本发明涉及一种结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂的制备方法，属于医学美容技术领域。
背景技术
皱纹是指皮肤受到外界环境影响，形成游离自由基，自由基破坏正常细胞膜组织内的胶原蛋白、活性物质，氧化细胞而形成的小细纹、皱纹。皱纹的发生归结起来有4个原因：自然老化、地心引力作用、阳光中紫外线照射使皮肤发生光老化与光损伤和面部表情肌过多的收缩。其中面部表情肌过多的收缩产生的皱纹称动力性皱纹，主要表现为眶外侧的鱼尾纹，额头纹和眉间纹、鼻唇沟纹和唇上纹和颈阔肌纹。除皱有许许多多的办法，局部外用各种各样的除皱霜、抗皱霜、防晒霜只能改善外观，它对皱纹的消除不会有较大的作用。医用胶原注射充填术有效，但因为是非自身物质，只能存在几个月就会被机体清除，同时注射后会有一定的过敏反应。
胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，约占胶原纤维固体物的85％，占动物体内蛋白质总量的25％～30％，它广泛存在于动物的结缔组织(骨、软骨、皮肤、腱、韧等)中，对机体和脏器起着支持、保护、结合，以及形成界隔等作用。人体皮肤下层也有致密排布的胶原蛋白存在，皮肤的厚度和成分会随着年龄增加而改变，老年人的皮肤很容易受伤，且不易愈合，这很可能是因为上层皮肤成纤维细胞缺失所致，若能刺激这些细胞生长，就有可能恢复皮肤的弹性，同样还能刺激毛囊形成，减少疤痕。通过自体胶原蛋白注射的方式去除皱纹，能够显著减少过敏反应，但是单纯的胶原蛋白注射容易被机体降解，不能根本性的解决皱纹问题，为此，对现有的医用胶原注射填充物进行改进，对提高提高对皱纹的去除效果具有重要意义。
技术实现要素：
为解决现有技术中存在的问题，本发明实施例提供了一种自体胶原蛋白注射剂的制备方法，通过对自体成纤维细胞进行培养后作为注射填充物，再结合肉毒杆菌，实现祛除皱纹的作用。具体技术方案如下：
一种结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，获取自体成纤维组织，在常温下用生理盐水清洗，将自体成纤维组织剪成小块，向其中加入磷酸缓冲盐溶液混合，室温下离心去除下层液体，用磷酸缓冲盐溶液冲洗后再次离心，去除上清液，加入胶原酶，放置于37℃恒温震荡箱中30min～60min，再次离心去除上清液，然后加入含有胎牛血清的dmem培养液，用细胞筛过滤后离心去除上清液，再次加入含有胎牛血清的dmem培养液中，在37℃温度条件下，5％co2恒温培养；
步骤二，传代培养，将步骤一的成纤维细胞每隔2天更换胎牛血清的dmem培养液，待细胞生长至80％融合后用胰蛋白酶消化后传代，在成纤维细胞生长三代以后，从胎牛血清的dmem培养液重取出；
步骤三，胶原蛋白积累，将成纤维细胞放入无血清培养基，在37℃无血清培养基中培养，使成纤维细胞分泌出胶原蛋白；
步骤四，获取注射剂，将成纤维细胞和胶原蛋白从无血清培养基中取出，用磷酸缓冲盐溶液清洗洗去培养基，加入林格氏液、葡萄糖液、肉毒杆菌混合均匀，制成自体胶原蛋白注射剂，4℃保存。
作为上述技术方案的改进，在步骤一中，离心速度为1200rpm～3500rpm，离心时间为2min～5min。
作为上述技术方案的改进，在步骤二中，胰蛋白酶为质量分数为0.25％的胰蛋白酶。
作为上述技术方案的改进，在步骤三中，成纤维细胞在无血清培养基中培养时间为12h～60h。
作为上述技术方案的改进，在步骤四中，每10g成纤维细胞和胶原蛋白中加入林格氏液5ml～20ml、葡萄糖液10ml～30ml、肉毒杆菌5μg～20μg。
作为上述技术方案的改进，在步骤四中，自体胶原蛋白注射剂中还加入有几丁质。
作为上述技术方案的改进，在步骤四中，每10g成纤维细胞和胶原蛋白中加入几丁质0.2g～2g。
作为上述技术方案的改进，在步骤四中，自体胶原蛋白注射剂中还加入有成纤维细胞生长因子。
作为上述技术方案的改进，在步骤四中，每10g成纤维细胞和胶原蛋白中加入成纤维细胞生长因子2mg～10mg。
