪主动脉基质采用的低浓度去污剂缓冲液为低浓度十二烷基硫酸钠缓冲液，该缓冲液中包括tris缓冲液、十二烷基硫酸钠以及脱氧胆酸钠，所以，可以有效地去除猪主动脉组织的细胞及核材料，降低体内炎症反应和钙盐沉积。

上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。