本发明涉及药剂制备领域，具体涉及利用超临界co2萃取工艺及技术条件获得的枸杞籽油在制备睾丸功能损伤疾病防治产品中的应用。
背景技术：
随着医学科学的进步和发展,老龄人口的比率加大,人口的老龄化将成为一个社会问题,如何延缓衰老成为至关重要的科学问题。衰老是整个机体形态结构和生理机能的全面衰退,是一个动态的、复杂的过程，并且受到生物体外部环境因素和内部环境因素的影响，其中包括自由基和炎症反应的影响。预防和延缓衰老就成为生命科学研究的热点。而睾丸衰老是随着年龄增长,睾丸组织以及支持细胞和间质细胞等逐渐退化，随之导致睾丸内分泌功能和生物学功能等都会不可避免的下降的正常生理现象。在衰老过程中,免疫-神经-内分泌网络起着重要调节作用,而下丘脑-垂体-睾丸轴是其重要组成部分之一,因而研究抗睾丸衰老的药物迫在眉睫，从内外环境角度改善睾丸功能退化现象。
药物防治睾丸衰老的机制学说有自由基学说、代谢学说、免疫系统退化学说、端粒酶变化等,其中睾丸雄激素的分泌功能以及睾丸间质细胞合成和分泌睾酮的能力能够共同解释这些学说的本质。
技术实现要素：
基于睾丸及其组织和细胞的生物学功能和生理功能，本发明人经过了大量的实验研究发现，利用超临界co2萃取工艺及技术条件获得的枸杞籽油具有防治氧化应激或炎症反应诱发的睾丸功能损伤疾病的功能。因此，其可用来制备氧化应激或炎症反应诱发睾丸功能损伤疾病防治产品。
所述枸杞籽油是一种抗氧化，抗炎症的不饱和脂肪酸，枸杞籽油能够保护损伤睾丸组织的结构，保护睾丸生精细胞及支持细胞的形态，能够上调损伤睾丸间质细胞分泌t的能力，增加血清睾酮含量，降低睾丸组织和细胞中线粒体氧化应激损伤，减少睾丸组织和细胞的凋亡，对自然衰老雄性大鼠的氧化应激和慢性应激雄性大鼠的炎症引起的内分泌功能障碍和睾丸损伤具有显著的保护作用，同时对睾丸生物学功能有极大的保护作用。
附图说明
图1为枸杞籽油含药血清高效液相色谱法测定结果及分析数据图；
图中：a.枸杞籽油大鼠灌胃5次后2h内取含药血清hplc-dad色谱图；
b.枸杞籽油治疗30天后血清hplc-dad色谱图；
c.枸杞籽油各个成分hplc-dad检测分析。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
枸杞籽油的萃取制备
利用超临界流体萃取装置，基于萃取器微分单元及固态原料颗粒微分单元质量守恒原理，确定枸杞籽的最佳萃取压力、萃取温度、枸杞籽颗粒度以及co2流量等工艺和技术条件，分别是25-30mpa、318-323k、40-50目、0.3-0.4m3/h。在此最佳工艺和技术条件下，枸杞籽油的萃取率最高，可以达到15.00％左右。枸杞籽油的分析及鉴定
枸杞籽油中的类胡萝卜素组成根据abdel-aal等的方法稍加调整用agilent1100系列hplc液相色谱进行定性、定量分析，使用dad检测器，20μl微量进样器。液相色谱分析柱为c30ymccarotenoid柱(250×4.6mm,5μm)(waters,mississauga,on)。流动相为甲醇-mtbe-水(a,81:15:4,v/v/v)和mtbe-甲醇(b,90:10,v/v)。梯度洗脱条件为：0-60min，100％a-0％a；60-65min，0％a-100％a。洗脱流速为1ml/min，柱温35℃，进样量10μl，检测波长为450nm。类胡萝卜素各组成成分的定量根据相应的全反式标准品的标准曲线进行计算。枸杞籽油含药血清高效液相色谱法(hplc-dad)测定色谱图如图1所示，图中a为枸杞籽油大鼠灌胃5次后2h内取含药血清hplc-dad色谱图；b为枸杞籽油治疗30天后血清hplc-dad色谱图；c为枸杞籽油各个成分hplc-dad检测分析。
hplc-dad色谱图和hplc-dad检测分析结果说明枸杞籽油在体内和体外的有效成分相似或一样，能够达到体内体外防治睾丸功能损伤的效果。
各组睾丸组织he染色分析
各组睾丸组织学经多聚甲醛固定液浸泡固定3～5d，并于浸泡第二天将睾丸切开，放回固定液继续浸泡。病理制片按照常规70％、80％、90％及无水乙醇逐级脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋，4μm厚切片，进行he染色(苏木素－伊红染色)，在光学显微镜下观察睾丸间质细胞，生精小管，各级生精细胞及支持细胞的形态学变化；结果显示：对照组的间质细胞形态正常，清晰可见，生精小管基膜连续、完整，各级生精细胞形态正常，排列规则，支持细胞形态典型。损伤组的间质细胞仍可见，生精小管基膜开始出现断裂，各级生精细胞仍可见连接间隙变宽。枸杞籽油治疗组大鼠睾丸生精小管正常，精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞排列有序，之间连接间隙变窄。