上述技术方案通过将自体的成纤维细胞分离，通过成纤维细胞分泌出胶原蛋白，在作为自体胶原蛋白注射剂后能够减少人体排异反应，并将肉毒杆菌与自体胶原蛋白注射剂结合，在利用肉毒杆菌造成皱纹的肌肉麻痹，使肌肉不收缩的同时，利用注射剂内的成纤维细胞和其他活性成分，保证机体内组织相容性，提高皱纹祛除效果。
具体实施方式
本发明实施例提供了一种结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，获取自体成纤维组织，在常温下用生理盐水清洗，将自体成纤维组织剪成小块，向其中加入磷酸缓冲盐溶液混合，室温下离心去除下层液体，离心速度为1200rpm～3500rpm，离心时间为2min～5min，用磷酸缓冲盐溶液冲洗后再次离心，去除上清液，加入胶原酶，放置于37℃恒温震荡箱中30min～60min，再次离心去除上清液，然后加入血清含量15％的胎牛血清dmem培养液，用细胞筛过滤后离心去除上清液，再次加入含有胎牛血清的dmem培养液中，在37℃温度条件下，5％co2恒温培养；该步骤中自体成纤维组织可以通过手术从人体皮肤中取出。
步骤二，传代培养，将步骤一的成纤维细胞每隔2天更换胎牛血清的dmem培养液，待细胞生长至80％融合后用胰蛋白酶消化后传代，胰蛋白酶为质量分数为0.25％的胰蛋白酶，在成纤维细胞生长三代以后，从胎牛血清的dmem培养液重取出；该步骤通过体外培养成纤维细胞，使其生长到一定数量；
步骤三，胶原蛋白积累，将成纤维细胞放入无血清培养基，在37℃无血清培养基中培养，成纤维细胞在无血清培养基中培养时间为12h～60h，使成纤维细胞分泌出胶原蛋白，由于胶原蛋白为自体的成纤维细胞产生的，因此作为注射填充物能有效降低排异反应；
步骤四，获取注射剂，将成纤维细胞和胶原蛋白从无血清培养基中取出，用磷酸缓冲盐溶液清洗洗去培养基，加入林格氏液、葡萄糖液、肉毒杆菌混合均匀，制成自体胶原蛋白注射剂，4℃保存；该步骤中林格氏液也称复方氯化钠注射液，是因为林格液除了含有氯化钠成分,还含钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、氯离子及乳酸根离子。林格氏液比生理盐水成分完全，可代替生理盐水使用，以调节体液、电解质及酸碱平衡，乳酸钠林格则适用于酸中毒或有酸中毒倾向的脱水病例，所以手术室经常使用。葡萄糖液能够为细胞提供能量，保证注射剂中的成纤维细胞正常存活。
成纤维细胞胞体较大，胞质弱嗜碱性，胞核较大呈椭圆形，染色质疏松着色浅，核仁明显。电镜下，其胞质可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体，表明它具有合成和分泌蛋白质的功能。成纤维细胞可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质。它合成的前胶原蛋白分子经内切酶作用，聚合和重排，可形成与成骨细胞合成分泌的胶原原纤维一样具有64nm周期横纹的胶原原纤维，胶原原纤维经互相粘合形成胶原纤维。
上述步骤四中，每10g成纤维细胞和胶原蛋白中加入林格氏液5ml～20ml、葡萄糖液10ml～30ml、肉毒杆菌5μg～20μg。肉毒杆菌去除动态皱纹的原理，是将收缩造成皱纹的肌肉麻痹掉，使肌肉不收缩，连带的也去除了皱纹，一般在注射后三、四天就可以看到效果，一周后效果就很明显，效用期约三至六个月，平均四个月。若皱纹再出现，视个人需要，可重复注射。单独使用肉毒杆菌祛除动态皱纹效果并不明显，需要配合其他填充物才能起到良好的除皱效果。
其中，自体胶原蛋白注射剂中还加入有几丁质，每10g成纤维细胞和胶原蛋白中加入几丁质0.2g～2g。几丁质为n-乙酰葡糖胺通过β连接聚合而成的结构同多糖。广泛存在于甲壳类动物的外壳、昆虫的甲壳和真菌的胞壁中，也存在于一些绿藻中，主要是用来作为支撑身体骨架以及对身体起保护的作用。在自体胶原蛋白注射剂中加入几丁质，能够减缓注射到体内后的降解时间，在注射位置的细胞、血管逐步愈合后，几丁质也将逐步被机体分解吸收。
上述方案中自体胶原蛋白注射剂中还加入有成纤维细胞生长因子，每10g成纤维细胞和胶原蛋白中加入成纤维细胞生长因子2mg～10mg，通过成纤维细胞生长因子，为成纤维细胞提供良好的微环境，促进皮肤再生愈合，促进皮肤表皮细胞成熟，增加皮肤弹性，滋润肌肤，消除皱纹和预防色斑，具有很好的美容功效。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例一
采用以下步骤制备结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂：
步骤一，获取自体皮下成纤维组织，在常温下用生理盐水清洗，将自体成纤维组织剪成小块，向其中加入磷酸缓冲盐溶液混合，室温下离心去除下层液体，离心速度为1200rpm，离心时间为5min，用磷酸缓冲盐溶液冲洗后再次离心，去除上清液，加入胶原酶，放置于37℃恒温震荡箱中60min，再次离心去除上清液，然后加入含有胎牛血清的dmem培养液，用细胞筛过滤后离心去除上清液，再次加入含有胎牛血清的dmem培养液中，在37℃温度条件下，5％co2恒温培养；
步骤二，传代培养，将步骤一的成纤维细胞每隔2天更换胎牛血清的dmem培养液，待细胞生长至80％融合后用胰蛋白酶消化后传代，胰蛋白酶为质量分数为0.25％的胰蛋白酶，在成纤维细胞生长三代以后，从胎牛血清的dmem培养液重取出；
步骤三，胶原蛋白积累，将成纤维细胞放入无血清培养基，在37℃无血清培养基中培养20h，使成纤维细胞分泌出胶原蛋白；
步骤四，获取注射剂，将成纤维细胞和胶原蛋白从无血清培养基中取出，取成纤维细胞和胶原蛋白5g，用磷酸缓冲盐溶液清洗洗去培养基，加入林格氏液4ml、葡萄糖液7ml、肉毒杆菌4μg、几丁质0.1g混合均匀，制成自体胶原蛋白注射剂，4℃保存。
实施例二
采用以下步骤制备结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂：
步骤一，获取自体皮下成纤维组织，在常温下用生理盐水清洗，将自体成纤维组织剪成小块，向其中加入磷酸缓冲盐溶液混合，室温下离心去除下层液体，离心速度为1400rpm，离心时间为2min，用磷酸缓冲盐溶液冲洗后再次离心，去除上清液，加入胶原酶，放置于37℃恒温震荡箱中60min，再次离心去除上清液，然后加入含有胎牛血清的dmem培养液，用细胞筛过滤后离心去除上清液，再次加入含有胎牛血清的dmem培养液中，在37℃温度条件下，5％co2恒温培养；
步骤二，传代培养，将步骤一的成纤维细胞每隔2天更换胎牛血清的dmem培养液，待细胞生长至80％融合后用胰蛋白酶消化后传代，胰蛋白酶为质量分数为0.25％的胰蛋白酶，在成纤维细胞生长三代以后，从胎牛血清的dmem培养液重取出；
步骤三，胶原蛋白积累，将成纤维细胞放入无血清培养基，在37℃无血清培养基中培养20h，使成纤维细胞分泌出胶原蛋白；
步骤四，获取注射剂，将成纤维细胞和胶原蛋白从无血清培养基中取出，取成纤维细胞和胶原蛋白5g，用磷酸缓冲盐溶液清洗洗去培养基，加入林格氏液5ml、葡萄糖液10ml、肉毒杆菌4μg、几丁质0.2g混合均匀，制成自体胶原蛋白注射剂，4℃保存。
实施例三
采用以下步骤制备结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂：
步骤一，获取自体皮下成纤维组织，在常温下用生理盐水清洗，将自体成纤维组织剪成小块，向其中加入磷酸缓冲盐溶液混合，室温下离心去除下层液体，离心速度为1400rpm，离心时间为2min，用磷酸缓冲盐溶液冲洗后再次离心，去除上清液，加入胶原酶，放置于37℃恒温震荡箱中50min，再次离心去除上清液，然后加入含有胎牛血清的dmem培养液，用细胞筛过滤后离心去除上清液，再次加入含有胎牛血清的dmem培养液中，在37℃温度条件下，5％co2恒温培养；
步骤二，传代培养，将步骤一的成纤维细胞每隔2天更换胎牛血清的dmem培养液，待细胞生长至80％融合后用胰蛋白酶消化后传代，胰蛋白酶为质量分数为0.25％的胰蛋白酶，在成纤维细胞生长三代以后，从胎牛血清的dmem培养液重取出；