石蜡切片免疫组化染色分析各组睾丸组织氧化应激指标
石蜡切片免疫组化染色按照试剂盒说明书操作。将各组睾丸组织冲洗干净，脱水、包埋、连续切片，片厚5μm。石蜡切片脱蜡至水。3％h2o2室温孵育10min，pbs冲洗5min×3次。滴加适当比例稀释的sirt3抗体，37℃孵育2h，pbs冲洗5min×3次。25℃孵育2h，4℃过夜，pbs洗2min×3次；滴加生物素标记羊抗兔igg，室温下20min，pbs洗2min×3次；滴加sabc复合物，室温20℃，pbs洗5min×4次。dab显色10min左右，蒸馏水多次洗涤，苏木素轻度复染，脱水，透明，中性树胶封片，显微镜下观察。阴性对照不加一抗，以正常山羊血清和pbs代替sirt3抗体作孵育。结果显示：线粒体内主要的去乙酰化酶sirt3蛋白在各组睾丸支持细胞和间质细胞中均有表达，sirt3在各组睾丸支持细胞和间质细胞的细胞浆中表达，sirt3在细胞核和细胞浆中均有表达。空白对照组、损伤模型组和枸杞籽油治疗组相比较，sirt3阳性表达率及阳性评分均数差异均有统计学意义(p<0.05)。而枸杞籽油治疗组与空白对照组之间差异无统计学意义(p<0.05)。同时发现：sirt3在自然衰老和慢性应激损伤中并不完全是位于线粒体中，部分是从线粒体移至细胞浆中的，在损伤模型组中细胞浆表达较多，细胞核棕色显色较少，细胞浆棕色显色相对较多。在正常空白对照组和枸杞籽油治疗组线粒体表达较多，细胞核棕色显色较多。
tunel检测损伤模型大鼠和枸杞籽油治疗后睾丸支持细胞和间质细胞凋亡
睾丸标本组织切片脱蜡至水化，具体染色方法:每组切37℃，蛋白酶k消化15min，30ml/lh2o2，25℃，5min；bsa(100mg/l)封闭30min，柠檬酸缓冲液浸泡后放入微波炉以高火加热5min，共3次，自然冷却后pbs冲洗5min×3次，bsa(100mg/l)封闭30min，加入0.75ultdt酶、8μlbr-dutp、32.25μlddh2o配置成混合液(dna末端转移酶与地高辛标记的脱氧核苷酸混合液)，置湿盒内，37℃30min，然后与anti-brdu荧光染色液混合，室温孵育0.5h，pbs冲洗5min×3次；荧光显微镜下dapi复染后、荧光显微镜下观察拍照。结果显示：慢性应激对雄性大鼠睾丸损伤的支持细胞和间质细胞tunel检测阳性细胞(绿色荧光数目表示)显著。这也提示：慢性应激促进支持细胞和间质细胞凋亡。经过枸杞籽油治疗后tunel检测阳性细胞数目显著性下降。
westernblot检测各组睾丸组织凋亡的表达水平
将组织从-80℃冰箱中取出，并准备液氮及研磨工具，将研磨过的卵巢组织装入1.5ml离心管内并称重，加入增强型ripa与pmsf混合液(两者比例100∶1)，加入混合液的量与组织的比重为5∶1，放入4℃高速离心机下13000r/min离心30min，取上清，即为所提取之大鼠睾丸组织总蛋白。bca法蛋白定量，调整使各样品总蛋白含量一致，采用5倍上样缓冲液蛋白变性，5％浓缩胶及10％分离胶sds-page凝胶电泳，pvdf膜转印，5％tbst脱脂奶粉封闭2小时，加入bcl-2、bax和caspase-3抗体(工作浓度1∶400)4℃孵育过夜；洗涤后加入相应辣根过氧化酶标记的ⅱ抗(工作浓度1∶10000)，37℃孵育2h；ecl法显色，胶片压片。采用photoshop图像分析软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin作为内参照蛋白进行校准，采用目标蛋白条带灰度值β-actin来表示蛋白相对表达水平。
根据人体口服推荐剂量为每日3.0g，故设低、中、高剂量分别为0.25、0.50、1.50g/kg.大鼠体重，即取枸杞籽油混合物2.50g-5.00g、5.00g-10.00g、15.00g-20.00g加cmc-na定容至100ml，按0.1ml/10g.大鼠体重的剂量给大鼠灌胃，以剂量2.50g-15.00g为最佳剂量使用。经验证：按照剂量2.50g-15.00g灌胃，可改善损伤模型大鼠睾丸的线粒体水平；按照剂量2.50g-15.00g灌胃，可改善损伤模型大鼠血清氧化应激水平；按照剂量2.50g-15.00g灌胃，可改善损伤模型大鼠睾丸组织的形态学水平；按照剂量2.50g-15.00g灌胃，可改善损伤模型大鼠睾丸组织的凋亡水平。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。