步骤三，胶原蛋白积累，将成纤维细胞放入无血清培养基，在37℃无血清培养基中培养20h，使成纤维细胞分泌出胶原蛋白；
步骤四，获取注射剂，将成纤维细胞和胶原蛋白从无血清培养基中取出，取成纤维细胞和胶原蛋白5g，用磷酸缓冲盐溶液清洗洗去培养基，加入林格氏液8ml、葡萄糖液12ml、肉毒杆菌5μg、几丁质0.5g混合均匀，制成自体胶原蛋白注射剂，4℃保存。
实施例四
采用以下步骤制备结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂：
步骤一，获取自体皮下成纤维组织，在常温下用生理盐水清洗，将自体成纤维组织剪成小块，向其中加入磷酸缓冲盐溶液混合，室温下离心去除下层液体，离心速度为2000rpm，离心时间为2min，用磷酸缓冲盐溶液冲洗后再次离心，去除上清液，加入胶原酶，放置于37℃恒温震荡箱中50min，再次离心去除上清液，然后加入含有胎牛血清的dmem培养液，用细胞筛过滤后离心去除上清液，再次加入含有胎牛血清的dmem培养液中，在37℃温度条件下，5％co2恒温培养；
步骤二，传代培养，将步骤一的成纤维细胞每隔2天更换胎牛血清的dmem培养液，待细胞生长至80％融合后用胰蛋白酶消化后传代，胰蛋白酶为质量分数为0.25％的胰蛋白酶，在成纤维细胞生长三代以后，从胎牛血清的dmem培养液重取出；
步骤三，胶原蛋白积累，将成纤维细胞放入无血清培养基，在37℃无血清培养基中培养20h，使成纤维细胞分泌出胶原蛋白；
步骤四，获取注射剂，将成纤维细胞和胶原蛋白从无血清培养基中取出，取成纤维细胞和胶原蛋白5g，用磷酸缓冲盐溶液清洗洗去培养基，加入林格氏液8ml、葡萄糖液10ml、肉毒杆菌6μg、几丁质0.7g混合均匀，制成自体胶原蛋白注射剂，4℃保存。
实施例五
采用以下步骤制备结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂：
步骤一，获取自体皮下成纤维组织，在常温下用生理盐水清洗，将自体成纤维组织剪成小块，向其中加入磷酸缓冲盐溶液混合，室温下离心去除下层液体，离心速度为2000rpm，离心时间为3min，用磷酸缓冲盐溶液冲洗后再次离心，去除上清液，加入胶原酶，放置于37℃恒温震荡箱中50min，再次离心去除上清液，然后加入含有胎牛血清的dmem培养液，用细胞筛过滤后离心去除上清液，再次加入含有胎牛血清的dmem培养液中，在37℃温度条件下，5％co2恒温培养；
步骤二，传代培养，将步骤一的成纤维细胞每隔2天更换胎牛血清的dmem培养液，待细胞生长至80％融合后用胰蛋白酶消化后传代，胰蛋白酶为质量分数为0.25％的胰蛋白酶，在成纤维细胞生长三代以后，从胎牛血清的dmem培养液重取出；
步骤三，胶原蛋白积累，将成纤维细胞放入无血清培养基，在37℃无血清培养基中培养30h，使成纤维细胞分泌出胶原蛋白；
步骤四，获取注射剂，将成纤维细胞和胶原蛋白从无血清培养基中取出，取成纤维细胞和胶原蛋白5g，用磷酸缓冲盐溶液清洗洗去培养基，加入林格氏液9ml、葡萄糖液12ml、肉毒杆菌6μg、几丁质0.8g混合均匀，制成自体胶原蛋白注射剂，4℃保存。
实施例六
采用以下步骤制备结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂：
步骤一，获取自体皮下成纤维组织，在常温下用生理盐水清洗，将自体成纤维组织剪成小块，向其中加入磷酸缓冲盐溶液混合，室温下离心去除下层液体，离心速度为2000rpm，离心时间为3min，用磷酸缓冲盐溶液冲洗后再次离心，去除上清液，加入胶原酶，放置于37℃恒温震荡箱中50min，再次离心去除上清液，然后加入含有胎牛血清的dmem培养液，用细胞筛过滤后离心去除上清液，再次加入含有胎牛血清的dmem培养液中，在37℃温度条件下，5％co2恒温培养；
步骤二，传代培养，将步骤一的成纤维细胞每隔2天更换胎牛血清的dmem培养液，待细胞生长至80％融合后用胰蛋白酶消化后传代，胰蛋白酶为质量分数为0.25％的胰蛋白酶，在成纤维细胞生长三代以后，从胎牛血清的dmem培养液重取出；
步骤三，胶原蛋白积累，将成纤维细胞放入无血清培养基，在37℃无血清培养基中培养30h，使成纤维细胞分泌出胶原蛋白；
步骤四，获取注射剂，将成纤维细胞和胶原蛋白从无血清培养基中取出，取成纤维细胞和胶原蛋白5g，用磷酸缓冲盐溶液清洗洗去培养基，加入林格氏液10ml、葡萄糖液15ml、肉毒杆菌6μg、几丁质1g混合均匀，制成自体胶原蛋白注射剂，4℃保存。
实施例七
采用以下步骤制备结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂：
步骤一，获取自体皮下成纤维组织，在常温下用生理盐水清洗，将自体成纤维组织剪成小块，向其中加入磷酸缓冲盐溶液混合，室温下离心去除下层液体，离心速度为2000rpm，离心时间为3min，用磷酸缓冲盐溶液冲洗后再次离心，去除上清液，加入胶原酶，放置于37℃恒温震荡箱中50min，再次离心去除上清液，然后加入含有胎牛血清的dmem培养液，用细胞筛过滤后离心去除上清液，再次加入含有胎牛血清的dmem培养液中，在37℃温度条件下，5％co2恒温培养；
步骤二，传代培养，将步骤一的成纤维细胞每隔2天更换胎牛血清的dmem培养液，待细胞生长至80％融合后用胰蛋白酶消化后传代，胰蛋白酶为质量分数为0.25％的胰蛋白酶，在成纤维细胞生长三代以后，从胎牛血清的dmem培养液重取出；
步骤三，胶原蛋白积累，将成纤维细胞放入无血清培养基，在37℃无血清培养基中培养30h，使成纤维细胞分泌出胶原蛋白；
步骤四，获取注射剂，将成纤维细胞和胶原蛋白从无血清培养基中取出，取成纤维细胞和胶原蛋白5g，用磷酸缓冲盐溶液清洗洗去培养基，加入林格氏液10ml、葡萄糖液15ml、肉毒杆菌6μg、几丁质1g、成纤维细胞生长因子1mg混合均匀，制成自体胶原蛋白注射剂，4℃保存。
实施例八
采用以下步骤制备结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂：
步骤一，获取自体皮下成纤维组织，在常温下用生理盐水清洗，将自体成纤维组织剪成小块，向其中加入磷酸缓冲盐溶液混合，室温下离心去除下层液体，离心速度为2000rpm，离心时间为3min，用磷酸缓冲盐溶液冲洗后再次离心，去除上清液，加入胶原酶，放置于37℃恒温震荡箱中50min，再次离心去除上清液，然后加入含有胎牛血清的dmem培养液，用细胞筛过滤后离心去除上清液，再次加入含有胎牛血清的dmem培养液中，在37℃温度条件下，5％co2恒温培养；
步骤二，传代培养，将步骤一的成纤维细胞每隔2天更换胎牛血清的dmem培养液，待细胞生长至80％融合后用胰蛋白酶消化后传代，胰蛋白酶为质量分数为0.25％的胰蛋白酶，在成纤维细胞生长三代以后，从胎牛血清的dmem培养液重取出；
步骤三，胶原蛋白积累，将成纤维细胞放入无血清培养基，在37℃无血清培养基中培养30h，使成纤维细胞分泌出胶原蛋白；
步骤四，获取注射剂，将成纤维细胞和胶原蛋白从无血清培养基中取出，取成纤维细胞和胶原蛋白5g，用磷酸缓冲盐溶液清洗洗去培养基，加入林格氏液10ml、葡萄糖液15ml、肉毒杆菌6μg、几丁质1g、成纤维细胞生长因子5mg混合均匀，制成自体胶原蛋白注射剂，4℃保存。
以上实施例得到的自体胶原蛋白注射剂，其中包含的成纤维细胞仍然具有活性，能够分泌产生胶原蛋白和多种细胞生长因子，为皮肤表皮细胞提供良好的微环境。并且在自体胶原蛋白注射剂中加入了成纤维细胞生长因子，能促进成纤维细胞生长，促进成细胞成熟，增加皮肤弹性，滋润肌肤，消除皱纹和预防色斑，具有很好的美容功效。
在上述实施例中，多组份溶液混合在没有特别说明的情况下均按照质量百分比进行混合。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明实施例的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。